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eIFiso4G1蛋白在调控 植物抗旱性中的应用

阅读：1009发布：2020-05-13

专利汇可以提供eIFiso4G1蛋白在调控植物抗旱性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了eIFiso4G1蛋白在调控植物抗旱性中的应用。本发明要求保护用于抑制植物中特定基因表达的物质的应用：调控植物的抗旱性；选育抗旱性提高的植物品种。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中特定基因表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗旱性提高。所述特定基因为编码eIFiso4G1蛋白的基因。本发明的发明人发现，敲除eIFiso4G1基因可以使植物对干旱的耐受性显著增强。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐旱分子机制、改良遗传特性，提高作物对自然气候灾害和不良土壤环境的抗逆性，培育高效耐旱新品种等方面具有重要的实用价值和市场前景。，下面是eIFiso4G1蛋白在调控植物抗旱性中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于抑制植物中特定基因表达的物质的应用，为如下(c1)或(c2)：
(c1)调控植物的抗旱性；
(c2)选育抗旱性提高的植物品种；
所述特定基因为编码eIFiso4G1蛋白的基因；
所述eIFiso4G1蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对脱落酸的耐受性相关的由其衍生的蛋白质；
(a3)来源于拟南芥且与(a1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、
85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(a4)在(a1)或(a2)或(a3)限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
2.eIFiso4G1蛋白的应用，为如下(d1)或(d2)：
(d1)调控植物的抗旱性；
(d2)选育抗旱性降低的植物品种；
eIFiso4G1蛋白为权利要求1中所述的eIFiso4G1蛋白。
3.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中特定基因表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗旱性提高；所述特定基因为权利要求
1中所述的特定基因。
4.一种植物育种方法，包括如下步骤：降低受体植物中eIFiso4G1蛋白的含量和/或活性，从而提高植物的抗旱性；eIFiso4G1蛋白为权利要求1中所述的eIFiso4G1蛋白。
5.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物导入编码eIFiso4G1蛋白的基因并使其表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗旱性降低；
eIFiso4G1蛋白为权利要求1中所述的eIFiso4G1蛋白。
6.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加受体植物中eIFiso4G1蛋白的含量和/或活性，从而降低植物的抗旱性；eIFiso4G1蛋白为权利要求1中所述的eIFiso4G1蛋白。
7.如权利要求1所述的应用，或，如权利要求3所述的方法，或，如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述编码eIFiso4G1蛋白的基因为如下(1)至(5)中任一所述的DNA分子：
(1)编码区如序列表中序列2自5’末端第256-2598位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)序列表中序列3所示的DNA分子；
(4)在严格条件下与(1)至(3)中任一所述DNA分子杂交且编码所述eIFiso4G1蛋白的DNA分子；
(5)来源于拟南芥且与(1)至(3)中任一所述DNA分子具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述eIFiso4G1蛋白的DNA分子。
8.如权利要求1或2所述的应用，或，如权利要求3至6中任一所述的方法，其特征在于：
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

说明书全文

eIFiso4G1蛋白在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及eIFiso4G1蛋白在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

[0002] 陆生植物在整个生长发育阶段都有可能受到外界多种逆境胁迫的影响，其中干早、盐碱、低温、高温等非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫显著影响植物生长和作物产量。有关植物抗逆性的研究一直是植物学领域研究的热点。传统的育种技术培育和改良耐胁迫性状难度相对较大，不能很好的得到优良的抗旱品种。而随着分子生物学技术的发展，以及对植物抗逆分子机制的深入研究，植物抗逆基因工程取得了重大进展。采用转基因等基因工程手段向植物导入抗逆性外源基因已成为改良植物抗逆性的新途径之一。研究植物抗逆分子调控网络以及培养出更多优良抗旱品种具有非常广阔的应用前景和十分重要的农业生产意义。

[0003] 植物对逆境的适应过程涉及到多种信号传导途径，植物激素可能作为启动抗逆基因表达的关键因素。脱落酸(abscisic acid，ABA)作为最重要的植物激素之一，广泛地参与了调控植物生长发育的各个阶段，包括种子萌发、幼苗生长、气孔运动、以及由营养生长向生殖生长转换等多个方面。同时，ABA在植物抵抗外界各种逆境胁迫过程中起着重要作用，尤其是在盐、干旱、低温以及渗透胁迫等过程中发挥着非常重要的作用。植物细胞中的ABA信号转导过程始于受体对ABA信号的感知，进而通过极其复杂的ABA信号转导网络通过级联反应向下传递，最终诱发植物对ABA的应答响应，从而帮助植物抵抗各种逆境胁迫。最近几十年来，各个科研独立小组利用各种遗传学、生物化学以及化学遗传等实验方法鉴定出许多参与ABA信号转导的重要调节因子，进而加深了人们对复杂的ABA信号转导途径的理解。

