技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物工程技术领域,具体涉及一种用于发酵法生产ε-聚赖氨酸的后提取方法。
背景技术
[0002] ε-聚赖氨酸(ε-PL)是通过链霉菌、丝状
真菌或芽孢杆菌等
微生物发酵合成的一种氨基酸同型
聚合物,它一般由25-35个L-赖氨酸
单体通过α-COOH和ε-NH2脱
水缩合而成,分子量通常为2500-4500D。ε-聚赖氨酸是一种抗菌谱广、生物安全性高、热
稳定性强、pH适用范围宽的新型营养型高附加值食品
防腐剂。
[0003] ε-聚赖氨酸的制备主要包括两部分:微生物发酵、提取与精制。目前ε-聚赖氨酸发酵单位已达到大规模工业化生产的发酵水平,在日本已实现产业化。相比较在发酵水平方面上取得的进步,ε-聚赖氨酸后提取技术并未发生实质性进展,目前已公布的ε-聚赖氨酸分离提取方法,主要包括菌体的固液分离、离子交换
吸附与洗脱、产品脱色等。其中离子交换技术一直是ε-聚赖氨酸提取的核心方法,众所周知,离子交换技术具有产物回收率高、除杂能
力强和操作成熟等优点,但其在活化和再生环节中酸
碱消耗量大、
废水量多的
缺陷却始终无法避免。在ε-聚赖氨酸的生产中,分离提取成本占到总生产成本的70-80%,提取工艺繁琐、收率低、产品纯度低、
费用高一直是限制ε-聚赖氨酸工业化的重要因素。
[0004] 因此,在环保要求越来越高的背景下,革除离子交换工艺,采用
电渗析和多级膜技术,开发一种自动化程度高、产品损失率低、有效降低污染的绿色提取方法,将是该技术领域科研人员亟待解决的问题之一。
发明内容
[0005] 本发明的目的是克服现有ε-聚赖氨酸提取工艺的不足,提供一种利用电渗析技术和膜分离技术从发酵液中提取ε-聚赖氨酸的方法。本发明提供的整个工艺流程流畅,自动化程度高,获得的产品回收率可达80%以上、纯度高达98%以上。用电渗析技术取代传统的离子交换技术后可节约用水60%,吨产品环保成本降低50%。
[0006] 具体的, 本发明的目的可通过如下技术措施来实现:
[0007] 该方法按如下步骤进行:
[0008] (1)发酵液预处理:将含有30g/L以上的ε-聚赖氨酸的发酵液调节pH值至2-6,加热至50-80℃进行热絮凝处理10-60min,以降低发酵液黏度;
[0009] (2)固液分离:将预处理液冷却至20-40℃后,经孔径为100-500nm的陶瓷
膜过滤,控制操作压力为0.01-0.05MPa,除去菌体和絮凝沉降的物质;
[0010] (3)
超滤:将陶滤液压入超滤膜系统,超滤膜的截留分子量为6000-20000D,控制
温度为20-50℃,在操作压力0.1-0.15MPa条件下,将陶滤液中的
水溶性大分子物质和水不溶性小颗粒杂质去除;
[0011] (4)脱色:将收集的超滤透过液调整pH值为2-6,加入0.1-2%的
活性炭,加热至60-90℃,脱色处理0.5-4h除去色素物质,过滤后得脱色液;
[0012] (5)电渗析:采用两室多层式电渗析装置,将脱色液注入淡室进料速度0.5-5L/h,将1-10mM的Na2SO4注入浓室,阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴
阳极液,设备运行
电压为20-60V,处理时间为2-10h;
[0013] (6)纳滤:将解析液压入纳滤膜装置进行循环浓缩,使ε-聚赖氨酸浓度至10-50%,所述纳滤膜采用是卷式膜,截留分子量为200-800D,工作压力可在0.5-0.8MPa,温度为20-50℃;
[0014] (7)干燥:浓缩液经喷雾或减压
冷冻干燥,即得ε-聚赖氨酸产品。
[0015] 本发明所述的发酵液,是利用白色链霉菌(Streptomyces albus)发酵制备得到。
[0016] 其中,所述的发酵培养基包含如下组分(按照g/L计):
葡萄糖20-100,
酵母浸粉50-200,玉米浆2-10, (NH4)2SO41-20, K2HPO4·7H2O 0.5-3,MgSO4·7H2O 0.1-1,ZnSO4·7H2O
0.01-0.1,FeSO4·7H2O 0.01-0.1,用
氨水调pH值为6-7。
[0017] 其中,所述的培养的条件是:
