OTS1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
阅读：137发布：2020-05-15
专利汇可以提供OTS1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种OTS1蛋白及其编码基因在调控 植物 对ABA耐受性中的应用。本发明所提供的应用为由序列3所示 蛋白质 在如下任一中的应用：a1)调控植物对ABA耐受性；a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；a3)调控植物的胎萌抗性；a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。本发明可应用于将植物 激素 ABA作为选择性 除草剂 ，通过基因工程手段获得OTS1低表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明亦可通过调节OTS1的表达 水 平控制植物 种子 的萌发率，通过基因工程手段获得OTS1基因高表达、抗胎萌转基因作物。本发明符合 可持续农业 发展需求，对于开拓绿色环保、无公害的除草方法等方面具有重要的实用价值和市场前景。，下面是OTS1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利的具体信息内容。
1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）-a4）任一中的应用：
a1）调控植物对ABA耐受性；
a2）选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；
a3）调控植物的胎萌抗性；
a4）选育胎萌抗性提高或降低的植物品种；
所述植物为拟南芥。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1）-a4）任一中的应用：
a1）调控植物对ABA耐受性；
a2）选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；
a3）调控植物的胎萌抗性；
a4）选育胎萌抗性提高或降低的植物品种；
所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第1至1755位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列1所示的DNA分子。
4.培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低；
所述植物为拟南芥。
5.培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高；
所述植物为拟南芥。
6.培育胎萌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性提高；
所述植物为拟南芥。
7.培育胎萌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性降低；
所述植物为拟南芥。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第1至1755位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列1所示的DNA分子。
9.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因均是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
11.一种提高植物种子萌发速率的方法，具体包括如下步骤：
（1）在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高；
（2）将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中；
所述植物为拟南芥。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述ABA在所述基质中的含量为0.2-3μM。
OTS1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 脱落酸(abscisic acid，ABA)是一种具有倍半萜结构的植物激素，早在20世纪60年代初被人们发现，因其具有促进植物叶片脱落的功能而得名。ABA在植物体内起着重要的作用，ABA能够抑制种子的萌发和幼苗的生长、促进气孔的关闭，调控侧根发育、叶片衰老以及果实成熟等生长和发育过程；另外，ABA在植物应对外界各种逆境胁迫过程中也起着重要作用，例如干旱、冷和高盐等非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫。植物ABA信号转导通路分子机制的阐明对调控植物生长、提高作物品质、改良遗传特性、促进现代农业生产发展具有重要的意义。
[0003] 近30年来，植物中有关ABA信号转导方面的研究取得了很多重大进展，包括ABA受体在内的大量ABA信号转导功能组分相继被鉴定；另外，ABA与其它植物激素间的交叉对话等研究均也取得了重要进展，这些发现有力推动了植物中ABA信号转导调控机理的阐明。到目前为止，研究人员分别鉴定出了三种不同类型的ABA受体：镁螯合酶H亚基CHLH/ABAR、G蛋白偶联受体(GTG1、GTG2)及START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体。ABAR是第一个被鉴定出来的植物ABA受体；后续的研究表明，ABAR介导的ABA信号通路是非常复杂的，转录因子WRKY18/40/60及分子伴侣蛋白CPN20参与到ABAR介导的ABA信号通路之中。
[0004] SUMO化/类泛素化修饰是一序列酶介导的生化级联反应过程，通过这个酶促反应能够将SUMO蛋白共价连接到靶蛋白上，这些靶蛋白包括细胞蛋白和病毒蛋白。类泛素化修饰的整个过程包括了多步酶促反应，参与反应的酶有：异源二聚的活化酶SAE1/2、结合酶Ubc9及SUMO连接酶。在生物学功能方面，类泛素化和泛素化有着很大的差别；泛素化主要是将靶蛋白贴上泛素标签，然后通过蛋白酶体将靶蛋白酶降解。类泛素化修饰的蛋白并不被蛋白酶体识别；一些实验证据显示，SUMO通过与泛素竞争赖氨酸活性位点从而阻断降解过程；另外，还有研究证明，经过SUMO修饰的蛋白能够被特异的SUMO依赖性泛素化酶识别来促进泛素化修饰。除了影响蛋白质的稳定性外，研究发现，SUMO还能够通过对转录因子修饰或者直接修饰DNA分子来进行转录水平调节；其中，大多数转录因子由于转录激活区域被SUMO修饰从而降低了转录活性(可能是由于转录因子的稳定性降低或者亚细胞定位的改变导致)；也有少数的转录因子因为SUMO修饰而导致转录活性升高，例如热激蛋白、Oct4和Smad4。另外，类泛素化修饰在RNA加工、染色质重组、基因组保留、核质运输等方面也起着重要的作用。
