OTS2蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
阅读：238发布：2020-05-15
专利汇可以提供OTS2蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种OTS2蛋白及其编码基因在调控 植物 对ABA耐受性中的应用。本发明所提供的应用为由 序列表 中序列3所示的 氨 基酸序列组成的 蛋白质 在如下a1)或a2)中的应用：a1)调控植物对ABA耐受性；a2)选育对ABA耐受性提高或降低的植物品种。本发明可应用于将植物 激素 ABA作为选择性 除草剂 ，可通过基因工程手段获得OTS2低表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合 可持续农业 发展需求，对于开拓绿色环保、无公害的除草方法等方面具有重要的实用价值和市场前景。，下面是OTS2蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用专利的具体信息内容。
1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控植物对ABA耐受性；
a2）选育对ABA耐受性提高或降低的植物品种；
所述植物为拟南芥。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控植物对ABA耐受性；
a2）选育对ABA耐受性提高或降低的植物品种；
所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第46至1761位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列1所示的DNA分子。
4.培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高；
所述植物为拟南芥。
5.培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低；
所述植物为拟南芥。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第46至1761位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列1所示的DNA分子。
7.一种提高植物种子萌发速率的方法，具体包括如下步骤：
（1）在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高；
（2）将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中；
所述植物为拟南芥。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述ABA在所述基质中的含量为0.2-3μM。
OTS2蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 脱落酸(abscisic acid，ABA)是一种重要的植物激素，早在20世纪60年代初被人们发现，因其具有促进植物叶片脱落的功能而得名。植物激素脱落酸(ABA)在植物生长发育的各阶段都发挥重要作用，例如种子休眠、种子萌发、幼苗生长、气孔运动以及营养生长向生殖生长转换等过程；同时，ABA在植物应对外界各种逆境胁迫过程中也起着重要作用，例如干旱、冷、高盐等非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫。植物ABA信号转导通路分子机制的阐明对调控植物生长、改良遗传特性、提高作物品质、促进现代农业生产发展具有重要的意义。
[0003] 近30年来，植物中有关ABA信号转导方面的研究取得了很多重大进展，包括ABA受体在内的大量ABA信号转导功能组分相继被鉴定，例如蛋白激酶、蛋白磷酸酶、E3连接酶、伴侣蛋白、各种类型的转录因子等等，这些发现有力推动了植物中ABA信号转导调控机理的阐明。到目前为止，研究人员分别鉴定出了三种不同的ABA受体受体：镁螯合酶H亚基CHLH/ABAR、G蛋白偶联受体(GTG1、GTG2)及START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体。ABAR是第一个被鉴定出来的植物ABA受体；后续的研究表明，ABAR介导的ABA信号通路是非常复杂的，转录因子WRKY18/40/60及分子伴侣蛋白CPN20参与到ABAR介导的ABA信号通路之中。
[0004] SUMO化/类泛素化修饰是一序列酶介导的生化级联反应过程，通过这个酶促反应能够将SUMO蛋白共价的连接到相应的靶蛋白上，这些靶蛋白包括病毒蛋白和细胞蛋白等等。SUMO化修饰最早发现于1996年，在酵母细胞中鉴定到一种类似泛素的蛋白，并且该蛋白能共价结合到另一个蛋白的赖氨酸残基上。类泛素化修饰的整个过程包括了多步酶促反应，参与反应的酶有：异源二聚的活化酶SAE1/2，结合酶Ubc9，SUMO连接酶。类泛素化和泛素化在生物学功能方面有着很大的差异。泛素化主要是将把蛋白贴上泛素标签，然后通过蛋白酶体将靶蛋白降解；而类泛素化修饰的蛋白并不被蛋白酶体识别。有研究报道，SUMO通过与泛素竞争赖氨酸活性位点从而阻断降解过程；另外，经过SUMO修饰的蛋白能够被特异的SUMO依赖性泛素化酶识别来促进泛素化修饰。类泛素化除了影响蛋白质的稳定性外，SUMO还能够通过对转录因子修饰或者直接修饰DNA分子来进行转录调节。另外，类泛素化修饰在RNA加工、病毒复制、免疫反应、基因组保留、染色质重组、核质运输等方面也起着重要的作用。
