专利汇可以提供毛囊干细胞再生肽纳米微脂囊的备制及其应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种毛囊干细胞再生肽微脂囊的备制及其应用,毛囊干细胞再生肽(kGF)复合纳米微脂囊的纳米脂质载体技术(NLC),利用逆相 蒸发 - 冷冻干燥 法制备毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊,用酶联 免疫 吸附 法(ELISA)测定毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊的含量,电镜观察其形态,并考察其包封率或载药量、 变形 性及 稳定性 ,成为透皮转运的有效载体,微脂囊的粒径为81.62±3.67纳米;毛囊干细胞再生肽复合物主要由毛囊干细胞活性因子、番茄红素油 树脂 、薰衣草精油和 牛 至精油复合而成,至少含上述两种成分的化合物。毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊基于纳米定向 皮肤 渗透 技术,实现将干细胞毛囊干细胞再生肽等活性成份快速渗透至皮肤基底层,达到显著的毛发再生效果,具有提高毛囊干细胞再生肽复合物活性成份稳定性、延长其作用时间、增强皮肤细胞抗 氧 化作用、调节人体 激素 分泌 水 平, 治疗 、减少皮肤因 炎症 、激素分泌失衡所致的毛囊损害。利用其无毒安全、容易实现工业化生产等优点,实现一种因多种原因引起的脱发美容 生物 制品。,下面是毛囊干细胞再生肽纳米微脂囊的备制及其应用专利的具体信息内容。
1.毛囊干细胞再生肽纳米微脂囊的备制及其应用,其特征在于,利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备;毛囊干细胞再生肽复合柔性纳米微脂囊,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)的毛囊干细胞再生肽复合含量,电镜观察其形态,并考察其包封率或载药量、变形性及稳定性。毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊为多室脂质体。所述的微脂囊其平均粒径为(81.62±
3.67)nm,Zeta电位为(60.12±7.58)mV平均包封率为(37.86±4.77)%;平均载药量为(6.58±1.27)%。毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊柔性纳米脂质体具有较高的稳定性。
含量测定方法简单、可靠,稳定性和变形性高,可能成为透皮转运的有效载体。所述的毛囊再生肽复合物至少有以下两种成分组成:毛囊干细胞再生肽、番茄红素、薰衣草精油和牛至精油复合而成:
毛囊干细胞再生肽10μg/L 10~30份、薰衣草精油5~15份、亚麻籽油番茄红素5~15份、牛至精油5~15份。
2.根据权利要求1所述的毛囊干细胞再生肽复合纳米微脂囊,其特征在于,毛囊再生肽复合物由以下质量份的物质复合而成:
毛囊干细胞再生肽35份、薰衣草精油10份、番茄红素油10份和牛至精油10份。
3.根据权利要求1~2中任一项所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊,其特征在于,所述的微脂囊的包覆率为80.0~90.0%,载药量为20.0~25.0%。
4.权利要求3所述的毛囊再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征包括以下步骤:
(1)取新鲜人头皮毛囊外根鞘隆突部干细胞-培养-鉴定-提纯-获取10μg/L毛囊干细胞再生肽;亚麻籽油番茄红素树脂:22%番茄固体物按1:1用微波萃取法制成570mg/L番茄红素的亚麻籽番茄油;
(2)新鲜薰衣草花草若干,用蒸馏方法提取薰衣草精油;
(3)新鲜牛至花、草若干,用蒸馏方法提取牛至精油;
(4)毛囊再生肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发-冷冻干燥法)制备:精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E,置梨形瓶中,加入适量氯仿(含1%无水乙醇),于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和毛囊干细胞活性肽溶解于4℃磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4)溶液中。脂质溶解后,将PBS溶液倒入脂质溶液中,在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s,停
5s),形成均匀乳液。室温下放置30min。将乳液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07MPa,转速500r/min),形成水相脂质体混悬液后,继续蒸发15min,以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s,停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中,高压均质3次,再通过0.1μm微孔滤膜挤出10次后,-40℃预冻24h后,于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
(5)毛囊干细胞再生肽含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]:分别配制质量浓度为15,
30,50,100,200,300,400,500ng/mL的毛囊干细胞再生肽系列溶液,以0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)破坏脂质膜的空白柔性纳米微脂囊做空白对照,按照ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品,以样品中毛囊干细胞再生肽的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标,采用四参数回归方法进行运算,得回归方程Y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D,以检测样品中毛囊干细胞再生肽的含量。
(6)毛囊再生肽复合物纳米微脂囊分离采用由Fry等提出的Sephadex G-50微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离毛囊再生肽。将Sephadex G-50用适量PBS溶液浸泡24h后装柱,以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS,先用不含毛囊再生肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱,然后向柱中加入0.25mL毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液,离心,收集离心液,微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
(7)观察其形态;柔性纳米微脂囊径1.0%磷钨酸负染,将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍,在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位;包封率(EE)采用以下公式计算:EE(%)=柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中EGF总含量×100%;载药量:取毛囊干细胞再生肽复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中,加入0.2mL10%TritonX-
100,加PBS至刻度,测定总毛囊再生肽复合物量;冻干微脂囊载药量=毛囊干细胞再生肽复合物的量/1mg×100%。本方法所制备的毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(81.62±3.67)nm,Zeta电位为(60.12±7.58)mV,平均包封率为(37.86±4.77)%,平均载药量为(6.58±1.27)%。