[0005] 去类泛素化是指从靶蛋白上除去SUMO的过程，该过程是由SENP异肽酶成员催化完成。SENPs在体内具有双重的生物活性：SENPs一方面参与SUMO的成熟过程，另一方面可以催化靶蛋白的去类泛素化过程。SENP家族由6个成员组成：SENP1-3和SENP5-7；在哺乳动物细胞内，各个成员具有不同的亚细胞定位：SENP1定位于PML核小体；SENP6定位于细胞质；SENP3定位于核仁；SENP2定位于核孔复合体。SENP家族成员的多样性和不同的亚细胞定位显示细胞内的类泛素化是一个可逆的动态过程。OTS1(OVERLY TOLERANT TO SALT1)是植物中重要的去类泛素化酶，在拟南芥tair网站上的基因号为At1g60220(https://www.arabidopsis.org/)，该基因在响应干旱胁迫及盐胁迫过程中起着重要的作用。
[0006] 随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变植物对ABA信号的响应水平，控制植物种子的萌发速率以及植物生长以达到所需要的状态、调控植物抗逆性以及利用天然植物激素实现选择性除草等成为研究前沿。
[0007] 另外，植物对ABA信号的响应水平还与种子胎萌相关。种子胎萌是是指种子收获前早萌现象，泛指种子收获前在田间母体植株上发芽的现象。水稻、小麦、油菜、玉米等禾本科植物，收获时如遇雨和高温，种子收获前在田间母体植株上会出现提前发芽的胎萌现象，胎萌消耗其部分营养和贮藏物质，致使种子食用品质、贮藏品质下降，严重劣化了种子的品质、种用价值和耐贮性，将给农业生产造成较大的损失。种子的胎萌现象取决于种子的休眠特性，而ABA是种子休眠的主导因素，对ABA反应不敏感可导致种子胎萌的发生。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种OTS1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。
[0009] 本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
[0011] a1)调控植物对ABA耐受性；
[0012] a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；
[0013] a3)调控植物的胎萌抗性；
[0014] a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。
[0015] B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(OTS1蛋白)的编码基因在如下a1)-a4)任一中的应用：
[0016] a1)调控植物对ABA耐受性；
[0017] a2)选育对ABA耐受性降低或提高的植物品种；
[0018] a3)调控植物的胎萌抗性；
[0019] a4)选育胎萌抗性提高或降低的植物品种。
[0020] 在本发明中，以上a1)中的所述调控植物对ABA耐受性均体现为：OTS1蛋白的表达量越高，则所述植物对ABA的耐受性越弱；OTS1蛋白的表达量越低，则所述植物对ABA的耐受性越强。
[0021] 在本发明中，以上所有a2)中的所述选育对ABA耐受性降低的植物品种的方法，具体可包括将所述OTS1蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。以上所有a2)中的所述选育对ABA耐受性提高的植物品种的方法，具体可包括将所述OTS1蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0022] 在本发明中，以上a3)中的所述调控植物的胎萌抗性均体现为：OTS1蛋白的表达量越高，则所述植物的胎萌抗性越强；OTS1蛋白的表达量越低，则所述植物的胎萌抗性越弱。
[0023] 在本发明中，以上所有a4)中的所述选育胎萌抗性提高的植物品种的方法，具体可包括将所述OTS1蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。以上所有a4)中的所述选育胎萌抗性降低的植物品种的方法，具体可包括将所述OTS1蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0024] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0025] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，可为如下(A)-(D)中任一种：
[0026] (A)培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低；
[0027] (B)培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高。
[0028] (C)培育胎萌抗性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性提高；
[0029] (D)培育胎萌抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比胎萌抗性降低。
[0030] 在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即OTS1基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0031] 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第1至1755位核苷酸所示的DNA分子；
[0032] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0033] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0034] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0035] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0036] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0037] 其中，序列1由3840个核苷酸组成，为所述OTS1基因在拟南芥基因组中序列，其中第343-605位、第649-770位、第917-1035位、第1350-1503位、第1553-1884位、第1971-2050位、第2081-2160位、第位2257-2358、第2462-2580位、第2679-2761位、第2885-3030位、第3146-3283位、第3392-3477位均为内含子序列；序列2由2016个核苷酸组成，为所述OTS1基因的cDNA序列，其中第1-1755位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由584个氨基酸残基组成。
