掌状红皮藻和茉莉的协同提取物、包含该协同提取物的组合物及其用途
阅读：882发布：2023-12-27
专利汇可以提供掌状红皮藻和茉莉的协同提取物、包含该协同提取物的组合物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及掌状红皮藻(Palmaria palmata)和茉莉(jasmine)花头的协同提取物，在对掌状红皮藻进行 水 提取(随后在其中进行茉莉花头的浸渍)之后获得该协同提取物，掌状红皮藻的干重与花头的干重之比为40/60-95/5。本发明还涉及用于获得此种协同提取物的方法以及包含此种提取物作为活性剂的 化妆品 组合物。最后，本发明涉及此类组合物通过促进维持成体真皮干细胞(SKP)的干性特征而用于抵抗 皮肤 老化迹象和用于改善皮肤弹性的化妆品用途。，下面是掌状红皮藻和茉莉的协同提取物、包含该协同提取物的组合物及其用途专利的具体信息内容。
1.藻类掌状红皮藻(Palmaria palmata)和茉莉(Jasminum)属植物的花头的协同提取物，所述提取物通过包括以下步骤的方法获得：
i)制备藻类掌状红皮藻水提取物的步骤；随后
ii)将茉莉属植物的花头浸渍在所述水提取物中的步骤，
所述藻类的干重与所述花头的干重的重量比为40/60-95/5，所述藻类与所述花头均被用作制备所述协同提取物的原料。
2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述藻类的干重与所述花头的干重的重量比为8/1-10/1。
3.如前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于，所述茉莉属植物选自于如下种：
大花茉莉(Jasminum grandiflorum)、素方花(Jasminum officinale)、浓香金茉莉(Jasminum odoratissimum)、重瓣茉莉(Jasminum sambac)、天星茉莉(Jasminum auriculatum)、盈江素馨(Jasminum flexile)，优选为素方花。
4.如前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于，所述花头是完整且干燥的花头。
5.如前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于，在步骤i)中，通过使用糖酶和内切蛋白酶进行酶促水解并随后进行过滤和/或离心来获得所述掌状红皮藻水提取物。
6.如权利要求5所述的提取物，其特征在于，所述糖酶是木聚糖酶，优选以所述藻类的干重的2wt％-6wt％、优选4wt％的浓度使用；并且所述内切蛋白酶是菠萝蛋白酶，优选以所述藻类的干重的1wt％-3wt％、优选2wt％的浓度使用。
7.如前述权利要求中任一项所述的提取物，其特征在于，所述提取物的干物质含量为
26.8g/kg-30.8g/kg；蛋白质含量为1.3g/kg-2.3g/kg；糖含量为25.3g/kg-29.3g/kg。
8.如权利要求7所述的提取物，其特征在于，在步骤ii)结束时，将所述提取物在一种或多种生理学上可接受的溶剂中稀释，所述溶剂选自于：
水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基二甘醇或丙氧基二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。
9.获得如权利要求1-8中任一项所述的掌状红皮藻和茉莉属植物的花头的协同提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)按照水与掌状红皮藻的重量比为10/1-50/1、优选为20/1-40/1，将一定量的干燥并磨细的藻类掌状红皮藻溶于水中；
b)在40℃-80℃、优选50℃-60℃、甚至更优选55℃的温度下，用糖酶和/或内切蛋白酶在3-6、优选4-5.5、甚至更优选4-4.5的pH下对掌状红皮藻水溶液进行水解至少1小时、优选
2小时的时间；
c)在任选加入助滤剂和离心后，获得掌状红皮藻水提取物；
d)在环境温度下，将干燥的茉莉属植物的花头浸渍在步骤c)中获得的掌状红皮藻水提取物中至少2小时并至多4小时的时间，所述藻类的干重与所述花头的干重的重量比为40/
60-95/5；
e)将步骤d)中由此获得的浸渍产物过滤，以回收掌状红皮藻和茉莉属植物的花头的提取物，在40℃-90℃、优选80℃的温度下，将所述提取物加热至少2小时并上至24小时、优选加热12小时或过夜，以使所述糖酶和所述内切蛋白酶失活；以及
f)任选地通过过滤进行纯化，以获得掌状红皮藻和茉莉属植物的花头的协同提取物。
10.一种化妆品组合物，所述组合物包含处于生理学上可接受的溶剂中的如权利要求
1-8中任一项所述的或通过如权利要求9所述的方法获得的掌状红皮藻和茉莉属植物的花头的协同提取物。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的掌状红皮藻和茉莉属植物的花头的协同提取物的浓度以干重计为所述组合物总重量的0.0001％-20％、优选该浓度以干重计为所述组合物总重量的0.05％-5％。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含至少一种另外的活性剂，所述另外的活性剂选自于：
维生素A、视黄酸、视黄醇、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素E、维生素F、维生素H、维生素K、维生素PP、辅酶Q10、金属蛋白酶抑制剂、氨基酸、肉毒碱、肌肽、牛磺酸、天然肽或合成肽、植物肽提取物、酵母提取物、丰年虾(Artemia salina)提取物、合成或天然来源的植物甾醇、水杨酸、寡糖、多糖、氨基糖、多酚、类黄酮、脂质、磷脂、动物来源的油、植物油、乙氧基化植物油、紫外线屏蔽剂和防晒剂。
13.如权利要求1-8中任一项所述的掌状红皮藻和茉莉属植物的花头的协同提取物或如权利要求10-12中任一项所述的组合物用于通过协助维持成体真皮干细胞(SKP)的“干性”特征来抵抗皮肤老化迹象的化妆品用途。
14.如权利要求13所述的用途，所述用途用于改善皮肤的弹性、柔韧性和/或紧致性。
掌状红皮藻和茉莉的协同提取物、包含该协同提取物的组合
物及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及化妆品领域，尤其涉及通过在真皮水平上的作用来护理皮肤。更具体地，本发明涉及茉莉(Jasminum，也称为jasmine)属植物和红藻类掌状红皮藻(Palmaria palmata)植物的协同提取物(synergistic extract)、获得所述提取物的方法、包含所述提取物的组合物以及它们用于抵抗皮肤老化迹象(尤其是用于改善皮肤弹性、柔韧性和紧致性)的化妆品用途。
背景技术
[0002] 老化对应于随着时间使身体的结构和功能改变的一组过程、尤其是生理过程。两种类型的老化(即一方面是内在老化，另一方面是外在老化)之间有区别。内在老化归因于遗传因素以及在疲劳、压力、激素变化(如怀孕期间)的状态期间发生的生化变化等。外在老化就其本身而言归因于身体在整个生命期间遭受的环境因素，例如污染、日光、疾病等。老化是一种缓慢、渐进的过程，其通过各种手段影响身体的所有细胞，并以各种方式表现出来。例如，在皮肤水平上，外在老化的出现因各种类型的内部或外部侵害而改变，然后我们看到以下现象的发生：皱纹和纹路、色素沉着过度斑或色素沉着不足斑、皮肤干燥或甚至脱水、表皮变薄、弹性组织变性、瑕疵(imperfections)和老年斑。
[0004] 表皮由若干层称为角化细胞的细胞组成，而角化细胞由位于表皮基底膜中的表皮干细胞再生。
[0005] 真皮是皮肤的支持组织，主要由包裹在蛋白聚糖的间质细胞外基质中的成纤维细胞、弹性蛋白纤维和胶原纤维(真皮纤维的70％)构成。胶原纤维和弹性蛋白纤维在成纤维细胞中合成。原弹性蛋白纤维(首先作为前弹性蛋白的形式存在)的新合成是与成纤维细胞(在细胞外空间中分泌这些纤维)的活性相关的过程。成熟后，与原纤蛋白相关联的弹性蛋白代表了赋予真皮弹性性质的弹性纤维的主要成分。而且，成纤维细胞能够使结缔组织再生并促进创伤后的皮肤修复。在皮肤水平上参与许多功能的成纤维细胞因此对于保持皮肤健康和状况良好至关重要。