[0004] 随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的ABA信号通路中的正负调节子来改变农作物对干旱胁迫的耐受性，如何培育高效抗旱新品种来提高农作物的产量成为研究前沿。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供eIFiso4G1蛋白在调控植物抗旱性中的应用。

[0006] 本发明要求保护用于抑制植物中特定基因表达的物质的应用，为如下(c1)或(c2)：

[0007] (c1)调控植物的抗旱性；

[0008] (c2)选育抗旱性提高的植物品种；

[0009] 所述特定基因为编码eIFiso4G1蛋白的基因。

[0010] 抑制植物中特定基因表达的物质可为：通过RNAi抑制特定基因表达的物质、通过敲除特定基因的部分抑制特定基因表达的物质、通过敲除特定基因的全部抑制特定基因表达的物质、通过取代特定基因中的部分区段抑制特定基因表达的物质、通过插入若干核苷酸抑制特定基因表达的物质、通过基因编辑抑制特定基因表达的物质等。

[0011] 所述调控植物抗旱性具体体现为：eIFiso4G1蛋白的表达量越低，则所述植物的抗旱性越强。

[0012] 选育植物品种时，可先抑制受体植物中特定基因表达从而得到转基因植物，然后将转基因植物作为亲本进行自交或者与其它品种的植物杂交。

[0013] 本发明还保护eIFiso4G1蛋白的应用，为如下(d1)或(d2)：

[0014] (d1)调控植物的抗旱性；

[0015] (d2)选育抗旱性降低的植物品种。

[0016] 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中特定基因表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗旱性提高；所述特定基因为编码eIFiso4G1蛋白的基因。抑制植物中特定基因表达的实现方式包括但不限于：通过RNAi抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的部分抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的全部抑制特定基因表达、通过取代特定基因中的部分区段抑制特定基因表达、通过插入若干核苷酸抑制特定基因表达、通过基因编辑抑制特定基因表达等。

[0017] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低受体植物中eIFiso4G1蛋白的含量和/或活性，从而提高植物的抗旱性。

[0018] 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物导入编码eIFiso4G1蛋白的基因并使其表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗旱性降低。

[0019] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加受体植物中eIFiso4G1蛋白的含量和/或活性，从而降低植物的抗旱性。

[0020] 以上任一所述eIFiso4G1蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

[0021] (a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

[0022] (a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对脱落酸的耐受性相关的由其衍生的蛋白质；

[0023] (a3)来源于拟南芥且与(a1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

[0024] (a4)在(a1)或(a2)或(a3)限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

[0025] 标签具体如表1所示。

[0026] 表1标签的序列

[0027]标签残基序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA

[0028] 以上任一所述编码eIFiso4G1蛋白的基因为如下(1)至(5)中任一所述的DNA分子：

[0029] (1)编码区如序列表中序列2自5’末端第256-2598位核苷酸所示的DNA分子；

[0030] (2)序列表中序列2所示的DNA分子；

[0031] (3)序列表中序列3所示的DNA分子；

[0032] (4)在严格条件下与(1)至(3)中任一所述DNA分子杂交且编码所述eIFiso4G1蛋白的DNA分子；

[0033] (5)来源于拟南芥且与(1)至(3)中任一所述DNA分子具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述eIFiso4G1蛋白的DNA分子。

[0034] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0035] 以上任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

[0036] 所述双子叶植物进一步可为十字花科植物。

[0037] 所述十字花科植物更具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

[0038] 本发明的发明人通过研究发现，敲除eIFiso4G1基因可以使植物对干旱的耐受性显著增强。因此，可利用eIFiso4G1蛋白调节植物对干旱胁迫的耐受性。本发明可通过基因工程手段敲除eIFiso4G1基因，或者抑制eIFiso4G1基因的表达，获得eIFiso4G1基因低表达或不表达的抗干旱的转基因作物。另外，还可将其作为一种研究其它具有调控重要农业性状的功能基因调控作物抗旱性研究的生长模型，从而有助于深入阐明ABA信号通路中重要的正负调节子调控植物对干旱胁迫的耐受性的分子机制，从而为实际农业生产提供理论支持。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐旱分子机制、改良遗传特性，提高作物对自然气候灾害和不良土壤环境的抗逆性，培育高效耐旱新品种等方面具有重要的实用价值和市场前景。附图说明

[0039] 图1为突变体ei4g1-1中T-DNA插入位置的示意图。

[0040] 图2为哥伦比亚生态型拟南芥植株和突变体ei4g1-1的后代植株中eIFiso4G1基因的mRNA相对表达水平。

[0041] 图3为ABA抑制气孔开放实验的结果。

[0042] 图4为ABA促进气孔关闭实验的结果。

[0043] 图5为干旱实验中的植株照片。

[0044] 图6为干旱实验中的存活率结果。

具体实施方式

[0045] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0046] 拟南芥生物研究中心，即Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。