[0038] 在所述(A)和所述(C)的方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因均是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
[0039] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0040] 在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。
[0041] 更为具体的，所述重组表达载体为将所述OTS1基因插入pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点BamH I与Kpn I之间后得到的重组质粒。
[0042] 在上述方法中，将携带有所述OTS1基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0043] 本发明的再一个目的是提供一种提高植物种子萌发速率的方法。
[0044] 本发明所提供的提高植物种子萌发速率的方法，具体可包括如下步骤：
[0045] (1)在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高；
[0046] (2)将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中；在所述含有ABA的基质中，所述转基因植物的种子萌发速率高于所述受体植物。
[0047] 在步骤(2)中，所述ABA在所述基质中的含量为0.2-3μM(如0.6-3μM)。所述基质具体可为培养基(如MS培养基)或土壤。
[0048] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0049] 在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物。所述双子叶植物为十字花科植物；具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。
[0050] 本发明的又一个目的是提供一种对所述(B)中的所述转基因植物进行除草的方法。
[0051] 在本发明所提供的对所述(B)中的所述转基因植物(即所述对ABA耐受性提高的转基因植物)进行除草的方法中，所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。
[0052] 在上述方法中，所述“所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受”是指：向所述待除杂草喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述待除杂草死亡；但向所述转基因植物喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述转基因植物不死亡，且生长状态与喷洒所述浓度为M的ABA溶液前相比无统计学差异。
[0053] 在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点BamH I和Kpn I之间插入序列2的第1-1752位所示DNA片段后所得重组质粒表达得到的融合蛋白。
[0054] 本发明研究发现OTS1蛋白是ABA信号传导的核心正调节子。本发明可应用于将植物激素ABA作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用OTS1调节植物对ABA的耐受性，通过基因工程手段获得OTS1低表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明亦可通过调节OTS1的表达水平控制植物种子的萌发率，通过基因工程手段获得OTS1基因高表达、抗胎萌转基因作物。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法，研究种子胎萌机制、提高种子食用品质和贮藏品质等方面具有重要的实用价值和市场前景。附图说明
[0055] 图1为OTS1基因T-DNA插入突变体ots1-1的鉴定。通过查询拟南芥公开数据库tair网站(https://www.arabidopsis.org/)，T-DNA插入在OTS1基因的最后一个外显子处。
[0056] 图2为用实时荧光定量PCR检测各遗传材料中OTS1基因表达量的分析结果。从图中可以看出ots1-1为基因敲除突变体，OE31中OTS1mRNA表达量是野生型(Col-0)的12倍左右，OE32中OTS1mRNA表达量是野生型(Col-0)的2倍左右。
[0057] 图3为ABA对OTS1各遗传材料幼苗生长的影响分析结果。
[0058] 图4为ABA对OTS1各遗传材料种子萌发的影响分析结果。
具体实施方式
[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供(记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.)。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。
[0062] 拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http://www.arabidopsis.org/]产品。
[0063] OTS1基因敲除突变体ots1-1，为拟南芥生物研究中心(ABRC)的产品，编号为SALK_022798C。
[0064] 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供(记载文献：R.Berres,L.otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)。
[0065] 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a(DE3)感受态：为全式金生物有限公司产品。
[0066] 实施例1、OTS1转基因植物的获得及鉴定