[0006] 当例如因紫外辐射或创伤而受损害时，皮肤结构的更新或修复活性暗示了成体真皮干细胞(皮肤来源前体细胞(Skin Derived Precursors或SKP))的存在，尤其是位于诸如包皮和毛囊的组织中(Toma等，2005，Stem cells 23：727-737)。SKP细胞是真皮细胞的主要祖细胞，因为它们确保成纤维细胞的更新。特别地，SKP细胞参与皮肤创伤的修复。
[0007] SKP细胞总体上具有典型的干细胞特征；SKP细胞具有可观的自我更新和分化能力(Li等，2010，J Cell Sci.123：853-60)，并被定义为表达诸如以下分子标志物的一组分子标志物的细胞：
[0008] -Nestin+：在发育期间由许多细胞(特别是神经嵴细胞)表达的中间丝状体蛋白，该蛋白的表达是短暂的，并不会持续到成年；
[0009] -OCT4+(八聚体结合转录因子4)：参与未分化胚胎干细胞的自我更新的多潜能标志物；
[0010] -SOX2+(性别决定区Y框蛋白2)：维持未分化胚胎干细胞的自我更新的关键转录因子。
[0011] 对能够抵抗皮肤老化的活性剂进行识别的研究已致使具有不同功效的多种活性剂在市场上销售。然而，仍然需要识别能够更有效地延缓皮肤老化出现或抵抗皮肤老化迹象的新化合物。更具体地，本发明打算解决的问题是识别新活性剂，该新活性剂能够抵抗在细胞外基质(其大部分组成蛋白由成纤维细胞产生)水平上发生的皮肤老化的主要迹象。
[0012] 藻类被广泛用于化妆品应用中。藻类用于防止老化以及用于改善人类皮肤的保护和外观的潜力是已知的。使用藻类提取物可改善皮肤和毛发的营养，同时维持良好的水合水平。
[0013] 微藻的一些种类被销售用于皮肤护理。例如，节旋藻(Arthrospira)提取物和小球藻(Chlorella)提取物在抗老化霜、抗刺激产品以及清爽(refreshing)或再生护理产品中是众所周知的。
[0014] 此外，已知藻类Palmaria属的种、特别是掌状红皮藻(Palmaria palmata)种在皮肤护理中是有效的。藻类掌状红皮藻也被称为Dulce或Dulse。这种海藻富含矿物质(尤其是氟化物、磷、钾)、维生素、蛋白质和多糖(木聚糖)。FR2826575描述了提取自掌状红皮藻的木聚糖的化妆品用途(更具体而言用于增加角质层的水合)以及通过纤连蛋白合成和成纤维细胞增殖来使皮肤和毛发再生。
[0016] 然而，一方面素方花提取物和另一方面掌状红皮藻提取物的已知用途都没有表明这两种提取物具有相互独立或相互组合的如下性质：i)增加胶原的基因和/或蛋白质表达；和/或ii)增加真皮干细胞的干性特征。
[0017] 现代化妆品的趋势是开发天然来源的活性产品，其不仅作为抗皱剂或抗老化剂起作用，还组合了多种性质，因此提供了更广谱的老化迹象改善。
[0018] 现在，本发明人已经证明，从掌状红皮藻和素方花获得的新提取物对皮肤护理具有可观的意义，这是因为该提取物对真皮干细胞具有协同作用。实际上，这种提取物使得能够增加真皮干细胞的储备并改善其功能，这使得能够保持并甚至恢复真皮结缔组织的结构。如已经在ballistometry测试中所证明的，这种提取物使得能够改善皮肤的机械性能(特别是其弹性)，因此能够抵抗某些皮肤老化迹象。
[0019] 令人惊讶的是，本发明人发现，根据本发明使用的掌状红皮藻和茉莉花头(flower heads)的协同提取物尤其提供了以下优点：
[0020] -该提取物增加与真皮干细胞(SKP)的“干性”特征相关的生化标志物的量，特别是真皮细胞中的Nestin+、OCT4+、SOX2+的量；
[0021] -该提取物增加皮肤弹性、皮肤柔韧性和/或皮肤紧致性；
[0022] -该提取物增加皮肤的更新；
[0023] -该提取物增加真皮细胞外基质的蛋白质合成，例如胶原(特别是I型、III型或V型胶原)、前胶原(procollagen)(特别是I型、III型或V型前胶原)以及原弹性蛋白；
[0024] -因此，该提取物使得能够抵抗与皮肤老化相关的皮肤迹象。
[0025] “真皮干细胞的干性特征”是指与SKP或SKP样细胞的表型相关的生化标志物的表达谱，特别是Nestin+、OCT4+、SOX2+表达。
发明内容
[0027] 本发明涉及茉莉属植物的提取物，该提取物通过将所述植物的至少部分浸渍在藻类掌状红皮藻的水性水解物中而获得。用作制备该提取物的原料的藻类的干重与所述植物的干重的重量比优选为40/60-95/5。这种提取物具有如下独创特性：该提取物不具有与用藻类掌状红皮藻的水性水解物和茉莉属植物提取物(通过将所述植物的至少部分浸渍在水中而获得)的混合物所获得的生物学性质相同的生物学性质。
[0028] 首先，本发明涉及藻类掌状红皮藻和茉莉属植物的至少部分的协同提取物，所述提取物可通过包括以下步骤的方法获得：i)制备藻类掌状红皮藻水提取物的步骤；随后ii)将茉莉属植物的至少部分浸渍在所述水提取物中的步骤，所述藻类的干重与所述植物部分的干重的重量比为40/60-95/5，两者均被用作制备所述协同提取物的原料。
[0029] 在一个实施方式中，通过这一方法获得协同提取物。
[0030] 在本发明中，除非另有说明，百分数以重量/重量表示。
[0031] 在说明书的其余部分，不加区分地使用术语“茉莉”和“茉莉属植物”。
[0032] 术语“提取物”通常表示从天然植物原料获得的分离物质，就其本身而言在自然界中原本不存在。
[0034] 根据本发明的“协同提取物”是指包含掌状红皮藻和茉莉(优选素方花的花头)的水提取物的提取物、或由掌状红皮藻和茉莉(优选素方花的花头)的水提取物组成的提取物；相对于单独孵育的掌状红皮藻参照提取物、单独孵育的茉莉参照提取物以及它们的混合物，所述协同提取物能够通过借助直接或间接调控基因表达以增加蛋白质合成或通过其它生物过程(例如蛋白质的稳定化或信使RNA转录物的稳定化)来增加Nestin+、OCT4+、SOX2+的表达。可在相同的制备条件下例如通过进行如上所述的用于制备协同提取物的方法的步骤i)来获得掌状红皮藻参照提取物。可在相同的制备条件下例如通过用相同重量的水代替步骤i)结束时所获得的一定重量的Palmaria水提取物，通过进行如上所述的用于制备协同提取物的方法的步骤ii)来获得茉莉参照提取物。在整个说明书中，基于恒定重量的提取物干物质来评估性质的改善。
[0035] 特别地，根据本发明的协同提取物是包含掌状红皮藻和茉莉花头的水提取物的提取物、或由掌状红皮藻和茉莉花头的水提取物组成的提取物；相对于单独孵育的掌状红皮藻参照提取物、单独孵育的茉莉参照提取物以及任选地它们的混合物，所述协同提取物能够使真皮干细胞的干性特征增加至少2倍。
[0036] 特别地，相对于单独孵育的掌状红皮藻参照提取物以及单独孵育的茉莉参照提取物，所述协同提取物能够：
[0037] -使成纤维细胞表达的SOX2+的信使RNA量增加至少8倍；和/或
[0038] -使成纤维细胞表达的Nestin+的信使RNA量增加至少2倍；和/或
[0039] -使成纤维细胞表达的OCT4+的信使RNA量增加至少6倍。
[0040] 在整个说明书中，术语“协同提取物”、“掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物”或“活性剂”作为具有相同含义的替代用语使用。
[0042] 优选地，在对掌状红皮藻进行水提取(随后在其中进行茉莉花头的浸渍)之后，获得根据本发明的提取物，藻类的干重与花头的干重的重量比为50/50-90/10，例如60/40-70/30或80/20-90/10(包括端点在内)。在一个实施方式中，所述重量比等于90/10。
[0043] 所述提取物的制备可以从制备掌状红皮藻水提取物开始，掌状红皮藻是Palmariaceae科红藻类的种，也称为Dulce或Dulse。几个世纪以来，掌状红皮藻一直是纤维的重要来源。这种藻类富含矿物质(特别是氟化物、磷、钾)、矿物质、维生素、蛋白质和多糖(木聚糖)。
[0044] 可通过在3-6的pH、40℃-80℃的温度下对掌状红皮藻水溶液进行酶促水解(例如用糖酶(carbohydrase)和/或内切蛋白酶)至少1小时、优选2小时的时间，来获得根据本发明使用的掌状红皮藻水提取物，所述掌状红皮藻水溶液包含的水与掌状红皮藻(以藻类的干重表示)的重量比为10/1-50/1。
