技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体涉及eIFiso4G2蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用。
背景技术
[0002] 脱落酸(Abscisic Acid，ABA)是植物体内重要的
激素之一，其在植物生长发育的各阶段都发挥了重要作用，包括
种子休眠、萌发，
幼苗生长，气孔运动，以及营养生长向生殖生长转换等过程。同时，ABA在植物应对外界各种逆境胁迫响应中起着重要的作用，例如干旱、低温、高温、盐、机械伤害等
非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫。因此植物ABA
信号转导通路分子机制的阐明对调控植物生长、提高作物品质、改良遗传特性、促进现代农业生产发展具有重要的意义。
[0003] 植物体内ABA信号转导网络极其复杂。近年来，植物中ABA受体及其信号转导功能组分的筛选与鉴定、ABA生物代谢及转运以及ABA信号转导通路模型的构建及与其它植物激素间的交叉对话等研究均取得了重要进展，有
力地推动了植物中ABA信号转导调控机理的阐明。到目前为止，研究人员分别鉴定出了三种不同的ABA受体或候选受体：镁螯合酶H亚基CHLH/ABAR、START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体以及G蛋白偶联受体GTG1、GTG2；除此之外一些跟ABA信号转导有关的ABA响应基因也被鉴定出来。这些ABA响应基因既包括正调节子也包括负调节子，如各类转录因子、蛋白激酶、
磷酸酶以及部分第二信使(
钙离子信号、环核苷酸、
活性氧、磷脂类)等，这些ABA受体以及响应基因的发现加深了人们对ABA作用机制的认识，对现代农业生产发展具有重要的应用价值。
[0004] 此外，在植物生长发育过程中，各种逆境胁迫严重影响了种子的正常萌发和幼苗的生长，从而降低了作物的产量及品质。在农业生产中，
水稻、小麦、油菜、玉米等禾本科植物在
收获时如遇连续下雨，种子收获前会出现穗发芽的胎萌现象。而种子的胎萌现象取决于种子的休眠特性，ABA是种子休眠的主导因素，对ABA反应不敏感可导致种子胎萌的发生。胎萌消耗其部分营养和贮藏物质，致使种子的食用品质、贮藏品质下降，给农业生产造成了较大的损失。因此，减少
农作物种子在收获时的穗发芽成为了植物抗逆境胁迫机理研究和农业生产上的重要课题，从而有助于提高种子产量、品质，为抗逆性状改良提供有效的解决手段和方法。
[0005] 随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的ABA信号通路中的正负调节子改变农作物种子萌发和萌发后幼苗生长发育对ABA的耐受性成为目前研究的热点。研究植物对ABA耐受性的调控网络对于培育出更多优良的抗逆品种具有非常广阔的应用前景和十分重要的农业生产意义。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供eIFiso4G2蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用。
[0007] 本发明要求保护用于抑制植物中特定基因表达的物质的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)或(c5)或(c6)或(c7)或(c8)：
[0008] (c1)调控植物对脱落酸的耐受性；
[0009] (c2)选育对脱落酸耐受性降低(耐受性降低，即敏感性提高，或称为不耐受性提高)的植物品种；
[0010] (c3)调控植物的胎萌抗性；
[0011] (c4)选育胎萌抗性增高(胎萌抗性增高，即发生胎萌现象的种子变少)的植物品种；
[0012] (c5)调控植物种子在脱落酸环境中的萌发特性；
[0013] (c6)选育种子在脱落酸环境中萌发延迟的植物品种；
[0014] (c7)调控植物在脱落酸环境中的根生长特性；
[0015] (c8)选育在脱落酸环境中根生长受到抑制的植物品种；
[0016] 所述特定基因为编码eIFiso4G2蛋白的基因。
[0017] 抑制植物中特定基因表达的物质可为：通过RNAi抑制特定基因表达的物质、通过敲除特定基因的部分抑制特定基因表达的物质、通过敲除特定基因的全部抑制特定基因表达的物质、通过取代特定基因中的部分区段抑制特定基因表达的物质、通过插入若干核苷酸抑制特定基因表达的物质、通过基因编辑抑制特定基因表达的物质等。
[0018] 所述调控植物对脱落酸的耐受性具体体现为：植物胎萌和萌发后幼苗生长对ABA的耐受性随着eIFiso4G2蛋白的表达量的调低而降低。