[0067] 本实施例中所涉及的OTS1基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由3840个核苷酸组成，其中第343-605位、第649-770位、第917-1035位、第1350-1503位、第1553-1884位、第1971-2050位、第2081-2160位、第位2257-2358、第2462-2580位、第2679-2761位、第2885-3030位、第3146-3283位、第3392-3477位均为内含子序列；序列2由2016个核苷酸组成，为所述OTS1基因的cDNA序列，其中第1-1755位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由584个氨基酸残基组成。
[0068] 一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-OTS1的构建
[0069] 提取拟南芥野生型(Col-0生态型)的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1750bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第1-1752位核苷酸序列。
[0070] 引物1：5’-CGGGATCCATGACGAAGAGGAAGAAGGAAGT-3’(下划线部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列2的第1-23位)；
[0071] 引物2：5’-GGGGTACCCTCTGTCTGGTCACTGACACGGAA-3’(下划线部分为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列2的第1729-1752位的反向互补序列)。
[0072] 用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点BamH I和Kpn I之间插入序列2的第1-1752位所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-OTS1。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-OTS1中，启动所述OTS1基因转录的启动子为35S启动子。
[0073] 在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-OTS1的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的OTS1基因为模板。
[0074] 二、OTS1基因敲除突变体鉴定
[0075] OTS1基因敲除突变体(ots1-1)购买自拟南芥生物研究中心(Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http://www.arabidopsis.org/)，背景为拟南芥野生型(Col-0生态型)。利用图1中的引物组合，通过PCR技术鉴定出纯合体；另外，拟南芥tair网站(http://www.arabidopsis.org/)显示，ots1-1突变体中T-DNA插入在OTS1基因的最后一个外显子处。
[0076] 所用引物序列如下：
[0077] ots1-1LP：5’-GATGATGCAAGGAGGCTAGTG-3’(Left primer,LP)
[0078] ots1-1RP：5’-GTAGGATCAGCGAAGCTGTTG-3’(Right primer,RP)
[0079] LBa1：5’-GGTTCACGTAGTGGGCCATC-3’(Left border primer,LB)
[0080] 三、OTS1转基因拟南芥的获得及鉴定
[0081] 1、OTS1转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得[0082] 将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-OTS1通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2(序列见上文)组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有OTS1基因(PCR目的条带大小约为1750bp)的农杆菌GV3101命名为GV3101/pCAMBIA-1300-221-OTS1；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的农杆菌GV3101命名为空-GFP/pCAMBIA-1300-221。
[0083] 采用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998，16(6):735-743.)将上述所得的重组农杆菌GV3101/pCAMBIA-1300-221-OTS1(或空-GFP/pCAMBIA-1300-221)转化拟南芥野生型(Col-0生态型)。
[0084] 转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-OTS1的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株(T1代)。
[0085] 2、OTS1转基因拟南芥鉴定
[0086] (1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数
[0087] 根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系(单拷贝OTS1转基因拟南芥)，从而用于纯合体的筛选。
[0088] (2)转基因拟南芥OE31、OE32纯合系的筛选
[0089] 经上述鉴定分析后，选择其中二个单拷贝OTS1转基因拟南芥株系，分别记为OE31和OE32(T1代)。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长(即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T3代转基因拟南芥OE31和OE32的纯合系植株，作为实验材料进行以下ABA耐受性试验分析。
[0090] 四、转基因拟南芥OE31和OE32纯合系及突变体ots1-1中OTS1基因表达量分析[0091] 提取拟南芥野生型(Col-0生态型)、过表达植株(OE31和OE32)及T-DNA插入突变体ots1-1的总RNA，利用实时荧光定量PCR检测各遗传材料中OTS1基因在转录水平上表达情况。具体如下：
[0092] 1、转录水平分析(RNA表达量)