[0045] 有利地，在收获后将藻类掌状红皮藻干燥并磨细。
[0046] 水与掌状红皮藻的重量比优选为15/1-30/1、甚至更优选为20/1-25/1。
[0047] 优选地，例如通过加入盐酸(HCl)将pH调节为3-6、优选为4-5.5、甚至更优选为4-4.5。
[0048] 优选地，水解温度为40℃-80℃、优选为50℃-60℃、甚至更优选为55℃。
[0049] 水解植物提取物的使用为化妆品和皮肤化妆品提供了许多优点。除了释放活性化合物之外，水解和纯化使得能够获得更稳定、更容易标准化并且不会在化妆品中引起过敏反应的混合物。
[0050] 有利地，受控的水解允许获得包含在藻类物种掌状红皮藻中的糖。根据本发明的提取物是茉莉和Palmaria的水提取物，该水提取物富集了来自掌状红皮藻和茉莉的目标化合物。
[0051] 优选地，受控的酶促水解用木聚糖酶(作为糖酶)和菠萝蛋白酶(作为内切蛋白酶)进行。这些酶使得能够优化水解率和水解度。
[0052] 木聚糖酶是糖基水解酶家族的酶，该酶通过双重置换机理催化水解木聚糖的β-1,4-糖苷键。木聚糖的水解释放木糖。
[0054] 相对于加入反应混合物的藻类的量(以干重计)，木聚糖酶的用量优选为2％-6％、甚至更优选为4％；菠萝蛋白酶的用量优选为1％-3％、甚至更优选为2％。
[0055] 然后，通过本领域技术人员已知的方法(例如离心，随后过滤)，将由此获得的掌状红皮藻水提取物与固体残余物分离。
[0056] 例如，正是该初次过滤的水提取物将被用作茉莉花头的浸渍液。
[0057] 浸渍是由“使固体在液体中保留定义的时间，以从中提取可溶性化合物”组成的过程。
[0058] 优选地，在环境温度下(例如在18℃-35℃的温度下)进行至少2小时并上至4小时的浸渍。
[0059] 素方花或白茉莉(white jasmine)(或普通茉莉(common jasmine))是木犀科的藤本植物(包括落叶植物和半常绿(semi-persistent)植物)，在整个夏季中开出大量芳香花朵。
[0060] 优选地，茉莉花头(包含作为植物部分的花，并伴有几厘米的茎)选自于如下物种中的一种的花头：大花茉莉(Jasminum grandiflorum)、素方花(Jasminum officinale)、浓香金茉莉(Jasminum odoratissimum)、重瓣茉莉(Jasminum sambac)、天星茉莉(Jasminum auriculatum)、盈江素馨(Jasminum flexile)，优选素方花。优选地，茉莉属于素方花种。
[0061] 有利地，将茉莉花头整体使用、干燥、并置于掌状红皮藻水提取物中进行浸渍。
[0062] 在过滤后，由此获得的掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物的干物质含量为26.8g/kg-30.8g/kg；蛋白质浓度为1.3g/kg-2.3g/kg；糖(主要是木糖)浓度为25.3g/kg-
29.3g/kg。
29.3g/kg。
[0063] 然后，可将提取物在一种或多种生理学上可接受的溶剂中稀释，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基二甘醇或丙氧基二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。优选地，将提取物在水和木糖醇中稀释，以得到木糖醇为30wt％的最终提取物。然后，根据本发明的协同提取物的特征在于：干物质浓度为280g/kg-320g/kg；糖浓度为8g/kg-12g/kg；pH为4-5。
[0064] 其次，本发明涉及一种获得掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物的方法，所述方法包括以下步骤，其中：
[0065] -按照水与掌状红皮藻(以干重计)的重量比为10/1-50/1，将一定量的掌状红皮藻溶于水中；
[0066] -在40℃-80℃的温度下，用糖酶和内切蛋白酶对掌状红皮藻水溶液进行水解；
[0067] -将茉莉花头浸渍在先前获得的掌状红皮藻水提取物中，藻类的干重与花头的干重的重量比为40/60-95/5；
[0068] -将获得的浸渍产物过滤，然后在40℃-90℃的温度下加热2小时-24小时，以使糖酶和内切蛋白酶失活。
[0069] 根据具体的实施方式，用于获得根据本发明的掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物的方法包括以下步骤，其中：
[0070] a)按照水与掌状红皮藻的重量比为10/1-50/1、优选为20/1-40/1，将一定量的干燥并磨细为薄片形式的掌状红皮藻溶于水中；
[0071] b)在40℃-80℃、优选50℃-60℃、甚至更优选55℃的温度下，用糖酶和内切蛋白酶(优选用木聚糖酶和菠萝蛋白酶)在3-6、优选4-5.5、甚至更优选4-4.5的pH下对掌状红皮藻水溶液进行水解至少1小时、优选2小时的时间；
[0072] c)在任选加入助滤剂和离心后，获得掌状红皮藻水提取物；
[0073] d)在环境温度下，将干燥的茉莉花头浸渍在步骤c)中获得的掌状红皮藻水提取物中至少2小时并至多4小时的时间，藻类的干重与花头的干重的重量比为40/60-95/5，优选地，藻类的干重与花头的干重的重量比等于90/10；
[0074] e)将步骤d)中由此获得的浸渍产物过滤，以回收掌状红皮藻和茉莉花头的提取物，在40℃-90℃、优选80℃的温度下，将所述提取物加热至少2小时并上至24小时、优选加热12小时或过夜，以使糖酶和内切蛋白酶失活；以及
[0075] f)任选地通过过滤进行纯化，以获得掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物。
[0076] 在步骤d)中，将茉莉花头浸渍在含有乙二醇或更通常而言诸如甲醇的醇类的介质中并不是必须的；仅使用基于水的液体介质是优选的。此外，在Palmaria水提取物中浸渍花的步骤并非必须包括酶促水解步骤(该步骤在现有技术中有时被设想用于从花中提取酚类化合物和糖类)。在加入茉莉花之前对Palmaria水提取物进行酶促水解。
[0077] 在步骤b)和步骤e)之后，获得的溶液可能是浑浊的。进行离心和过滤步骤，以除去悬浮的固体残余物。可将助滤剂(例如 )加入到混合物中，然后进行过滤步骤以将固体与液相分离，弃去固体。然后，可在孔隙率递减的过滤器上进行若干连续过滤步骤。收集的滤液构成了富含多糖的掌状红皮藻提取物。
[0078] 在残余酶失活后，由掌状红皮藻的酶促水解和茉莉花头在Palmaria提取物中的浸渍所产生的滤液构成了根据本发明的活性协同提取物的第一形式或第一滤液。在此阶段，第一滤液例如干物质浓度为26.8g/kg-30.8g/kg；蛋白质化合物含量为1.3g/kg-2.3g/kg；糖含量为25.3g/kg-29.3g/kg。
[0079] 然后，可将该第一活性滤液在一种或多种生理学上可接受的溶剂中稀释，例如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基二甘醇或丙氧基二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。在优选的实施方式中，将该第一活性滤液在溶剂混合物中稀释，从而获得含有30％木糖醇的第二滤液或最终提取物。根据本发明的协同提取物也可用0.5％苯甲酸钠保存以防被污染物污染。
[0080] 然后，可在无菌条件下将在溶剂中稀释的第二滤液过滤，在低温下(优选在65℃过夜)进行巴氏灭菌以完全灭菌。
[0081] 根据这一实施方式，获得最终滤液，该滤液构成根据本发明的协同提取物。可通过本领域技术人员熟悉的常规技术对根据本发明获得的协同提取物进行定性和定量分析，以确定其物化特征及其化合物含量。
[0082] 优选地，当所述第一活性滤液含有30％的木糖醇时，根据本发明的协同提取物的特征在于：干物质浓度为280g/kg-320g/kg；糖浓度为8g/kg-12g/kg；pH为4-5。