种子液以5-10%的接种量接种于发酵培养基,培养温度为25~40℃,当发酵液pH值降低至4.0-4.5时,利用的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.5之间直至发酵结束,培养时间为72-200h。
[0018] 通过上述方法一般可制得ε-聚赖氨酸含量为大于30g/L的发酵液。
[0019] 本发明的有益效果在于:
[0020] (1)首次将电渗析技术应用于ε-聚赖氨酸的后提取工艺,取代了传统的离子交换技术,酸碱用量减少90%,采用电渗析技术后可节约用水60%,吨产品环保成本降低50%;
[0021] (2)本发明用电渗析取代了传统离子交换工艺后显著降低了人工成本。目前离子交换工艺为人工操作控制,该岗位需要配置人员为5人左右,而采用电渗析技术自动化控制后,人工可降低到2人,该工序吨提取成本降低50%;
[0022] (3)本发明将膜分离技术引入到ε-聚赖氨酸分离提取工艺,应用陶瓷膜代替板框过滤和离心、超滤膜除去可溶性大分子、纳滤代替减压浓缩技术,整个工艺流程流畅,自动化程度高,料液无二次污染;
[0023] (4)本发明提供的ε-聚赖氨酸分离提取方法,所得的ε-聚赖氨酸产品回收率可达80%以上、纯度高达98%以上。
[0024] 具体实施方式:
[0025] 以下
实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的
修改或替换,均属于本发明的范围。
[0026] 实施例1:ε-聚赖氨酸发酵液的制备
[0027] 发酵培养基:葡萄糖60g/L,酵母浸粉80g/L,玉米浆6g/L,(NH4)2SO410g/L,K2HPO4·7H2O 2g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.04g/L,FeSO4·7H2O 0.05g/L,用氨水调pH值为6.8;
[0028] 将白色链霉菌(Streptomyces albus)的种子液,按照8%的接种量接种于发酵培养基,培养温度为30℃,当发酵液pH值降低至4.0时,利用的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.2之间直至发酵结束,发酵时间为170h;
[0029] 通过上述发酵方法制得的发酵液中ε-聚赖氨酸含量为32.5g/L。
[0030] 实施例2:ε-聚赖氨酸的提取
[0031] (1)取10L实施例1制备的发酵液,加10%的HCl调节pH值至4.0,加热至70℃
热处理30min;
[0032] (2)待预处理液冷却至25℃后,进行固液分离,选择孔径为200nm陶瓷膜,控制操作压力在0.03MPa左右,加入2L纯化水冲洗陶瓷膜,获得陶滤液11L;
[0033] (3)将陶滤液压入超滤膜系统,超滤膜的截留分子量为8000D,控制温度为40℃,控制操作压力在0.1MPa,加入2L纯化水冲洗超滤膜,重复冲洗3次,获得超滤透过液15.2L;
[0034] (4)将收集的超滤透过液用10%的NaOH调整pH值为6.0,加入1%的活性炭,加热至70℃,脱色处理2h,过滤后得脱色液15L;
[0035] (5)采用两室多层式电渗析装置,将脱色液注入淡室进料速度5L/h,将2mM的Na2SO4注入浓室,阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液,设备运行电压为20V,处理时间为3h,获得的解析液18L,解析液电导为1200μS/cm;
[0036] (6)将解析液压入纳滤膜装置,纳滤膜截留分子量为200D,控制工作压力不超过0.8MPa,温度不超过30℃,循环浓缩8倍;
[0037] (7)将浓缩液经
喷雾干燥,即得ε-聚赖氨酸产品;
[0038] 按照上述步骤获得的产品经检测,ε-聚赖氨酸纯度为98.5%,收率为83%。
[0039] 实施例3:ε-聚赖氨酸的提取
[0040] (1)取10L实施例1制备的发酵液,加10%的HCl调节pH值至2.0,加热至50℃热处理10min;
[0041] (2)待预处理液冷却至20℃后,进行固液分离,选择孔径为100nm陶瓷膜,控制操作压力在0.05MPa左右,加入4L纯化水冲洗陶瓷膜,获得陶滤液13.5L;
[0042] (3)将陶滤液压入超滤膜系统,超滤膜的截留分子量为20000D,控制温度为30℃,控制操作压力在0.12MPa,加入1L纯化水冲洗超滤膜,重复冲洗3次,获得超滤透过液15.6L;