(8)变形性测定:取1mL一次性注射器,分别加入1mL蒸馏水、毛囊再生肽复合物柔性纳米微脂囊及毛囊干细胞再生肽复合物普通脂质体,分别外加0.1,0.2,0.3,0.4和0.5MPa压力,计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间,计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比,以测定柔性纳米微脂囊的变形性,相比,毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
(9)稳定性鉴定:取3批毛囊干细胞再生肽微脂囊复合物混悬液、毛囊干细胞再生肽复合物冻干粉及毛囊干细胞再生肽复合物微脂囊冻干粉,分别置室温25℃、4℃条件下,于0,
3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位,并观察外观,以确定其稳定性。
5.根据权利要求4所述的毛囊干细胞再生肽复合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)的本化合物中的毛囊干细胞再生肽:(1)取新鲜人头皮毛囊基底区干细胞培养;(2)新鲜人头皮毛囊外根鞘隆突部干细胞诱导能力鉴定(细胞活性检测、免疫组织化学检测、流式细胞检测分析);(3)通过RT-PCR从毛囊干细胞RNA中扩增出NGF的DNA全场片段,构建拷贝逆转录病毒载体pLXSN-NGF,脂质体转染导入PA317,感染NSCs,获得高度表达的毛囊干细胞再生肽的基因工程干细胞;(4)通过对PC12-T-rkB细胞以及对体外培养的相应区域的毛囊干细胞的影响检测其生物活性,证明该基因工程干细胞可分泌相应的毛囊干细胞再生肽;(5)后再扩增、提取相应的再生因子,获取10μg/L毛囊干细胞再生肽与步骤(2)、(3)、(4)合成化合物。
6.根据权利要求5所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(4)中所述的一种公开方法,毛囊再生肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发-冷冻干燥法)制备:精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E,置梨形瓶中,加入适量氯仿(含1%无水乙醇),于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和毛囊干细胞再生肽溶解于4℃PBS(pH=
7.4)溶液中。脂质溶解后,将PBS溶液倒入脂质溶液中,在水浴式超声仪中(低于10℃)超声
10min(超声10s,停5s),形成均匀乳液。室温下放置30min。将乳液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07MPa,转速500r/min),形成水相脂质体混悬液后,继续蒸发15min,以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10 s,停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中,高压均质3次,再通过0.1μm微孔滤膜挤1次后,-40℃预冻24h后,于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
7.权利要求6所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(5)所述的毛囊干细胞再生肽复合物含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]:使其分别配制质量浓度为15,30,50,100,200,300,400,500ng/mL的毛囊干细胞再生肽复合物系列溶液,以0.2%TritonX-100破坏脂质膜的空白柔性纳米脂质体做空白对照,按照ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品,以样品中毛囊干细胞再生肽复合物的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标,采用四参数回归方法进行运算,得回归方程Y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D,以检测样品中毛囊干细胞再生肽复合物的含量。
8.权利要求7所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(6)所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊分离采用交联葡聚糖-50(SephadexG–
50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离毛囊干细胞再生肽。将Sephadex G-50用适量PBS溶液浸24h后装柱,以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS,先用不含毛囊干细胞再生肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱,然后向柱中加入0.25mL毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液,离心,收集离心液,微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
9.权利要求8所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(7)所述的观察其形态;用柔性纳米微脂囊径1.0%磷钨酸负染,将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍,在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位;包封率(EE)采用以下公式计算:EE(%)=柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中毛囊干细胞活性肽复合物总含量×100%;载药量:取毛囊干细胞再生肽复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中,加入0.2mL10%TritonX-100,加PBS至刻度,测定总毛囊干细胞再生肽复合物量;冻干微脂囊载药量=毛囊再生肽复合物的量/1mg×100%。本方法所制备的毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(81.62±3.67)nm,Zeta电位为(60.12±7.58)mV,平均包封率为78.2~90.0%,载药量可以为20.0~25.0%。
10.权利要求9所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(8)所述的变形性测定:取1mL一次性注射器,分别加入1mL蒸馏水、毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊及毛囊干细胞再生肽复合物普通脂质体,分别外加0.1,0.2,0.3,
0.4和0.5MPa压力,计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间,计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比,以测定柔性纳米微脂囊的变形性,相比,毛囊干细胞再生肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
11.权利要求10所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊的制备方法其特征在于,步骤(9)的稳定性鉴定:取3批毛囊干细胞再生肽微脂囊复合物混悬液、毛囊干细胞再生肽复合物冻干粉及毛囊干细胞再生肽复合物微脂囊冻干粉,分别置室温25℃、4℃条件下,于
0,3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位,并观察外观,以确定其稳定性。
12.权利要求1所述的毛囊干细胞再生肽复合物纳米微脂囊制备毛囊干细胞再生肽在生物制品中的应用。
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