[0093] 以上述获得的转基因拟南芥OE31和OE32纯合系、T-DNA插入突变体ots1-1以及拟南芥野生型(Col-0生态型)平皿中生长12天的幼苗做为实验材料。提取各实验材料的总RNA，反转录成单链cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析OTS1基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增OTS1基因的引物序列为：
[0094] OTS1RT-F：5’-GCATCCCTGATAAGAAAGATGAA-3’(序列2的第1334-1356位)；
[0095] OTS1RT-R：5’-AATGAAGAAGAGCACAAACGG-3’(序列2的第1579-1599位的反向互补序列)。
[0096] 以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
[0097] Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
[0098] Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
[0099] 上述引物的反应条件如下:
[0100] (1)反应体系的建立
[0101] 实时荧光定量PCR反应体系
[0102]
[0103] (2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
[0104] (3)反应程序的设定：
[0105] 实时荧光定量PCR反应程序
[0106]
[0107]
[0108] (4)数值分析，以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。
[0109] OTS1相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图2所示，OTS1基因表达量均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)中OTS1基因表达量为1；从图中可以看出，T-DNA插入突变体ots1-1中OTS1基因在转录水平上没有表达，为基因敲除突变体；步骤三中获得的转基因拟南芥OE31中OTS1mRNA表达量是野生型(Col-0)的12倍左右，OE32中OTS1mRNA表达量是野生型(Col-0)的2倍左右。
[0110] 实施例2、OTS1各遗传材料对ABA耐受性分析试验
[0111] 一、ABA对OTS1各遗传材料幼苗生长的影响
[0112] ABA能够抑制植物幼苗的生长。随着外源ABA浓度的升高，拟南芥野生型(Col-0生态型)受到的抑制得到增强，其主根和叶片的生长都会受到不同程度的影响，实验重复3次。
[0113] 以拟南芥野生型(Col-0生态型)、OTS1基因敲除突变体ots1-1、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体OTS1转基因株系(OE31和OE32)以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在不含有ABA的MS平板上，4℃下低温层积3天，放到光照培养箱中培养60h，然后将刚刚萌发的各实验材料幼苗移到含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ、1μM和4μΜ)，竖直培养8-10天，待出现明显表型后进行拍照记录。
[0114] 结果如图3所示，在含0μM ABA的培养基上，各种遗传材料的幼苗长势(叶片生长和主根长度)基本一致。但是，在含4μΜ ABA的MS培养基上，野生型幼苗生长受到了明显的抑制，而ots1-1幼苗相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)长势明显较好，表现出对ABA脱敏的表型(对ABA耐受性增强)；另外，在含有1μΜ ABA的MS平板上，OTS1转基因株系(OE31和OE32)相对于野生型(Col-0生态型)长势明显较差，表现出对ABA超敏的表型(对ABA耐受性减弱)。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其幼苗长势均与拟南芥野生型(Col-0生态型)基本一致，无统计学差异。综合以上实验结果可见，相对于野生型(Col-0生态型)，OTS1基因敲除突变体ots1-1对ABA耐受性增强，而OTS1转基因株系(OE31和OE32)对ABA耐受性减弱。
[0115] 二、ABA对OTS1各遗传材料种子萌发的影响
[0116] ABA在促进种子休眠、抑制种子萌发中发挥重要调节作用。遗传学研究表明，种子萌发过程中发生的染色质重建及组蛋白甲基化、去乙酰化等过程均受ABA调节。随着外源ABA浓度的增加，拟南芥野生型(Col-0生态型)种子的萌发率会逐渐降低。统计种子萌发实验是研究ABA信号转导的重要方法之一。
[0117] 以拟南芥野生型(Col-0生态型)、OTS1基因敲除突变体ots1-1、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体OTS1转基因株系OE32以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ，0.2μΜ，0.6μΜ，1μM和3μΜ)(每种实验材料播种80-100粒)。4℃下低温层积3天后移入光照培养箱中。记录各实验材料种子在层积后36h、48h及60h时的萌发数，并对结果进行统计。实验重复3次，结果取平均值。
[0118] 结果如图4所示，在含有0μM ABA的培养基上，各实验材料种子的萌发率基本一致。但是，在含有不同浓度ABA的培养基上，相同时间点下，OTS1基因敲除突变体ots1-1相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)种子萌发速率更快，表现出对ABA脱敏的表型(对ABA耐受性增强，对胎萌抗性减弱)；而实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体OTS1转基因株系OE32相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)种子萌发速率更慢，表现出对ABA超敏的表型(对ABA耐受性减弱，对胎萌抗性增强)。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其种子萌发速率均与拟南芥野生型(Col-0生态型)基本一致，无统计学差异。综合以上结果，相对于野生型(Col-0生态型)，OTS1基因敲除突变体ots1-1对ABA耐受性增强，而转基因株系OE32对ABA耐受性减弱。
[0119] 综合以上结果可见，相对于野生型(Col-0生态型)，OTS1基因敲除突变体ots1-1对ABA耐受性增强；而OTS1基因过表达株系的胎萌抗性增强。
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