[0019] 选育植物品种时，可先抑制受体植物中特定基因表达从而得到转基因植物，然后将转基因植物作为亲本进行自交或者与其它品种的植物杂交。
[0020] 本发明还保护eIFiso4G2蛋白的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)或(d7)或(d8)：
[0021] (d1)调控植物对脱落酸的耐受性；
[0022] (d2)选育对脱落酸耐受性提高的植物品种；
[0023] (d3)调控植物的胎萌抗性；
[0024] (d4)选育胎萌抗性降低(胎萌抗性降低，即发生胎萌现象的种子变多)的植物品种；
[0025] (d5)调控植物种子在脱落酸环境中的萌发特性；
[0026] (d6)选育种子在脱落酸环境中萌发提早的植物品种；
[0027] (d7)调控植物在脱落酸环境中的根生长特性；
[0028] (d8)选育在脱落酸环境中根生长受到促进的植物品种。
[0029] 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中特定基因表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物对脱落酸的耐受性降低；所述特定基因为编码eIFiso4G2蛋白的基因。抑制植物中特定基因表达的实现方式包括但不限于：通过RNAi抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的部分抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的全部抑制特定基因表达、通过取代特定基因中的部分区段抑制特定基因表达、通过插入若干核苷酸抑制特定基因表达、通过基因编辑抑制特定基因表达等。
[0030] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低受体植物中eIFiso4G2蛋白的含量和/或活性，从而降低植物对脱落酸的耐受性。
[0031] 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中特定基因表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的胎萌抗性增高；所述特定基因为编码eIFiso4G2蛋白的基因。抑制植物中特定基因表达的实现方式包括但不限于：通过RNAi抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的部分抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的全部抑制特定基因表达、通过取代特定基因中的部分区段抑制特定基因表达、通过插入若干核苷酸抑制特定基因表达、通过基因编辑抑制特定基因表达等。
[0032] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低受体植物中eIFiso4G2蛋白的含量和/或活性，从而提高植物的胎萌抗性(即发生胎萌现象的种子变少)。
[0033] 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制受体植物中特定基因表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的种子在脱落酸环境中萌发延迟和/或所述转基因植物在脱落酸环境中主根生长受到抑制；所述特定基因为编码eIFiso4G2蛋白的基因。抑制植物中特定基因表达的实现方式包括但不限于：通过RNAi抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的部分抑制特定基因表达、通过敲除特定基因的全部抑制特定基因表达、通过取代特定基因中的部分区段抑制特定基因表达、通过插入若干核苷酸抑制特定基因表达、通过基因编辑抑制特定基因表达等。
[0034] 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物导入编码eIFiso4G2蛋白的基因并使其表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物对脱落酸的耐受性增高。
[0035] 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物导入编码eIFiso4G2蛋白的基因并使其表达，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的胎萌抗性降低(即发生胎萌现象的种子变多)。
