一种用于癌胚抗原检测的电致化学发光方法及其试剂盒
专利汇可以提供一种用于癌胚抗原检测的电致化学发光方法及其试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种用于癌胚 抗原 检测的电致 化学发光 方法及其 试剂 盒 。本发明以癌胚抗原为检测对象，将高量子产率金纳米团簇电致化学发光技术和免疫分析技术有机结合，采用还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二 氧 化锰 纳米材料 作为电致化学发光猝灭剂，利用酶联免疫反应产生的 抗坏血酸 与二氧化锰的 氧化还原反应 恢复电致化学发光 信号 ，由此发展一种基于高量子产率金纳米团簇探针的高性能电致化学发光癌胚抗原检测新方法及检测试剂盒。本发明对癌胚抗原检测线性范围为3×10‑5 ng/mL~3 ng/mL， 检测限 为27 fg/mL。具有快速、准确、灵敏度高、选择性和 稳定性 好、样品用量少等特点，具有较好的临床应用前景。，下面是一种用于癌胚抗原检测的电致化学发光方法及其试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；
在空白酶标板固定癌胚抗原抗体，加入癌胚抗原，再加入生物素标记的癌胚抗原抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现癌胚抗原的检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法，其特征是所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L 、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4 V -2 V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5 min 1 h，得到电化~ ~
学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1 1 mol/L硼氢化钠溶液反应5 ~
min 30 min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
~
3.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法，其特征是所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：
（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1 V/V 的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1 V -0.5 V，时间为100 s 600 s，清洗，氮气吹干；
~ ~
（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500 μL 10 mmol/L 的KMnO4溶液加入到1.25 mL、0.1 mol/L、pH 6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5 mL后超声30 min，结束后12000 r.p.m离心10 min，用水洗3次，重新分散于2.5 mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5 μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。
4.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法，其特征是所述在空白酶标板固定癌胚抗原抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1 5 mg/mL pH 8.5的多巴胺溶液50 100 μL，于4 ℃反应~ ~
1 5 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1 0.5 mg/mL癌胚抗原抗体溶液，4 ℃孵~ ~
育8 12 h，漂洗；加入50 100 μL 1wt% 5wt% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5 2 h，洗~ ~ ~ ~
涤，拍干。
5.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法，其特征是所述加入癌胚抗原，再加入生物素标记的癌胚抗原体，形成夹心免疫复合物的方法为：在固定有癌胚抗原抗体酶标板的样品反应孔中加入样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min 60 min，洗涤，拍干；加入0.1 10 μg/mL生物素标记的癌胚~ ~
抗原抗体50 μL，37 ℃温育30 min 60 min，洗涤，拍干。
~
6.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法，其特征是所述加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的方法为：在形成夹心免疫复合物的酶标板孔中每孔分别加入50 μL的0.1 1 U/mL链霉~
亲和素-碱性磷酸酶和5 10 mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光~
反应，37 ℃温育30 min 60 min。
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7.根据权利要求1所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法，其特征是所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，施加一定的扫描电压，工作电极表面产生电致化学发光辐射，光电倍增管高压设置为600 800 V，检测电致化学发光辐射信号。
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8.根据权利要求1 7任一所述的一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光~
癌胚抗原检测方法，其特征是所述根据电致化学发光信号的改变实现癌胚抗原的检测为：
电极表面所采集的电致化学发光信号的电致化学发光强度值与癌胚抗原浓度的对数值在3×10-5 ng/mL 3 ng/mL的范围内呈线性关系，检测限为27 fg/mL。
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9.一种权利要求1-8任一所述的基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法的检测试剂盒，其特征在于，包括金纳米团簇溶液、二氧化锰纳米材料、癌胚抗原抗体固定酶标板、癌胚抗原标准品、生物素标记的癌胚抗原抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、洗涤液、电致化学发光测试电解质溶液。
10.根据权利要求9所述的基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光癌胚抗原检测方法的检测试剂盒，其特征为所述的癌胚抗原抗体固定酶标板为：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1 5 mg/mL pH 8.5的多巴胺溶液50 100 μL，于4 ℃反应1 5 h，反~ ~ ~
应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1 0.5 mg/mL癌胚抗原抗体溶液，4 ℃孵育8 12 h，~ ~
漂洗；加入50 100 μL 1wt% 5wt% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5 2 h，洗涤，拍干；
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所述洗涤液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液；所述的电致化学发光测试电解质溶液为含有过硫酸钾的缓冲溶液。
一种用于癌胚抗原检测的电致化学发光方法及其试剂盒
技术领域
背景技术
发明内容
学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1 1 mol/L硼氢化钠溶液反应5 ~