[0083] 第三，本发明涉及用于抵抗皮肤老化迹象的组合物，所述组合物包含处于生理学上可接受的介质中的根据本发明的协同提取物，所述协同提取物的浓度以干重计为所述组合物总重量的0.0001％-20％、优选所述协同提取物的浓度以干重计为所述组合物总重量的0.05％-5％。
[0084] “生理学上可接受的”是指根据本发明的协同提取物或含有该活性剂的组合物适于与皮肤或粘膜接触，而不引起毒性或不耐受的反应。
[0086] 这些组合物尤其可处于如下形式：水溶液、水-醇溶液或油溶液；水包油乳剂、油包水乳剂或多重乳剂；所述组合物还可处于适合施用于皮肤、粘膜、嘴唇和/或附属物(appendages)的霜剂、混悬剂或散剂的形式。这些组合物可以或多或少地是流体，并具有霜剂、洗剂(lotion)、乳液(milk)、精华液、软膏、凝胶、糊剂或泡沫的外观。所述组合物还可处于固体形式(例如棒状物(stick))，或者能够以气雾剂的形式施用于皮肤上。所述组合物可用作皮肤护理产品和/或用作皮肤化妆产品。
[0087] 这些组合物进一步包含所设想的应用领域中通常使用的任何添加剂以及所述组合物配制所需的助剂，例如溶剂、共溶剂(乙醇、甘油、苯甲醇)、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、染料、防晒剂(sun filters)、自晒黑剂、色素、填料、防腐剂、香料、气味吸收剂、化妆品活性成分或药用活性成分、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、微量元素、成膜聚合物、化学过滤剂或矿物过滤剂、保湿剂或温泉水、聚合物(例如多糖或多肽、羟丙基纤维素或甲基纤维素型的纤维素衍生物、或合成聚合物、泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、PVA或PVP)。
[0088] 在所有情况下，本领域技术人员将注意应以如下方式对这些添加剂及其比例进行选择：所述添加剂不会不利地影响根据本发明的组合物所需的有利性质。这些添加剂可以例如相当于组合物总重量的0.01％-20％。当本发明的组合物是乳剂时，相对于组合物总重量，油相可以占5wt％-80wt％、优选5wt％-50wt％。组合物中使用的乳化剂和助乳化剂选自于正在讨论的领域中常规使用的乳化剂和助乳化剂。例如，相对于组合物总重量，乳化剂和助乳化剂能够以0.3wt％-30wt％的比例使用。
[0089] 可根据本发明使用的组合物可通过任何合适的途径(尤其是口服途径或局部外用途径)施用，并且本领域技术人员可调整组合物的配方。
[0090] 有利地，根据本发明的组合物处于适于局部施用的形式。因此，这些组合物必须含有生理学上可接受的介质(即与皮肤和附属物相容)，并包括所有化妆品形式。
[0091] 有利地，除了根据本发明的活性剂之外，可用于实施本发明的组合物可包含至少一种其它活性剂，该活性剂具有与本发明的活性剂类似和/或互补的化妆效果。根据本发明，将这种活性剂定义为“另外的活性剂”。
[0092] 例如，所述另外的活性剂可选自于如下活性剂：抗老化剂、紧致剂、增亮剂、保湿剂、排水剂(draining agents)、微循环促进剂、药剂、去角质剂、脱皮剂(刺激细胞外基质)、能量代谢活化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、安抚剂(soothing agents)、抗自由基剂、抗UV剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、热感提供剂、新鲜感提供剂以及减肥剂。
[0093] 这些另外的活性剂可选自于包含以下活性剂的组：
[0094] -维生素A，尤其是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯；
[0095] -维生素B3，更特别是烟酰胺、生育酚烟酸酯；
[0096] -维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；
[0098] -维生素E、维生素F、维生素H、维生素K、维生素PP、辅酶Q10；
[0099] -金属蛋白酶抑制剂或TIMP活化剂；
[0100] -DHEA及其前体和衍生物；
[0102] -天然肽或合成肽(包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽)以及它们的亲脂性衍生物、异构体和与其它物质(例如金属离子，如铜、锌、锰、镁等)的络合物，例如，商业上已知的名为 COLLAXYLTM、PEPTIDE VINCI 02TM、CHRONOGENTM、LAMINIXYL ISTM、PEPTIDE Q10TM的肽、序列Arg-Gly-Ser-NH2的合成肽(以ATPeptideTM的名称销售)、序列Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gln的合成肽(以SIRPeptideTM的名称销售)；
[0103] -植物肽提取物，例如大豆提取物、斯佩耳特小麦(spelt)提取物、葡萄藤(grapevine)提取物、菜籽(colza)提取物、亚麻(flax)提取物、大米提取物、玉米提取物或豌豆提取物；
[0104] -酵母提取物、丰年虾(Artemia salina)提取物；
[0105] -脱氢乙酸(DHA)；
[0106] -合成或天然来源的植物甾醇；
[0107] -水杨酸及其衍生物、α-羟基酸和β-羟基酸、硅烷醇；
[0108] -氨基糖、葡萄糖胺、D-葡萄糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺；
[0109] -异黄酮、类黄酮、多酚类提取物(如葡萄提取物、松树(pine)提取物、橄榄提取物)；
[0110] -脂质，例如神经酰胺或磷脂、动物来源的油(如角鲨烯或角鲨烷)、植物油(如甜杏仁油、椰子油(copra oil)、蓖麻油、荷荷巴油(jojoba oil)、橄榄油、菜籽油、花生油、向日葵油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉花油、苜蓿油、罂粟油、南瓜油、月见草油、小米油(millet oil)、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油、金盏花油)、乙氧基化植物油、乳木果油；
[0111] -紫外线屏蔽剂和防晒剂。
[0112] 本发明的另一方面涉及根据本发明的掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物用于抵抗皮肤老化迹象的化妆品用途，尤其是通过协助维持SKP成体真皮干细胞的“干性”特征来抵抗皮肤老化迹象。
[0114] “皮肤老化迹象”是指由于内在老化和外在老化引起的皮肤和附属物外观的任何变化(例如皱纹和纹路、外观干枯、紧致性丧失、变薄、弹性和/或色调丧失、暗沉和光泽丧失)以及并非一直反映为外观变化的皮肤的任何内部变化(例如由诸如紫外辐射(UV)的外部因素导致的皮肤的任何内部退化)。特别地，根据本发明的活性剂或包含所述活性剂的组合物将使得能够抵抗皮肤弹性、柔韧性和紧致性的丧失。
[0115] “抵抗皮肤老化迹象”是指延迟这种迹象出现、减少这种迹象、改善这种迹象的视觉外观或纠正这种迹象。特别地，“抵抗老化迹象”是指改善皮肤的机械性质，尤其是增加其紧致性、柔韧性和/或弹性。
[0116] 因此，本发明进一步涉及掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物用于改善皮肤弹性的化妆品用途。
[0117] 本发明进一步涉及掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物用于改善皮肤弹性性质的化妆品用途。
[0118] 根据本发明的术语“皮肤”包括无毛皮肤和存在于身体表面上的所有角质附属物，特别是胡渣(bristles)、睫毛、眉毛、指甲和头发。
[0119] 皮肤的永久性更新及其在损伤(例如由紫外辐射或创伤引起)后的修复意味着皮肤中成体干细胞(称为真皮干细胞或SKP)的存在。干细胞的这种储备在老化期间和外部因素的侵害性作用下减少，降低了皮肤更新能力，并导致皮肤老化迹象的出现。