[0036] 以上任一所述eIFiso4G2蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
[0037] (a1)
序列表中序列1所示的
蛋白质；
[0038] (a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个
氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对脱落酸的耐受性相关的由其衍生的蛋白质；
[0039] (a3)来源于拟南芥且与(a1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
[0040] (a4)在(a1)或(a2)或(a3)限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
[0041] 标签具体如表1所示。
[0042] 表1标签的序列
[0043]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA
[0044] 以上任一所述编码eIFiso4G2蛋白的基因为如下(1)至(5)中任一所述的DNA分子：
[0045] (1)编码区如序列表中序列2自5’末端第243-2486位核苷酸所示的DNA分子；
[0046] (2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0047] (3)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0048] (4)在严格条件下与(1)至(3)中任一所述DNA分子杂交且编码所述eIFiso4G2蛋白的DNA分子；
[0049] (5)来源于拟南芥且与(1)至(3)中任一所述DNA分子具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述eIFiso4G2蛋白的DNA分子。
[0050] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0051] 以上任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。
[0052] 所述双子叶植物进一步可为十字花科植物。
[0053] 所述十字花科植物更具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
[0054] 本发明的
发明人通过研究发现eIFiso4G2蛋白是ABA信号传导中重要的负调节子。敲除eIFiso4G2基因可以使植物的种子萌发率和萌发后幼苗生长对ABA的耐受性显著降低。
本发明可通过基因工程手段敲除eIFiso4G2基因，或者抑制eIFiso4G2基因的表达，获得eIFiso4G2基因低表达或不表达的抗胎萌转基因作物，从而能够很好的抑制种子过早萌发，减少胎萌所消耗的营养和贮藏物质，使种子食用品质、贮藏品质和种子
质量提高，给作物生产提高更大的经济利益。另外，还可将其作为一种研究其它具有调控重要农业性状的功能基因调控农作物对ABA耐受性研究的生长模型，从而有助于深入阐明ABA信号通路中正负调节子调控植物对ABA耐受性的分子机制，从而为实际农业生产提供理论支持。本发明符合
可持续农业发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、改良农作物遗传特性，培育高效耐受ABA和逆境胁迫新品种等方面具有重要的实用价值和市场前景。
附图说明
[0055] 图1为突变体ei4g2-1中T-DNA插入
位置的示意图。
[0056] 图2为哥伦比亚生态型拟南芥植株和突变体ei4g2-1的后代植株中eIFiso4G2基因的mRNA相对表达水平。
[0057] 图3为种子萌发实验的结果。
[0058] 图4为幼苗生长实验中各组植株群体的照片。
[0059] 图5为幼苗生长实验中各组代表性植株的单株照片。
[0060] 图6为幼苗生长实验中各组的主根根长平均值。
具体实施方式
[0061] 以下的
实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化
试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0062] 拟南芥生物研究中心，即Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。