[0043] (4)将收集的超滤透过液用10%的NaOH调整pH值为4.0,加入0.2%的活性炭,加热至90℃,脱色处理4h,过滤后得脱色液15.4L;
[0044] (5)采用两室多层式电渗析装置,将脱色液注入淡室进料速度2L/h,将5mM的Na2SO4注入浓室,阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液,设备运行电压为40V,处理时间为8h,获得的解析液17L,解析液电导为900μS/cm;
[0045] (6)将解析液压入纳滤膜装置,纳滤膜截留分子量为800D,控制工作压力不超过0.5MPa,温度不超过50℃,循环浓缩15倍;
[0046] (7)将浓缩液经减压冷冻干燥,即得ε-聚赖氨酸产品;
[0047] 按照上述步骤获得的产品经检测,ε-聚赖氨酸纯度为98.2%,收率为81.6%。
[0048] 实施例4:ε-聚赖氨酸的提取
[0049] (1)取10L实施例1制备的发酵液,加10%的NaOH调节pH值至6.0,加热至80℃热处理50min;
[0050] (2)待预处理液冷却至40℃后,进行固液分离,选择孔径为400nm陶瓷膜,控制操作压力在0.01MPa左右,加入3L纯化水冲洗陶瓷膜,获得陶滤液12L;
[0051] (3)将陶滤液压入超滤膜系统,超滤膜的截留分子量为12000D,控制温度为45℃,控制操作压力在0.15MPa,加入4L纯化水冲洗超滤膜,重复冲洗2次,获得超滤透过液18.5L;
[0052] (4)将收集的超滤透过液用10%的HCl调整pH值为2.0,加入2%的活性炭,加热至60℃,脱色处理0.5h,过滤后得脱色液18.3L;
[0053] (5)采用两室多层式电渗析装置,将脱色液注入淡室进料速度4L/h,将10mM的Na2SO4注入浓室,阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液,设备运行电压为60V,处理时间为4.5h,获得的解析液21L,解析液电导为600μS/cm;
[0054] (6)将解析液压入纳滤膜装置,纳滤膜截留分子量为600D,控制工作压力不超过0.6MPa,温度不超过40℃,循环浓缩10倍;
[0055] (7)将浓缩液经喷雾干燥,即得ε-聚赖氨酸产品;
[0056] 按照上述步骤获得的产品经检测,ε-聚赖氨酸纯度为99.0%,收率为80.2%。
[0057] 对照1
[0058] 对实施例1制备的发酵液,采用CN200910152931.2提供的方法进行提取,具体是:
[0059] 用30%HCl调ε-聚赖氨酸发酵液pH为2.0,然后加热至60℃,保温10min,冷却至20℃后经板框过滤,并用30%
盐酸对滤层进行顶洗、板框复滤后得清滤液;
[0060] 用30%NaOH调清滤液pH为9.0。将其压入152
树脂吸附柱(高径比为3:1)中进行吸附,吸附过程应控制一定的流速,同时不断加入NaOH,保证pH值保持为9.0,直到树脂吸附达饱和状态。用纯化水洗涤饱和树脂,至洗涤液体澄清为止。用预先配制的3N的HCl进行解析,控制解析速度,待pH降至3.5时,
解吸结束,得解析液。在解析液中加入4.0%的活性炭,加热升温至60℃,搅拌脱色10分钟,然后冷却至20℃,过滤得脱色液。将脱色液压入膜滤装置(4000分子量的滤膜膜芯)进行循环浓缩,将脱色液浓缩至ε-聚赖氨酸含量在3%时,停止浓缩,得浓缩液。浓缩液经喷雾干燥即得ε-聚赖氨酸产品;
[0061] 按照上述步骤获得的产品经检测,ε-聚赖氨酸纯度为86.8%,收率为68.5%。
[0062] 对照2
[0063] 省略实施例2中的步骤(2),其他条件与实施例2一致,处理实施例1制备的发酵液。结果显示,按照此方法所得ε-聚赖氨酸纯度为92.3%,收率为85.9%。
[0064] 对照3
[0065] 将实施例3中的步骤(5)进行调整,其他处理条件与实施例3一致,处理实施例1制备的发酵液;
[0066] 其中,调整后的步骤(5)具体是:采用两室多层式电渗析装置,将脱色液注入淡室进料速度10L/h,将5mM的Na2SO4注入浓室,阴阳室分别为0.05M的NaOH和H2SO4为阴阳极液,设备运行电压为40V,处理时间为1.5h;
[0067] 结果显示,按照上述步骤获得的产品经检测,ε-聚赖氨酸纯度为93.40%,收率为82.2%。