[0120] 表述“外部侵害性因素”是指环境中的侵害性因素。作为实例可以提及如下因素：例如污染、紫外辐射或刺激性产品(例如表面活性剂、防腐剂或香水)。污染是指如下两方面：由于例如柴油颗粒、臭氧或重金属而造成的“外部”污染；以及可能主要由于来自于涂料溶剂、胶水或壁纸的排放物(例如甲苯、苯乙烯、二甲苯或苯甲醛)或香烟烟雾而造成的“内部”污染。大气干燥也是皮肤干燥的重要原因。
[0121] 现在，发明人惊奇地发现，根据本发明的活性剂保护了SKP细胞并增强了该细胞的活性。实际上，根据本发明的提取物允许表征真皮干细胞的“干性”特征的标志物的协同增加，该协同增加远大于在单独用掌状红皮藻提取物或单独用茉莉花头水提取物处理后观察到的活化作用。
[0122] 因此，所述协同提取物可以在用于防止或修复由老化引起的皮肤损伤(可能会因暴露于太阳或暴露于干燥环境而加速)的化妆品组合物中作为活性剂使用。
[0123] 因此，本发明的一个方面涉及茉莉花头提取物(通过将所述头浸渍在掌状红皮藻水提取物中而获得)的化妆品用途，所述用途用于改善人健康皮肤区域中选自于由如下状况所组成的组中的至少一种状况：皮肤紧致性、皮肤弹性、皮肤柔韧性和皮肤更新速度(renewal rate)。
[0124] 就本发明的意义而言，“化妆品用途”是指并不旨在用于治疗用途的用途。在这种用途的情况下，将提取物施用到人皮肤的健康的部分上。可通过皮肤科医生未检测到任何疾病、任何皮肤病(牛皮癣、湿疹或痤疮)或任何创伤，来容易地表征健康皮肤区域。
[0125] 在老化期间，胶原量整体下降，导致皮肤紧致性丧失。当皮肤遭受外部侵害性因素(例如寒冷或紫外辐射)时，这种现象可能会加速。
[0126] 皮肤老化表现为各种迹象，这些迹象具有彼此独立的生物学起因，从而，通过提供对特定目标起作用以诱导特定老化迹象降低的活性成分，可能能够抵抗皮肤老化。
[0127] 这些表现包括紧致性丧失、僵硬度增加和弹性丧失。皮肤机械性能的退化主要是由于真皮细胞外基质中胶原量的下降。这种下降本身是由于彼此独立的各种原因造成的，包括胶原分子被酶降解、此类相同分子的糖基化以及成纤维细胞产生的胶原减少。
[0128] 掺入化妆品组合物中的本领域技术人员已知的具有抗老化作用的生物活性成分抑制了胶原酶的活性，所述胶原酶负责胶原的降解。在化妆护理产品中还提议了抑制胶原糖基化机制的其它活性成分。这些活性成分和这些化妆品组合物减缓了胶原纤维的降解和分解。此类产品不能提高新合成的真皮蛋白的量或细胞更新速度。
[0129] 因此，仍然需要提供对于抵抗皮肤老化迹象更有效的生物活性成分。本发明的目的是提供一种植物来源的新提取物，该提取物不仅能够随时间稳定皮肤中的胶原量，还能够增加胶原基因和/或蛋白表达，并因此改善皮肤的机械性质，例如柔韧性和弹性。
[0130] 根据本发明的一个方面，本发明涉及上述提取物或通过上述方法制备的提取物通过增加皮肤的柔韧性水平、皮肤的弹性水平和/或皮肤的细胞更新速度用于抵抗皮肤老化的用途。
[0131] 由本发明提取物产生的皮肤柔韧性和弹性的增加可能与真皮细胞外基质中选自于胶原、原弹性蛋白和前胶原中的至少一种蛋白质的表达增加有关。真皮中的蛋白质表达增加可对应于所述蛋白质的基因表达和/或蛋白质表达增加。在具体实施方式中，皮肤紧致性和弹性的增加是由同时增加胶原和弹性蛋白的合成而引起的，例如通过同时增加I型胶原、III型胶原、I型前胶原、III型前胶原和原弹性蛋白的合成。
[0132] 皮肤的细胞更新增加可反映在真皮干细胞数量增加和/或其功能改善上，这使得能够恢复在施用协同提取物之前已经恶化的真皮结缔组织的结构。在一种具体情况中，本发明旨在通过增加由成纤维细胞表达的标志物Nestin+、OCT4+和SOX2+中的至少一种的表达，来恢复或增强真皮干细胞的干性特征。
[0133] 更具体地，本发明涉及茉莉花头提取物(通过将所述头浸渍在掌状红皮藻水提取物中而获得)的化妆品用途，所述用途用于通过增加皮肤的紧致性、柔韧性和/或弹性来抵抗皮肤老化。通过增加真皮中成纤维细胞对蛋白质的合成可诱导紧致性、柔韧性和/或弹性的增加。
[0134] 本发明还涉及茉莉花头提取物(通过将所述头浸渍在掌状红皮藻水提取物中而获得)的化妆品用途，所述用途尤其用于通过增加真皮干细胞(SKP)的干性特征和/或通过增加皮肤中真皮干细胞的量来增加真皮的细胞更新。
[0135] 本发明还涉及有利地通过局部途径施用上述提取物的化妆品用途，所述用途用于增加真皮中至少一种蛋白质的表达。真皮中的蛋白质表达增加可对应于所述蛋白质的基因表达和/或蛋白质表达增加。这种蛋白质例如选自于胶原、原弹性蛋白和前胶原。胶原优选为I型胶原或III型胶原。前胶原优选为I型前胶原或III型前胶原。在具体实施方式中，本发明涉及所述提取物用于同时增加I型前胶原的蛋白质表达、III型胶原的蛋白质表达以及原弹性蛋白的蛋白质表达的用途。
[0136] 相对于在不存在根据本发明的提取物的情况下所测量的胶原的蛋白质表达水平，真皮的胶原表达增加可以为胶原的蛋白质表达水平增加至少15％。优选在含有成纤维细胞和SKP或SKP样类型的真皮干细胞(从成体供体成纤维细胞获得)的真皮等同物(dermis equivalents)中测量这种增加，使用的干提取物量(以重量计)为真皮等同物重量的0.01％级别。例如，该增加为真皮等同物中I型前胶原和III型胶原的蛋白质表达水平至少20％的增加(例如根据实施例3所述的方案测量，使用免疫标记方法并通过落射荧光显微镜进行观察检测)，任选地联合真皮等同物中原弹性蛋白的蛋白质表达水平至少15％的增加(例如根据实施例5所述的方案测量，使用免疫标记方法并通过落射荧光显微镜进行观察检测)。
[0137] 柔韧性和/或弹性的增加可为相对于在施用根据本发明的提取物之前测量的皮肤样品的柔韧性水平或弹性水平而言分别增加至少15％。可使用ballistometer对含有SKP或SKP样类型的真皮干细胞和成纤维细胞的真皮等同物的柔韧性和弹性的增加进行测量，使用的提取物量(以干重计)相当于培养基重量的0.01wt％级别。
[0138] Ballistometry法由跟踪从预定高度掉落到皮肤样品上的球体的振动组成。释放时球体的渗透深度(称为压痕)使得能够测量硬度，并因此测量皮肤的柔韧性。实际上，球体的渗透越深，皮肤的硬度越低。通过计算连接所有振动峰顶部的曲线的斜率(称为α)来评估弹性。皮肤弹性越大，球体弹跳越多，斜率越低。
[0139] 柔韧性的增加(也可表示为硬度的降低)为例如相对于在施用根据本发明的提取物之前测量的压痕而言压痕至少15％的减少，特别是根据实施例6的方案，对含有SKP或SKP样类型的真皮干细胞和成纤维细胞的真皮等同物使用ballistometry法。
[0140] 弹性的增加为例如相对于在施用根据本发明的提取物之前测量的斜率α而言斜率α至少15％的增加，特别是根据实施例6的方案，对含有SKP或SKP样类型的真皮干细胞和成纤维细胞的真皮等同物使用ballistometry法。
[0141] 皮肤的细胞更新增加可以是成纤维细胞中的标志物Nestin、OCT4和SOX2中的至少一种的表达增加，该增加通过在施用本发明的提取物(使用的提取物量(以干重计)相当于培养基重量的0.01wt％级别)之前和之后借助定量PCR法对由体外培养的成纤维细胞表达的SOX2、Nestin和/或OCT4的mRNA量进行比较来测量。成纤维细胞中SOX2、Nestin和OCT4的mRNA表达的增加分别优选为至少250％、至少100％和至少250％。
[0142] 本发明还涉及一种化妆护理方法，该方法由如下方面构成：将如上所述的协同提取物施用到受试者的健康皮肤上，以增加皮肤的紧致性、柔韧性和/或弹性，或增加皮肤的更新速度。
[0143] 针对此类化妆护理方法和此类用途的实施方式也从以上描述中产生。
[0145] 在所有附图中，用于图示的数值是三次测量的平均值。误差棒对应于基于平均标准偏差(mean standard deviation)的计算值RQmin和RQmax：***：高度显著；**：非常显著；*：显著(在Dunnett检验中)。
[0146] 图1：在成纤维细胞上施用不同提取物后SOX2、Nestin和OCT4的mRNA的qPCR。用于图示的数值是三次测量的平均值。误差棒对应于基于平均标准偏差的计算值RQmin和RQmax：***：高度显著；**：非常显著；*：显著(在Dunnett检验中)。