[0047] 哥伦比亚生态型拟南芥，又称野生型拟南芥，用Col-0或WT表示：拟南芥生物研究中心。哥伦比亚生态型拟南芥中，eIFiso4G1蛋白如序列表的序列1所示(由780个氨基酸残基组成)。哥伦比亚生态型拟南芥的cDNA中，编码eIFiso4G1蛋白的基因如序列表的序列2所示(由2980个核苷酸组成，其中第256-2598位核苷酸为开放阅读框)。哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA中，编码eIFiso4G1蛋白的基因如序列表的序列3所示(由4316个核苷酸组成)。

[0048] 实施例1、突变体的获得和鉴定

[0049] 一、突变体ei4g1-1的获得

[0050] 从拟南芥生物研究中心商购编号为SALK_098730的拟南芥种子(背景为哥伦比亚生态型拟南芥，为T-DNA插入突变体)，培育为植株。提取幼苗期植株的基因组DNA，分别用ei4g1-1LP和ei4g1-1RP组成的引物对以及LBb1.3和ei4g1-1RP组成的引物对进行PCR鉴定。如果采用ei4g1-1LP和ei4g1-1RP组成的引物对未检测到扩增产物，并且，采用LBb1.3和ei4g1-1RP组成的引物对可以检测到扩增产物，证明该植株为两条染色体一致的纯合突变体。将纯合突变体进行测序验证。

[0051] ei4g1-1LP：5'-TCAAGGGCAAACATATCATCC-3'；

[0052] ei4g1-1RP：5'-TTTTGACTTCACGTTTCCGTC-3'；

[0053] LBb1.3：5’-TTGCCGATTTCGGAAC-3’。

[0054] 经过上述步骤，筛选到的的一株纯合突变体植株，命名为突变体ei4g1-1。与哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA相比，突变体ei4g1-1的差异仅在于在eIFiso4G1基因的第7外显子区域插入了T-DNA。示意图见图1。

[0055] 二、突变体ei4g1-1的后代植株的获得

[0056] 突变体ei4g1-1，自交并收获种子，即为突变体ei4g1-1的种子。

[0057] 突变体ei4g1-1，自交并收获种子，将种子培育为植株，即为突变体ei4g1-1的后代植株。

[0058] 三、eIFiso4G1基因的表达水平

[0059] 供试植株分别为：哥伦比亚生态型拟南芥植株，突变体ei4g1-1的后代植株。

[0060] 每种供试植株均设置3个生物学重复。

[0061] 提取供试植株(在培养基中生长14天的幼苗)的总RNA，反转录得到cDNA，利用实时荧光定量PCR检测eIFiso4G1基因的表达水平(以Actin2/8作为内参基因；采用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪)。

[0062] 用于检测eIFiso4G1基因的引物如下：

[0063] eIFiso4G1-RT-F1：5'-TTGGCAAACAACTTGACGGAAAC-3'；

[0064] eIFiso4G1-RT-R1：5'-TCGCCCACCAGGGTAGACAG-3'。

[0065] 用于检测内参基因的引物如下：

[0066] Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；

[0067] Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。

[0068] 荧光定量PCR的反应体系见表2。

[0069] 表2

[0070]试剂用量
2×SYBR Premix Ex Taq(TAKARA) 5μL
正向引物(20μM) 0.25μL
反向引物(20μM) 0.25μL
cDNA模板 0.5μL
ddH2O 补至10μL

[0071] 荧光定量PCR的反应程序见表3。

[0072] 表3

[0073]

[0074] 以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。

[0075] 以哥伦比亚生态型拟南芥植株中eIFiso4G1基因的mRNA相对表达水平为1.0。哥伦比亚生态型拟南芥植株和突变体ei4g1-1的后代植株中eIFiso4G1基因的mRNA相对表达水平见图2。图2中，突变体ei4g1-1的后代植株用ei4g1-1表示。突变体ei4g1-1的后代植株中未检测到eIFiso4G1基因的mRNA。

[0076] 实施例2、植株对干旱胁迫的抗性

[0077] 一、ABA促进气孔关闭和抑制气孔开放实验

[0078] ABA是植物抵抗外界逆境胁迫的重要信号分子。在干旱条件下，ABA能够通过调节气孔保卫细胞的离子通道促进气孔关闭以减少水分流失。钙离子、蛋白激酶、磷酸酶等均参与ABA介导的保卫细胞信号转导及ABA相关抗逆基因的信号调控。因此利用ABA诱导气孔运动实验检测eIFiso4G1蛋白在ABA调控植株干旱胁迫响应的过程中是否发挥作用。