[0063] 哥伦比亚生态型拟南芥，又称野生型拟南芥，用Col-0或WT表示：拟南芥生物研究中心。哥伦比亚生态型拟南芥中，eIFiso4G2蛋白如序列表的序列1所示(由747个氨基酸残基组成)。哥伦比亚生态型拟南芥的cDNA中，编码eIFiso4G2蛋白的基因如序列表的序列2所示(由2761个核苷酸组成，其中第243-2486位核苷酸为开放阅读框)。哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA中，编码eIFiso4G2蛋白的基因如序列表的序列3所示(由3474个核苷酸组成)。
[0064] 实施例1、转基因植物的获得及鉴定
[0065] 一、突变体ei4g2-1的获得
[0066] 从拟南芥生物研究中心商购编号为SALK_076633的拟南芥种子(背景为哥伦比亚生态型拟南芥，为T-DNA插入突变体)，培育为植株。提取幼苗期植株的基因组DNA，分别用ei4g2-1 LP和ei4g2-1 RP组成的引物对以及LBb1.3和ei4g2-1 RP组成的引物对进行PCR鉴定。如果采用ei4g2-1 LP和ei4g2-1 RP组成的引物对未检测到扩增产物，并且，采用LBb1.3和ei4g2-1 RP组成的引物对可以检测到扩增产物，证明该植株为两条
染色体一致的纯合突变体。将纯合突变体进行测序验证。
[0067] ei4g2-1 LP：5'-ATGCAACAACAAGGTGAACC-3'；
[0068] ei4g2-1 RP：5'-AAGAAGCTCGTACTTCTCCGG-3'；
[0069] LBb1.3：5’-TTGCCGATTTCGGAAC-3’。
[0070] 经过上述步骤，筛选到的的一株纯合突变体植株，命名为突变体ei4g2-1。与哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA相比，突变体ei4g2-1的差异仅在于在eIFiso4G2基因的第4外显子区域插入了T-DNA。示意图见图1。
[0071] 二、突变体ei4g2-1的后代植株的获得
[0072] 突变体ei4g2-1，自交并收获种子，即为突变体ei4g2-1的种子。
[0073] 突变体ei4g2-1，自交并收获种子，将种子培育为植株，即为突变体ei4g2-1的后代植株。
[0074] 三、eIFiso4G2基因的表达水平
[0075] 供试植株分别为：哥伦比亚生态型拟南芥植株，突变体ei4g2-1的后代植株。
[0076] 每种供试植株均设置3个生物学重复。
[0077] 提取供试植株(在培养基中生长14天的幼苗)的总RNA，反转录得到cDNA，利用实时
荧光定量PCR检测eIFiso4G2基因的表达水平(以Actin2/8作为内参基因；采用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪)。
[0078] 用于检测eIFiso4G2基因的引物如下：
[0079] eIFiso4G2-RT-F1：5'-GTAAAGAATGGTTAAGGGACG-3'；
[0080] eIFiso4G2-RT-R1：5'-TCAGAGGGAAACGAAGGTAG-3'。
[0081] 用于检测内参基因的引物如下：
[0082] Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
[0083] Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
[0084] 荧光定量PCR的反应体系见表2。
[0085] 表2
[0086]试剂 用量
2×SYBR Premix Ex Taq(TAKARA) 5μL
正向引物(20μM) 0.25μL
反向引物(20μM) 0.25μL
cDNA模板 0.5μL
ddH2O 补至10μL
[0087] 荧光定量PCR的反应程序见表3。
[0088] 表3
[0089]
[0090] 以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧
光信号达到设定
阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。
[0091] 以哥伦比亚生态型拟南芥植株中eIFiso4G2基因的mRNA相对表达水平为1.0。哥伦比亚生态型拟南芥植株和突变体ei4g2-1的后代植株中eIFiso4G2基因的mRNA相对表达水平见图2。图2中，突变体ei4g2-1的后代植株用ei4g2-1表示。突变体ei4g2-1的后代植株中未检测到eIFiso4G2基因的mRNA。
[0092] 实施例2、植株对ABA的耐受性
[0093] 一、种子萌发实验