[0147] 图2：在含有SKP细胞的真皮等同物上施用根据实施例1的1％的协同提取物后细胞外基质的蛋白质(I型前胶原和III型胶原)的表达。用于图示的数值是三次测量的平均值。误差棒对应于基于平均标准偏差的计算值RQmin和RQmax：***：高度显著；**：非常显著；*：
显著(在Dunnett检验中)。
显著(在Dunnett检验中)。
[0148] 图3：在含有SKP样细胞的真皮等同物上施用根据实施例1的1％的协同提取物后III型胶原的表达。(平均值±SEM；n＝6，每个条件3个真皮，每个真皮等同物2张照片)。*：在学生“t”检验-单侧假设中显著。
[0149] 图4：在施用根据实施例1的1％的协同提取物后，含有SKP样细胞的真皮等同物的收缩的测量(平均值±SEM；n＝3个真皮等同物)。**：在学生“t”检验-单侧假设中非常显著。
[0150] 图5：在施用根据实施例1的1％的协同提取物后，含有SKP样细胞的真皮等同物中原弹性蛋白纤维的合成的测量。(平均值±SEM；n＝10-12，每个真皮等同物3-4张照片)。*：在学生“t”检验-单侧假设中显著。
[0151] 图6：在施用根据实施例1的1％的协同提取物后，含有SKP样细胞的真皮等同物的硬度和弹性的测量。(平均值±SEM；n＝15，每个真皮等同物5次测量)。*：在学生“t”检验-单侧假设中显著。
[0152] 图7：利用来自实施例1的协同提取物对标志物SOX2和nestin进行活化之前和之后通过光学显微镜(放大倍数*40)观察的照片。
[0153] 根据学生检验或Dunnett检验，在以下实施例中表示的所有结果在统计学上均是显著的(p<0.05)。实施例
[0154] 实施例1：掌状红皮藻和茉莉花头的协同提取物的制备
[0155] 将180g处于薄片形式的掌状红皮藻溶于4kg水中，并用HCl将pH调节至4.5-5.5的值。
[0156] 为了从掌状红皮藻中提取糖，用水解酶和蛋白酶进行水解。为此，将7.2g木聚糖酶和3.6g菠萝蛋白酶加入到反应混合物中。然后将反应混合物在55℃下加热2小时。
[0157] 过滤步骤使得能够弃去固体残余物并仅保留富含糖的滤液。为此，加入10g/kg的(助滤剂)，并将溶液以4000转/分钟离心10分钟。离心后，除去固体残余物，然后通过在纤维素过滤器上进行过滤将滤液纯化至不同程度。
[0158] 在第二步骤中，将20g素方花(Jasminum officinale)的花加入到所获得的约3.6kg滤液中，并在环境温度下进行浸渍2小时。
[0159] 将10g/kg 加入混合物中，并通过过滤将固体与滤液分离。
[0160] 然后，在80℃下将滤液(由掌状红皮藻的酶促水解和茉莉花头的浸渍产生)加热过夜，以使残余的酶失活。
[0161] 然后，通过用孔隙率递减的过滤器进行过滤来纯化溶液，获得明亮的琥珀色澄清溶液。
[0162] 获得的协同提取物的特征在于：干物质为28.8±2.0g/kg；蛋白质含量为1.8±0.5g/kg；糖含量为27.3±2.0g/kg。
[0163] 然后，将溶液用水稀释并在无菌条件下过滤，然后在低温下(65℃过夜)进行巴氏灭菌以完成灭菌。
[0164] 对应于活性协同提取物的终产物是淡黄色澄清溶液，其特征在于：干物质为10±3.0g/kg；糖含量为8g/kg-12g/kg；pH为4-5。
[0165] 实施例2：与掌状红皮藻参照提取物和茉莉花头参照提取物相比，施用根据实施例1获得的协同提取物后对SOX2、Nestin和OCT4的mRNA的评估
[0166] 本研究的目的是，在用茉莉参照提取物、掌状红皮藻参照提取物和根据实施例1获得的协同提取物进行处理后，对细胞表达的SOX2、Nestin和OCT4的mRNA量进行比较。
[0167] 通过定量PCR(q-PCR)评估SOX2、Nestin或OCT4的mRNA水平。
[0168] 为了进行生物学效果的比较测试，还制备了仅来自茉莉花头的提取物和仅来自掌状红皮藻的提取物。
[0169] 需留意的是，在相同条件下(相同水平的干植物材料/kg水、相同pH、相同过滤和纯化条件)制备参照提取物和协同提取物。
[0170] 茉莉参照提取物的制备：
[0171] 将20g干素方花花头置于1kg水中，并在环境温度下伴随搅拌浸渍2h。然后，使用孔隙率递减(20μm-50μm减至0.3μm-0.5μm)的过滤器进行连续过滤，以弃去固体残余物并纯化提取物。
[0172] 获得的提取物的特征在于干物质为5±0.5g/kg。接下来，将提取物在水中稀释至3±0.5g/kg干物质的终浓度。将pH调节至4。然后，使提取物在0.2μm过滤器上经受除菌过滤，并置于65℃下过夜以进行低温巴氏灭菌，从而完成灭菌。
[0173] 掌状红皮藻参照提取物的制备：
[0174] 将50g处于薄片形式的掌状红皮藻溶于1kg水中。使用加入到反应混合物中的2g木聚糖酶和1g菠萝蛋白酶进行水解。然后将反应混合物在55℃下加热2小时。过滤步骤使得能够弃去固体残余物并仅保留富含糖的滤液。为此，加入10g/kg (离心助剂)，并将溶液以4000转/分钟离心10分钟。离心后，弃去固体残余物，然后通过在孔隙率递减(减至7μm-20μm的孔隙率)的过滤器上进行过滤纯化上清液，并在80℃下保持过夜。第二天，在孔隙率递减(减至0.3μm-0.5μm)的过滤器上再次过滤提取物。获得的提取物的特征在于干物质为30±2g/kg。然后，将提取物在水中稀释，得到20±2g/kg干物质。然后，将pH调节至4-4.5。
[0175] 然后，使提取物在0.2μm过滤器上经受除菌过滤，并保持在65℃下过夜以进行低温巴氏灭菌，以完成灭菌。
[0176] 用于评估mRNA的方案：用先前制备并在培养基中稀释至1％vol/vol的不同提取物对正常人成纤维细胞进行处理。平行地，成纤维细胞的培养物不经处理以构成未经处理的对照。培养在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中进行。
[0177] 在这一孵育结束时，用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN，74104)提取总RNA，并用含有RNA酶抑制剂的高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，4368814)进行逆转录。使用Step One Plus热循环仪(Applied Biosystems)进行定量PCR。从Taqman表达分析获得目标SOX2、Nestin和OCT4的引物和探针以及内源对照18S的引物和探针(Applied Biosystems；18S为Hs99999901_s1、SOX2为Hs01053049_s1、Nestin为Hs00707120_s1、OCT4为Hs00999632_g1)，稀释于无菌水和Master Mix(Applied Biosystems)中。
[0178] 结果：
[0179] 如图1所呈现的，结果显示，与未经处理的对照相比，在用1％的掌状红皮藻参照提取物处理的成纤维细胞中，SOX2、Nestin和OCT4的mRNA表达分别在统计学上显著地增加29％、26％和34％。
[0180] 仅使用茉莉提取物没有观察到刺激。
[0181] 在以1％的量用根据实施例1获得的协同提取物处理成纤维细胞的情况下，结果显示，与未经处理的对照相比，增加分别显著大于先前用掌状红皮藻提取物观察到的增加：SOX2的mRNA表达增加296％、Nestin的mRNA表达增加123％、OCT4的mRNA表达增加285％。
[0182] 结论：
[0183] 与未经处理的对照细胞、茉莉参照提取物和藻类参照提取物相比，在用根据实施例1获得的协同提取物预处理的成纤维细胞中，观察到SOX2、Nestin和OCT4的mRNA水平更高。在表征真皮细胞的“干性”特征的标志物方面，根据实施例1获得的协同提取物提供了协同增加。
[0184] 实施例3：在含有人成纤维细胞和SKP细胞的真皮等同物中证明根据实施例1获得的协同提取物对I型前胶原和III型胶原表达的活化作用
[0185] 本研究的目的是，确定根据实施例1获得的协同提取物对细胞外基质中以下蛋白质的表达的作用：I型前胶原和III型胶原。