[0005] SUMO化修饰是一个可逆的过程，去类泛素化是指从靶蛋白上除去SUMO的过程。去类泛素化是由SENP异肽酶成员催化完成的；另外，SENPs参与SUMO的成熟过程；SENP家族由6个成员组成：SENP1-3和SENP5-7，在哺乳动物细胞内各个成员具有不同的亚细胞定位：SENP1定位于PML核小体；SENP6定位于细胞质；SENP3定位于核仁；SENP2定位于核孔复合体；
OTS2(OVERLY TOLERANT TO SALT2)是植物中重要的去类泛素化酶，在拟南芥tair网站上的基因号为At1g10570(https://www.arabidopsis.org/)，该基因在响应干旱胁迫及盐胁迫过程中起着重要的作用。
OTS2(OVERLY TOLERANT TO SALT2)是植物中重要的去类泛素化酶，在拟南芥tair网站上的基因号为At1g10570(https://www.arabidopsis.org/)，该基因在响应干旱胁迫及盐胁迫过程中起着重要的作用。
[0006] 随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变植物对ABA信号的响应水平，控制植物种子的萌发及植物生长以达到所需要的状态以及利用天然植物激素实现选择性除草等成为研究前沿。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种OTS2蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。
[0008] 本发明所提供的应用，具体为如下A或B：
[0010] a1)调控植物对ABA耐受性；
[0011] a2)选育对ABA耐受性提高或降低的植物品种。
[0012] B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(OTS2蛋白)的编码基因在如下a1)或a2)中的应用：
[0013] a1)调控植物对ABA耐受性；
[0014] a2)选育对ABA耐受性提高或降低的植物品种。
[0015] 在本发明中，以上a1)中的所述调控植物对ABA耐受性均体现为：OTS2蛋白的表达量越低，则所述植物对ABA的耐受性越强；OTS2蛋白的表达量越高，则所述植物对ABA的耐受性越弱。
[0016] 在本发明中，以上所有a2)中的所述选育对ABA耐受性提高的植物品种的方法，具体可包括将所述OTS2蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交的步骤；所述选育对ABA耐受性降低的植物品种的方法，具体可包括将所述OTS2蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0018] 本发明所提供的培育转基因植物的方法具体可为如下(A)或(B)：
[0019] (A)培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高。
[0020] (B)培育对ABA耐受性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性降低。
[0021] 在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因(即OTS2基因)是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0022] 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第46至1761位核苷酸所示的DNA分子；
[0023] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0024] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0025] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0026] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0027] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0028] 其中，序列1由3684个核苷酸组成，为所述OTS2基因在拟南芥基因组中序列，其中第382-735位、第785-863位、第977-1050位、第1353-1481位、第1531-1609位、第1696-1783位、第1814-1891位、第1997-2080位、第2184-2461位、第2560-2774位、第2898-3016位、第3129-3213位、第3322-3407位均为内含子序列；序列2由1936个核苷酸组成，为所述OTS2基因的cDNA序列，其中第46-1761位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由571个氨基酸残基组成。
[0029] 本发明的再一个目的是提供一种提高植物种子萌发速率的方法。
[0030] 本发明所提供的提高植物种子萌发速率的方法，具体可包括如下步骤：
[0031] (1)在受体植物中对由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比对ABA的耐受性提高；