min 30 min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
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（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500 μL 10 mmol/L 的KMnO4溶液加入到1.25 mL、0.1 mol/L、pH 6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5 mL后超声30 min，结束后12000 r.p.m离心10 min，用水洗3次，重新分散于2.5 mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5 μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。
洗；加入50 100 μL 1wt% 5wt% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5 2 h，洗涤，拍干。
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磷酸酶和5 10 mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光反应，37 ℃温~
育30 min 60 min。
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拍干；再滴加0.1 0.5 mg/mL癌胚抗原抗体溶液，4 ℃孵育8 12 h，漂洗；加入50 100 μL ~ ~ ~
1wt% 5wt% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5 2 h，洗涤，拍干；所述洗涤液为磷酸盐缓~ ~
冲液或Tris-HCl缓冲溶液；所述的电致化学发光测试电解质溶液为含有过硫酸钾的缓冲溶液。
高量子产率金纳米团簇探针制备方法如下：
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加负电位电压（-1.4 V -2 V范围内），进行恒电位还原处理5 min 1 h，得到电化学发光金纳米团簇探针。
~ ~
探针修饰电极。
作电极表面产生的电致化学发光信号。
后用双蒸水冲洗干净，氮气吹干备用。
30 min，结束后12000 r.p.m离心10 min，用水洗3次，重新分散于2.5 mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液。取5 μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。
h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加0.01 0.5 mg/mL癌胚抗原抗体溶液，4 ℃孵育8~ ~
12 h，漂洗。加入50 200 μL 1% 5% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5 2 h，反应完成后~ ~ ~
洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入癌胚抗原标准溶液50 μL，在样品反应孔中加入50 μL样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 60 min，洗涤，拍干，再加入0.1 10 μg/mL生物素~ ~
标记的癌胚抗原抗体50 μL，37 ℃温育30 60 min，洗涤，拍干。每孔加入0.1 1 U/mL链霉亲~ ~
和素-碱性磷酸酶溶液50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 60 min，用10 mM pH=7.3 Tris-~
HCl 缓冲液洗涤，拍干。
mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液50 μL，再加入10 mM pH=8.0 Tris-HCl缓冲溶液50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光反应25 30 min。将上述二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入~
上述反应液中浸泡4~10 min，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。采集工作电极表面产生的电致化学发光信号，以电致化学发光信号对癌胚抗原浓度作图绘制标准曲线。
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附图说明
具体实施方式
1制备的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰电极。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图1）。
1制备的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。采用三电极体系，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用计时电流法，在KMnO4-H2SO4（1:1 V/V）溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.2 V，沉积时间为300 s，所得到的电极为二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极，之后用双蒸水冲洗干净，N2气轻轻吹干备用。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图2）。
10 min，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到的电化学发光信号比未加癌胚抗原的溶液明显增大（图3）。
30 min），轻轻振荡混匀，37 ℃温育45 min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8 mmol/L的
2-酸磷-L-抗坏血酸三钠盐溶液50 μL（37 ℃预热30 min），再加入pH=8.0 Tri-Hcl 50 μL，轻轻振荡混匀，37℃避光反应25 min。将各个孔中的液体取出，加入2 mL 的EP管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度EP管中浸泡10 min。取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，在癌胚抗原浓度为3×10-5 ng/mL 3 ng/mL的范围内癌胚抗原浓度的对数值与电致化学发光强度值呈~
良好的线性关系，检测限为27 fg/mL（见图4）。
1 h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入不同浓度的癌胚抗原标准溶液50 μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min，洗涤，拍干，再加入0.5 μg/mL生物素标记的癌胚抗原抗体50 μL，37 ℃温育30 min，洗涤，拍干。每孔加入0.2 U/mL的链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50 μL（37 ℃预热30 min），轻轻振荡混匀，37 ℃温育45 min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8 mmol/L的2-酸磷-L-抗坏血酸三钠盐溶液50 μL（37 ℃预热30 min），再加入pH=8.0 Tri-Hcl 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光反应25 min。（3）将各个孔中的液体取出，加入2 mL的EP管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度EP管中浸泡10 min。取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，在癌胚抗原浓度为3×10-5 ng/mL 3 ng/mL的范围内癌胚抗原浓度的对数~
值与电致化学发光强度变化值呈良好的线性关系，检测限为27 fg/mL。
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