[0094] ABA在促进种子休眠、抑制种子萌发中发挥重要调节作用。遗传学研究表明，种子萌发过程中发生的染色质重建及组蛋白甲基化、去乙酰化等过程均受ABA调节。随着外源ABA浓度的增加，野生型拟南芥种子的萌发率会逐渐降低。统计种子萌发实验是研究ABA信号转导的重要方法之一。
[0095] 供试种子为：哥伦比亚生态型拟南芥的种子，突变体ei4g2-1的种子。
[0096] 第一组：将供试种子
播种在MS培养基平板上，4℃低温层积3天，然后转移到光照
培养箱中培养，分别于光照培养箱中培养36小时或48小时或72小时后统计种子萌发率。
[0097] 第二组：将供试种子播种在含0.6μM ABA的MS培养基平板上，4℃低温层积3天，然后转移到光照培养箱中培养，分别于光照培养箱中培养36小时或48小时或72小时后统计种子萌发率。
[0098] 第三组：将供试种子播种在含0.8μM ABA的MS培养基平板上，4℃低温层积3天，然后转移到光照培养箱中培养，分别于光照培养箱中培养36小时或48小时或72小时后统计种子萌发率。
[0099] 进行三次重复试验，每次重复试验中每种供试种子设置80-100粒生物学重复。
[0100] 结果见图3。在不含ABA的培养基上，在光照培养箱中培养36小时或48小时后，与哥伦比亚生态型拟南芥的种子相比，突变体ei4g2-1的种子的种子萌发率均无显著差异。在含0.6μM ABA的培养基上，在光照培养箱中培养36小时或48小时后，与哥伦比亚生态型拟南芥的种子相比，突变体ei4g2-1的种子的种子萌发率均显著降低，表现出对ABA显著的超敏表型(对ABA的耐受性降低)。在含0.8μM ABA的培养基上，在光照培养箱中培养36小时或48小时后，与哥伦比亚生态型拟南芥的种子相比，突变体ei4g2-1的种子的种子萌发率均显著降低，表现出对ABA显著的超敏表型(对ABA的耐受性降低)。各组在光照培养箱中培养72小时后，哥伦比亚生态型拟南芥的种子和突变体ei4g2-1的种子的种子萌发率均无显著差异。结果表明，敲除eIFiso4G2基因可以增加种子对ABA的不耐受性，延迟种子萌发。
[0101] 二、幼苗生长实验
[0102] ABA能够抑制幼苗生长。随着外源ABA浓度的升高，野生型拟南芥受到的抑制得到增强，其幼苗主根以及
叶片的生长都会受到不同程度的抑制。
[0103] 供试种子为：哥伦比亚生态型拟南芥的种子，突变体ei4g2-1的种子。
[0104] 第一组：将供试种子播种在MS培养基平板上，4℃低温层积3天，然后转移到光照培养箱中培养14天，然后观察幼苗生长的情况并测定主根长度。
[0105] 第二组：将供试种子播种在含0.6μM ABA的MS培养基平板上，4℃低温层积3天，然后转移到光照培养箱中培养14天，然后观察幼苗生长的情况并测定主根长度。
[0106] 第三组：将供试种子播种在含0.8μM ABA的MS培养基平板上，4℃低温层积3天，然后转移到光照培养箱中培养14天，然后观察幼苗生长的情况并测定主根长度。
[0107] 进行三次重复试验，每次重复试验中每种供试种子设置80-100粒生物学重复。
[0108] 各组植株群体的照片见图4。各组代表性植株的单株照片见图5。各组的主根根长平均值见图6。
[0109] 在不含ABA的培养基上，与哥伦比亚生态型拟南芥的种子长成的幼苗相比，突变体ei4g2-1的种子长成的幼苗的表型无显著差异，主根根长无显著差异。在含0.6μMABA的培养基上，与哥伦比亚生态型拟南芥的种子长成的幼苗相比，突变体ei4g2-1的种子长成的幼苗的生长受到显著抑制，主根根长显著降低，表现出对ABA显著的超敏表型(对ABA的耐受性降低)。在含0.8μM ABA的培养基上，与哥伦比亚生态型拟南芥的种子长成的幼苗相比，突变体ei4g2-1的种子长成的幼苗的生长受到显著抑制，主根根长显著降低，表现出对ABA显著的超敏表型(对ABA的耐受性降低)。结果表明，敲除eIFiso4G2基因可以增加幼苗对ABA的不耐受性。
[0110] 本发明可通过基因工程手段敲除eIFiso4G2基因，或者抑制eIFiso4G2基因的表达，从而得到抗胎萌的转基因作物，从而能够抑制种子过早萌发，减少胎萌所消耗的营养和贮藏物质，使种子食用品质、贮藏品质和种子质量显著提高，给作物生产带来更大的经济利益。此外还可将其作为一种研究其它具有调控重要农业性状的功能基因调控作物种子萌发和萌发后幼苗生长发育的生长模型，从而有助于深入阐明ABA信号通路中正负调节因子调控植物对ABA的耐受性的分子机制，从而为实际农业生产提供理论支持。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物ABA耐受性的分子机制、农作物遗传特性改良等方面具有重要的实用价值和市场前景。