[0186] 为此，从重构的真皮等同物(由I型聚合牛胶原、人成纤维细胞和SKP干细胞构成)开始，进行特异性标记。
[0187] 免疫标记方案：从成体供体皮肤外植体提取人成纤维细胞。本实验中使用的SKP细胞获得自包皮。用在培养基中稀释至1/100的根据实施例1的提取物(即1％vol/vol)对培养的SKP细胞进行预处理7天(每天两次)。由于实施例1中获得的提取物的干重为约10g/kg，以培养基重量的约0.01wt％对提取物进行测试。在该模型中，在掺入真皮等同物之前用提取物刺激干细胞，以确保提取物的直接作用。平行地，维持SKP细胞的培养物不经处理以构成未经处理的SKP细胞对照。培养在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中进行。
[0188] 通过混合I型牛胶原溶液(以1个SKP细胞球体相对于10000个成纤维细胞的各自比例向其中加入以球体形式培养的SKP细胞和悬浮于培养基中的成纤维细胞)来制备真皮等同物。将该混合物小心均质化并分布在6孔板的孔中。发生I型胶原聚合，从而形成真皮等同物。以相对于混合物体积为1％的浓度用根据实施例1获得的协同提取物对真皮等同物进行处理5天(每天两次)，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中保持。
[0189] 将样品用10％多聚甲醛固定，并在用乙醇和二甲苯(Shandon)连续洗浴后包埋在石蜡中。
[0190] 在厚度为4μm的切片上进行免疫标记。
[0191] 对于I型前胶原，使组织在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6，Sigma)中在600W下经受微波暴露，然后用0.25％胃蛋白酶进行酶处理(37℃下15min；Zymed，Invitrogen)。
[0192] 关于用于III型胶原免疫标记的组织切片的处理，在600W下进行微波暴露，然后用0.5％胰蛋白酶进行酶处理(37℃下15min；Zymed，Invitrogen)。
[0193] 在饱和30min后，在特异性针对I型前胶原的大鼠单克隆抗体(Millipore)和特异性针对III型胶原的兔多克隆抗体(Rockland)的存在下对切片进行孵育，然后在偶联至荧光色素的抗大鼠第二抗体(Invitrogen)或偶联至荧光色素的抗兔第二抗体(Invitrogen)的存在下对切片进行孵育。然后，用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)检查真皮等同物切片。
[0195] 使用JMP软件(SAS)进行统计分析。
[0196] 结果：
[0197] 如图2所呈现的，结果显示，与不含SKP细胞的未经处理的对照相比，在含有SKP细胞的未经处理的真皮等同物中I型胶原和III型胶原的新合成蛋白质的表达显著增加18％和23％。
[0198] 与含有SKP细胞的未经处理的对照相比，用根据实施例1获得的1％的协同提取物处理含有SKP细胞的真皮等同物样品分别引起I型前胶原和III型胶原增加25％和29％。
[0199] 结论：
[0200] 在含有SKP真皮干细胞的真皮等同物中施用根据实施例1获得的1％的协同提取物刺激了I型前胶原和III型胶原的表达。
[0201] 实施例4：在含有人成纤维细胞和SKP样细胞的真皮等同物中证明根据实施例1获得的协同提取物对皮肤收缩和III型胶原表达的活化作用
[0202] Wenzel等(Biology Open.1：516-526，2012)和Hill等(Plos One，2012年11月，第7卷，第11期，e50742)已经证明了在成体供体成纤维细胞上体外施加冷应激后，可将SKP样细胞分离。
[0203] 本研究的目的是，确定在含有成纤维细胞和SKP样细胞(获得自同一供体)的胶原的真皮等同物中根据实施例1获得的协同提取物对真皮等同物收缩和III型胶原表达的作用。
[0204] 真皮等同物的收缩是与成纤维细胞的收缩活动相关的过程，成纤维细胞与胶原微纤维结合，使它们沿同一个方向取向并使细胞外基质致密化。几天后直径稳定。从重构的真皮等同物开始进行免疫标记，以监测细胞外基质中特定蛋白质的合成。
[0205] 方案：从成体供体皮肤外植体提取人成纤维细胞。使这些培养的成纤维细胞的一部分经受冷应激(4℃，过夜)以产生SKP样细胞。此处，将由此获得的与SKP细胞具有相同特征的细胞称为“SKP样”。用在培养基中稀释至1/100的根据实施例1获得的协同提取物(即1％vol/vol)对该实验中使用的SKP样细胞进行处理6天(每天两次)。平行地，维持SKP样培养物不经处理以构成未经处理的SKP样对照。培养在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中进行。
[0206] 用I型牛胶原混合物(向其中加入以多细胞球体形式培养的SKP样细胞)制备真皮等同物。以1个球体相对于10000个成纤维细胞的比例包含SKP样细胞和成纤维细胞。将I型胶原/细胞的基质混合物分布在6孔板的孔中。一旦聚合，使真皮等同物在培养基中漂浮培养。以1％的浓度用根据实施例1获得的协同提取物对真皮等同物进行处理5天(每天两次)，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中保持。由于来自实施例1的提取物的干重为约10g/kg，以培养基重量的约0.01wt％对提取物进行测试。
[0207] 每天，对于每个条件下的3个真皮等同物，通过在培养物中拍摄照片来监测皮肤收缩(反映为真皮等同物直径的下降)，然后使用图像分析软件(Image J)进行定量。
[0208] 培养完成后，将组织用10％多聚甲醛固定，并在用乙醇和二甲苯(Shandon)连续洗浴后包埋在石蜡中。
[0209] 在厚度为4μm的切片上进行免疫标记。
[0210] 对于III型胶原，使切片经受微波暴露，然后用0.5％胰蛋白酶进行酶处理(37℃下15min；Zymed，Invitrogen)。饱和30min后，在特异性针对III型胶原的兔多克隆抗体(Rockland)的存在下对切片进行孵育，然后在偶联至荧光色素的抗兔第二抗体(Invitrogen)的存在下对切片进行孵育。然后，用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)检查真皮等同物切片。
[0211] 每个条件用Volocity图像分析软件(Improvision)分析三张照片。
[0212] 使用JMP软件(SAS)进行统计分析。
[0213] 结果：如图3所呈现的，结果显示，与含有SKP样细胞的未经处理的对照相比，用根据实施例1获得的1％的协同提取物处理的真皮等同物中III型胶原的蛋白质表达显著增加29％。
[0214] 如图4所呈现的，真皮等同物的直径分析显示，与含有SKP样细胞的未经处理的对照相比，在用根据实施例1获得的协同提取物处理4天后，真皮等同物的收缩性出现非常显著的增加。
[0215] 结论：在含有从成体供体成纤维细胞获得的真皮“干”细胞(SKP样细胞)的真皮等同物中施用根据实施例1获得的1％的协同提取物改善了组织的收缩性，并刺激了III型胶原的表达。
[0216] 实施例5：在含有人成纤维细胞和SKP样细胞的真皮等同物中证明根据实施例1获得的协同提取物对原弹性蛋白纤维合成的活化作用
[0217] 本研究的目的是，确定在含有成纤维细胞和SKP样细胞(获得自同一供体)的胶原的真皮等同物中根据实施例1获得的协同提取物对原弹性蛋白纤维合成的作用。从重构的真皮等同物开始进行免疫标记，以监测从成纤维细胞开始的原弹性蛋白纤维合成。
[0218] 方案：除了处理之外，按照与实施例5中详细说明的相同方案来制备含有成纤维细胞和SKP样细胞(获得自同一供体)的胶原的真皮等同物。实际上，用在培养基中稀释至1/100的根据实施例1获得的协同提取物(即1％vol/vol)对该实验中使用的SKP样细胞进行处理5天(每天两次)。以1％的浓度用根据实施例1获得的协同提取物对真皮等同物进行处理6天(每天两次)。由于实施例1中获得的提取物的干重为约10g/kg，以培养基重量的约
0.01wt％对提取物进行测试。