[0032] (2)将所述转基因植物的种子播种于含有ABA的基质中；在所述含有ABA的基质中，所述转基因植物的种子萌发速率高于所述受体植物。
[0033] 在步骤(2)中，所述ABA在所述基质中的含量为0.2-3μM(如0.6-3μM)。所述基质具体可为培养基(如MS培养基)或土壤。
[0034] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0035] 进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物。在本发明的一个实施例中，所述植物为具体为拟南芥野生型(Col-0生态型)。
[0036] 本发明的又一个目的是提供一种对所述(A)中的所述转基因植物进行除草的方法。
[0037] 在本发明所提供的对所述(A)中的所述转基因植物(即所述对ABA耐受性提高的转基因植物)进行除草的方法中，所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。
[0038] 在上述方法中，所述“所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受”是指：向所述待除杂草喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述待除杂草死亡；但向所述转基因植物喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述转基因植物不死亡，且生长状态与喷洒所述浓度为M的ABA溶液前相比无统计学差异。
[0039] 本发明研究发现OTS2蛋白是ABA信号传导的核心正调节子。本发明可应用于将植物激素ABA作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用OTS2调节植物对ABA的耐受性，可通过基因工程手段获得OTS2低表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合可持续农业发展需求，对于研究植物耐受ABA的分子机制、改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法等方面具有重要的实用价值和市场前景。附图说明
[0040] 图1为OTS2基因T-DNA插入突变体ots2-1的鉴定；通过查询拟南芥公开数据库tair网站(https://www.arabidopsis.org/)，T-DNA插入在OTS2基因的第11个外显子处。
[0041] 图2为用实时荧光定量PCR检测ots2-1突变体中OTS2基因表达量的分析结果。从图中可以看出，ots2-1为基因敲除突变体。
[0042] 图3为ABA对ots2-1突变体幼苗生长的影响分析结果。
[0043] 图4为ABA对ots2-1突变体种子萌发的影响分析结果。
具体实施方式
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0047] 拟南芥野生型(Col-0生态型)：拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http://www.arabidopsis.org/]的产品。
[0048] OTS2基因敲除突变体ots2-1，为拟南芥生物研究中心(ABRC)的产品，编号为SALK_001579。
[0049] 实施例1、OTS2基因敲除突变体的获得及鉴定
[0050] 本实施例中所涉及的OTS2基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由3684个核苷酸组成，为所述OTS2基因在拟南芥基因组中序列，其中第382-735位、第785-863位、第977-1050位、第1353-1481位、第1531-1609位、第1696-1783位、第1814-1891位、第1997-2080位、第2184-2461位、第2560-
2774位、第2898-3016位、第3129-3213位、第3322-3407位均为内含子序列；序列2由1936个核苷酸组成，为所述OTS2基因的cDNA序列，其中第46-1761位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由571个氨基酸残基组成。
2774位、第2898-3016位、第3129-3213位、第3322-3407位均为内含子序列；序列2由1936个核苷酸组成，为所述OTS2基因的cDNA序列，其中第46-1761位为编码序列(ORF)；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由571个氨基酸残基组成。
[0051] 一、OTS2基因敲除突变体鉴定
[0052] OTS2基因敲除突变体(ots2-1)购买自拟南芥生物研究中心(Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http://www.arabidopsis.org/)，背景为拟南芥野生型(Col-0生态型)。利用图1中的引物组合，通过PCR技术鉴定出纯合体；另外，拟南芥tair网站(http://www.arabidopsis.org/)显示，ots2-1突变体中T-DNA插入在OTS2基因的第11个外显子处。
[0053] 所用引物序列如下：
[0054] ots2-1LP：5’-GCTTCTTCCGGTTTAAACCAC-3’(Left primer,LP)