[0079] 表皮条缓冲液：含50mM KCl、10mM的MES-KOH(pH 6.15)。

[0080] 冷光源下培养的光强为200μM Photons m-2s-1。

[0081] 1、ABA抑制气孔开放实验

[0082] 供试植株为：哥伦比亚生态型拟南芥植株，突变体ei4g1-1的后代植株。

[0083] 在营养土中生长三周左右的供试植株，先黑暗条件培养3h以使叶片气孔全部关闭，然后取气孔关闭程度一致的离体莲座叶叶片(此时测量气孔孔径，作为0时刻气孔孔径)。

[0084] 第一组：将离体莲座叶叶片完全浸泡于表皮条缓冲液中在冷光源下培养2h；第二组：将离体莲座叶叶片完全浸泡于含20μM ABA的表皮条缓冲液中在冷光源下培养2h。完成培养后测量气孔孔径，作为2h时刻气孔孔径。

[0085] 进行三次重复试验，每次重复试验中每种供试植株设置10株生物学重复。

[0086] 结果见图3。在不含ABA的表皮条缓冲液中，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，突变体ei4g1-1的后代植株的叶片的气孔孔径无显著差异。在含有ABA的表皮条缓冲液中，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，突变体ei4g1-1的后代植株的叶片的气孔孔径显著减小。结果表明，敲除eIFiso4G1基因可以增加植株对ABA的敏感性。

[0087] 2、ABA促进气孔关闭实验

[0088] 供试植株为：哥伦比亚生态型拟南芥植株，突变体ei4g1-1的后代植株。

[0089] 在营养土中生长三周左右的供试植株，取离体莲座叶叶片，完全浸泡于表皮条缓冲液中在冷光源下培养3h以使叶片气孔完全打开，然后取叶片(此时测量气孔孔径，作为0时刻气孔孔径)。

[0090] 第一组：将叶片完全浸泡于表皮条缓冲液中在冷光源下培养2h；第二组：将叶片完全浸泡于含20μM ABA的表皮条缓冲液中在冷光源下培养2h。完成培养后测量气孔孔径，作为2h时刻气孔孔径。

[0091] 进行三次重复试验，每次重复试验中每种供试植株设置10株生物学重复。

[0092] 结果见图4。在不含ABA的表皮条缓冲液中，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，突变体ei4g1-1的后代植株的叶片的气孔孔径无显著差异。在含有ABA的表皮条缓冲液中，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，突变体ei4g1-1的后代植株的叶片的气孔孔径显著减小。结果表明，敲除eIFiso4G1基因可以增加植株对ABA的敏感性。

[0093] 二、干旱实验

[0094] 供试植株为：哥伦比亚生态型拟南芥植株，突变体ei4g1-1的后代植株。

[0095] 试验组：将在培养基中生长14天左右的供试植株幼苗移栽至土壤，先正常浇水一周，然后干旱处理(即持续不浇水)3-4周，然后恢复浇水。对照组：将在培养基中生长14天左右的供试植株幼苗移栽至土壤，持续正常浇水。正常浇水，即一周浇水2次。

[0096] 进行三次重复试验，每次重复试验中每种供试植株设置50株生物学重复。

[0097] 试验组干旱处理结束时植株的照片见图5B。突变体ei4g1-1的后代植株的生长状况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥，即突变体ei4g1-1的后代植株对干旱胁迫的敏感性降低，表现出抗旱性。

[0098] 与试验组干旱处理结束时平行时间的对照组植株的照片见图5A。突变体ei4g1-1的后代植株的生长状况与哥伦比亚生态型拟南芥植株相比无显著差异。

[0099] 试验组恢复浇水3天后的植株照片见图5C。突变体ei4g1-1的后代植株的生长状况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥，即突变体ei4g1-1的后代植株对干旱胁迫的敏感性降低，表现出抗旱性。

[0100] 恢复浇水3天后，统计试验组的植株存活率，以及平行时间的对照组植株的存活率。结果见图6。干旱处理后，突变体ei4g1-1的后代植株的存活率显著高于哥伦比亚生态型拟南芥。

[0101] 本发明可通过基因工程手段敲除eIFiso4G1基因，或者抑制eIFiso4G1基因的表达，从而得到对干旱胁迫抗性增强的转基因植株。另外，还可将其作为一种研究其它具有调控重要农业性状的功能基因调控作物抗旱性研究的生长模型，从而有助于深入阐明ABA信号通路中重要的正负调节子调控植物对干旱胁迫的耐受性的分子机制，从而为实际农业生产提供理论支持。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐旱分子机制、改良遗传特性，培育高效耐旱新品种等方面具有重要的实用价值和市场前景。

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