0.01wt％对提取物进行测试。
[0219] 培养完成后，将组织用10％多聚甲醛固定，并在用乙醇和二甲苯(Shandon)连续洗浴后包埋在石蜡中。
[0220] 在厚度为4μm的切片上进行免疫标记。
[0221] 通过用0.5％胰蛋白酶进行酶处理(37℃下15min；Zymed，Invitrogen)使切片经受暴露。饱和30min后，在特异性针对原弹性蛋白的兔多克隆抗体(Abcam)的存在下对切片进行孵育，然后在偶联至荧光色素的抗兔第二抗体(Invitrogen)的存在下对切片进行孵育。然后，用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)检查真皮等同物切片。
[0222] 每个条件分析10-12张照片。对具有强荧光的细胞数和总细胞数进行计数。
[0223] 使用JMP软件(SAS)进行统计分析。
[0224] 结果：如图5所呈现的，结果显示，与含有SKP样细胞的未经处理的对照相比，用根据实施例1获得的1％的协同提取物处理的真皮等同物中原弹性蛋白纤维的合成显著增加19％。
[0225] 结论：在含有从成体供体成纤维细胞获得的真皮“干”细胞(SKP样细胞)的真皮等同物中施用根据实施例1获得的1％的协同提取物改善了弹性纤维的合成。
[0226] 实施例6：证明根据实施例1获得的协同提取物对含有人成纤维细胞和SKP样细胞的真皮等同物的弹性性质的活化作用
[0227] 本研究的目的是，确定根据实施例1获得的协同提取物对含有成纤维细胞和SKP样细胞(获得自同一供体)的胶原的真皮等同物的弹性性质的作用。参照ballistometer BLS780(Monaderm)是用于确定皮肤弹性和硬度的设备。该设备提供有自动将测量值参数化的软件。
[0228] 方案：除了处理之外，按照与实施例4中详细说明的相同方案来制备含有成纤维细胞和SKP样细胞(获得自同一供体)的胶原的真皮等同物。实际上，用在培养基中稀释至1/100的根据实施例1获得的协同提取物(即1％vol/vol)对该实验中使用的SKP样细胞进行处理5天(每天两次)。以1％的浓度用根据实施例1获得的协同提取物对真皮等同物进行处理
10天(每天两次)。由于实施例1中获得的提取物的干重为约10g/kg，以培养基重量的约
0.01wt％对提取物进行测试。
10天(每天两次)。由于实施例1中获得的提取物的干重为约10g/kg，以培养基重量的约
0.01wt％对提取物进行测试。
[0229] 方法：将探针置于真皮等同物上。使球体从探针释放，以由设备预先确定的恒定的力渗透，并在皮肤表面上弹起。然后，球体在稳定前产生若干次振动。释放时球体的渗透深度(称为压痕)使得能够测量皮肤硬度。实际上，由球体造成的压痕越深，组织越软，因此皮肤硬度越低。第二个标准是连接所有峰顶部的曲线的斜率(称为α)，该斜率允许确定皮肤弹性。在皮肤弹性好的情况下，球体弹跳更多，因此斜率值更低。
[0230] 结果：如图6所呈现的，结果显示，与含有SKP样细胞的未经处理的对照相比，用根据实施例1获得的1％的协同提取物处理的真皮等同物的弹性显著增加19％。平行地，与对照相比，观察到真皮等同物的硬度显著下降17％。
[0231] 结论：在含有从成体供体成纤维细胞获得的真皮“干”细胞(SKP样细胞)的真皮等同物中施用根据实施例1获得的1％的协同提取物改善了真皮等同物的弹性性质和柔韧性。
[0232] 实施例7：含有本发明的协同提取物的化妆品组合物的实例
[0233] A-精华液
[0234] 成分(商品名/INCI) ％w/w供应商
[0235]
[0236] 制备方案：
[0237] 将水加入到主容器中。在温和均质化下加热。
[0238] 将Pemulen TR-2慢慢倒入水中并混合至完全再水化。保持温度为70℃-75℃。
[0239] 当聚合物完全混合、没有任何结块时，逐一加入防腐剂，混合。
[0240] 在第二容器中混合B相并加热至75℃。
[0241] 将B相加入到主容器中，同时进行均质化。
[0242] 冷却至60℃-65℃，并加入预混合的C相。
[0243] 冷却至40℃-45℃，并逐一加入D相的成分，在每次加入之间混合。
[0244] 在搅拌下冷却至室温(25℃)。
[0245] B-晚霜
[0246] 成分(商品名/INCI) ％w/w供应商[0247]
[0248] 方案：
[0249] 将水加入到主容器中，温和均质化。逐一加入A相的其余成分，并加热至70℃-75℃，同时混合。
[0250] 在第二容器中混合B相的成分并加热至75℃，同时混合。
[0251] 将B相(70℃-75℃)加入到A相(70℃-75℃)中，同时剧烈搅拌(10分钟)。开始冷却。
[0252] 在60℃-65℃下将C相洒(sprinkle)入混合物中。充分混合以获得聚合物的完全水合(任选地增加混合速度)。
[0253] 预混合D相；加入到混合物中并整体仔细混合，以获得均匀的混合物。混合物变得更粘稠。继续冷却。
[0254] 冷却至40℃，缓慢搅拌。逐一加入E相的成分，每次加入之间充分搅拌。
[0255] 在室温下加入F相。充分混合。在25℃停止。
[0256] C-排毒霜
[0257] 成分(商品名/INCI) ％w/w供应商
[0258]
[0259] 方案：
[0260] 将水加入到主容器中，温和均质化。加入Versene并混合直至完全溶解。加热至70℃-75℃。
[0261] 在第二容器中混合B相的成分并加热到70℃-75℃，同时混合。
[0262] 在75℃下在强烈搅拌下将B相加入到A相中(10分钟)。开始冷却。
[0263] 冷却至60℃-65℃，并逐一加入C相的成分，在每次加入之间混合。
[0264] 冷却至40℃-45℃，并逐一加入D相的成分，在每次加入之间混合。
[0265] 在缓慢搅拌的同时冷却至室温。在25℃停止。
[0266] 实施例8：证明根据实施例1获得的协同提取物对SKP样细胞中的标志物SOX2、OCT4和Nestin的蛋白质表达的活化作用
[0267] 本研究的目的是，确定根据实施例1获得的协同提取物对表征干细胞的蛋白质(SOX2、OCT4和Nestin)的表达的作用。
[0268] 为此，对包埋在石蜡中的SKP样细胞的小球(pellets)进行特异性标记。
[0269] 免疫标记方案：从人成纤维细胞(提取自成体供体皮肤外植体)分离SKP样细胞。用在培养基中稀释至1/100的根据实施例1的提取物(即1％vol/vol)对SKP样细胞进行处理2天(每天两次)。由于实施例1中获得的提取物的干重为约10g/kg，以培养基重量的约0.01wt％对提取物进行测试。培养在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中进行。
[0270] 在培养结束时，将SKP样细胞制备成细胞小球，用10％多聚甲醛固定，并在用乙醇和二甲苯(Shandon)连续洗浴后包埋在石蜡中。
[0271] 在厚度为4μm的切片上进行免疫标记。
[0272] 对于三种免疫标记，使切片在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6，Sigma)中在600W下经受微波暴露。饱和30min后，在特异性针对nestin的大鼠单克隆抗体(Abcam)、特异性针对OCT4或SOX2的兔多克隆抗体(Abcam)的存在下对切片进行孵育，然后在偶联至荧光色素的抗大鼠第二抗体(Invitrogen)或偶联至荧光色素的抗兔第二抗体(Invitrogen)的存在下对切片进行孵育。然后，用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i显微镜)检查SKP样细胞切片。
[0273] 结果：
[0274] 显微镜观察(放大倍数*40)显示，与未经处理的情况相比，在施用根据实施例1获得的协同提取物的情况下，SOX2、OCT4和Nestin标记的强度增加。图7再现了针对SOX2和Nestin标记所获得的照片。
[0275] 结论：
[0276] 在SKP样细胞中施用根据实施例1获得的1％的协同提取物刺激了SOX2、OCT4和Nestin干细胞标志物的表达。
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