[0055] ots2-1RP：5’-TTTTTCTTCTGGCGACTCATG-3’(Right primer,RP)
[0056] LBa1：5’-GGTTCACGTAGTGGGCCATC-3’(Left border primer,LB)
[0057] 二、ots2-1突变体中OTS2基因表达量分析
[0058] 提取拟南芥野生型(Col-0生态型)与T-DNA插入突变体ots2-1株系总RNA，利用实时荧光定量PCR检测各实验材料中OTS2基因在转录水平上的表达情况。具体如下：
[0059] 1、转录水平分析(RNA表达量)
[0060] 以T-DNA插入突变体ots2-1以及拟南芥野生型(Col-0生态型)平皿中生长12天的幼苗做为实验材料。提取各实验材料的总RNA，反转录成cDNA，然后通过实时荧光定量PCR方法分析OTS2基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增OTS2基因的引物序列为：
[0061] OTS2RT-F：5’-TGTGGTCTGTTTCTGCTCTTCTTC-3’(序列2的第1579-1602位)；
[0062] OTS2RT-R：5’-CGAGTATGTTCCAGATTTTGATCCT-3’(序列2的第1702-1726位的反向互补序列)。
[0063] 以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
[0064] Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
[0065] Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
[0066] 上述引物的反应条件如下:
[0067] (1)反应体系的建立
[0068] 实时荧光定量PCR反应体系
[0069]
[0070] (2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
[0071] (3)反应程序的设定：
[0072] 实时荧光定量PCR反应程序
[0073]
[0074] (4)数值分析，以2-ΔCt作为衡量基因转录水平的相对差值，对各个基因的表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为特异引物Ct值与Actin引物Ct值之差。
[0075] 实时荧光定量PCR检测结果如图2所示，OTS2基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型(Col-0)中OTS2基因的表达量为1。从图中可以看出，T-DNA插入突变体ots2-1中OTS2基因在转录水平上基本没有表达，为OTS2基因敲除突变体。
[0076] 实施例2、ots2-1突变体对ABA耐受性分析试验
[0077] 一、ABA对ots2-1突变体幼苗生长的影响
[0078] ABA能够抑制植物幼苗的生长。随着外源ABA浓度的升高，拟南芥野生型(Col-0生态型)受到的抑制得到增强，其主根和叶片的生长都会受到不同程度的影响，实验重复3次。
[0079] 以拟南芥野生型(Col-0生态型)、OTS2基因敲除突变体ots2-1植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在不含ABA的MS培养基上，4℃下低温层积3天后放到光照培养箱中培养60h，然后将刚刚萌发的各实验材料幼苗移到含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ和4μΜ)，竖直培养10天后观察拟南芥幼苗生长的情况并拍照。
[0080] 结果如图3所示，在含0μM ABA的培养基上，各遗传材料幼苗长势(叶片生长和主根长度)基本一致；但是，在含4μΜABA的MS培养基上，野生型幼苗生长受到了明显的抑制，而ots2-1幼苗相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)长势明显较好，表现出对ABA脱敏的表型，即OTS2基因敲除突变体ots2-1对ABA耐受性增强。
[0081] 二、ABA对ots2-1突变体种子萌发的影响
[0082] ABA在促进种子休眠、抑制种子萌发中发挥重要调节作用。遗传学研究表明，种子萌发过程中发生的染色质重建及组蛋白甲基化、去乙酰化等过程均受ABA调节。随着外源ABA浓度的增加，拟南芥野生型(Col-0生态型)种子的萌发率会逐渐降低。统计种子萌发实验是研究ABA信号转导的重要方法之一。
[0083] 以拟南芥野生型(Col-0生态型)、OTS2基因敲除突变体ots2-1植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上(0μΜ，0.2μΜ，0.6μΜ，1μM和3μΜ)(每种实验材料播种80-100粒)。4℃下低温层积3天后放入光照培养箱中培养，记录各实验材料种子在层积后36h、48h和60h时的萌发数，并对结果进行统计。实验重复3次，结果取平均值。
[0084] 结果如图4所示，在含有0μM ABA的培养基上，各实验材料种子的萌发率基本一致。但是，在含有不同浓度ABA的培养基上，相同时间点下，OTS2基因敲除突变体ots2-1相对于拟南芥野生型(Col-0生态型)种子萌发速率更快，表现出对ABA脱敏的表型，即OTS2基因敲除突变体ots2-1对ABA耐受性增强。
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