一种microRNA探针序列的设计方法
阅读：60发布：2024-02-11
专利汇可以提供一种microRNA探针序列的设计方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种microRNA探针序列的设计方法，包括以下步骤：从基因组序列中收集所有能形成茎环结构的茎种序列；计算各茎种序列及其附近100nt～150nt区域序列所形成的RNA二级结构；根据microRNA前体茎环结构特征对产生的RNA二级结构进行筛选，提取含microRNA的茎环结构；计算含microRNA茎环结构的自由能分布；使用microRNA茎环结构的自由能特征谱确定microRNA前体；使用标准转换关系将microRNA前体二级结构归属为成熟体等效长度；用设定的等效总长度在microRNA前体二级结构中截取microRNA成熟体序列并输出结果。，下面是一种microRNA探针序列的设计方法专利的具体信息内容。
1.一种microRNA探针序列的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1），从基因组序列中收集所有能形成茎环结构的茎种序列，茎种为可以互相配对的、且配对片段之间的距离不超过120个核苷酸的配对片段；
步骤（2），计算各茎种序列及其附近100nt～150nt区域序列所形成的RNA二级结构；
步骤（3），根据microRNA前体茎环结构特征对产生的RNA二级结构进行筛选，提取含microRNA的茎环结构；
步骤（4），计算含microRNA茎环结构的自由能分布谱；
步骤（5），使用microRNA茎环结构的自由能特征谱确定microRNA前体；
步骤（6），使用标准转换关系将microRNA前体二级结构归属为成熟体等效长度；
步骤（7），用设定的等效总长度在microRNA前体二级结构中截取microRNA成熟体序列并输出所述microRNA探针序列；等效总长度设定为20；
步骤（4）中含microRNA茎环结构的自由能分布谱由每个面的自由能值构成，所述每个面由一碱基配对与其最邻近的碱基配对、以及两碱基配对之间的两条边构成；若两边碱基数相等，则按碱基数平均分割成小面，并对各个分割小面赋予平均能量值；若两边的碱基数目不相等，对其中较长的一边按碱基数目进行平均分割并对各个分割小面赋予平均能量值；
步骤（6）中所述标准转换关系为microRNA前体二级结构与microRNA成熟体等效长度之间的转换关系矩阵：
转换矩阵T用于处理microRNA前体所含的三种结构类型：第一行是类型一，即3’端非配对结构的转换参数，第二行是类型二，即对称的内环结构的转换参数，第三行是类型三，即鼓包结构的转换参数；
其中，x为各种类型的结构所含的核苷酸数目，L为利用标准转换关系进行转换后的等效长度。
2.根据权利要求1所述的一种microRNA探针序列的设计方法，其特征在于，步骤（2）中，所述计算各茎种及其附近区域对应序列的RNA二级结构包括以下步骤：从全长基因组序列中截取一段茎种序列，将所述茎种及其附近100nt～150nt区域的序列对折并且固定茎种的碱基配对，以递归的方式调整各个位置上碱基的配对形式从而生成各茎种所属的RNA二级结构。
3.根据权利要求1所述的一种microRNA探针序列的设计方法，其特征在于，步骤（3）具体包括以下步骤：
步骤（31），判断所述茎种序列所属RNA二级结构的能量和配对碱基数是否符合判据，如果结果为是，执行步骤（32），如果判断结果为否，则抛弃该茎种序列；
步骤（32），判断能量和配对碱基数的综合贡献PE值是否为最大值，如果判断结果为是，执行步骤（4），如果判断结果为否，则抛弃该茎种序列。
4.根据权利要求3所述的一种microRNA探针序列的设计方法，其特征在于，步骤（31）中能量的判据为-0.35kJ/mol·base以下；配对碱基数所占的百分比为65%以上。
5.根据权利要求4所述的一种microRNA探针序列的设计方法，其特征在于，步骤（32）中能量与配对碱基数的综合贡献PE值根据以下公式计算：
PE=PairBases×(1-k)-Energy×k，
其中，PairBases表示该茎环结构的配对碱基数，Energy表示该茎环结构的总自由能，k为两者间的权重值，取值范围为0.6～1.0的实数。
6.根据权利要求5所述的一种microRNA探针序列的设计方法，其特征在于，步骤（5）中使用microRNA茎环结构的自由能特征谱对各个microRNA前体二级结构的自由能分布谱扫描，以与自由能特征谱匹配得分值最高的位置确定microRNA前体末端位置。
一种microRNA探针序列的设计方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高通量microRNA芯片技术领域，特别涉及一种microRNA探针的分析方法。
背景技术
[0002] 高通量生物芯片技术是集微电子学、分子生物学、计算机科学等多学科交叉的先进技术，通过在厘米尺寸的计算机芯片上集成数千至上万个分子探针来实现对生物体各过程、各状态进行各个层次的快速、并行、大信息量检测。其中，microRNA芯片技术是当前最新的芯片技术，其探针为一种新的RNA分子，称microRNA，这类RNA分子通过抑制mRNA的翻译或降解mRNA的方式调控基因表达。近十年来，大量研究证明microRNA广泛参与动植物生长发育、细胞分化与凋亡以及重大疾病的发生发展过程。有人认为，microRNA在肿瘤发生过程中起着枢纽作用，用microRNA作为肿瘤治疗靶标将可能比使用编码基因更有效。(文献1：一种检测microRNA表达的微阵列芯片的研制及应用，骆明勇等，生物物理与生物化学进展，2007，34(1)：31-41)。利用该项技术，人们研究了多种癌变组织和细胞系的microRNA表达谱。(文献2：MicroRNA在人结肠癌干细胞中的表达谱，邹健等，世界华人消化杂志，2010，18(2)：173-178)不仅如此，2008年又有人发现多种疾病的血清microRNA表达谱具有疾病特异性(文献3：Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers fordiagnosis of cancer and other diseases，Xi Chen等，Cell Research(2008)18：997-1006)。因此，利用microRNA芯片技术进行microRNA表达谱检测正逐步成为相关研究、开发机构的常规实验手段，广泛应用于动植物分子生物学研究、分子医学研究、药理研究和新型RNA药物开发、以致食品安全领域。不同于其它芯片技术，由于已经知道的microRNA有限，所以探针序列的设计也是决定microRNA芯片检测能力的重要因素之一。目前大多采用miRBase数据库中已收录的人microRNA序列或者人-小鼠-大鼠microRNA序列作为芯片探针，这样的芯片只能检测有限数量的microRNA，而无法检测数据库中尚未收录的microRNA。最近Exiqon公司推出了11.0版本microRNA芯片，其中附加了435条基于某个计算方法设计的miRPLus探针，使得其产品在检测新microRNA方面拥有优势，但他们并没有发表该探针的分析方法，而如上所述，microRNA探针序列的设计对于后续的理论研究以及医药生物领域的应用都有至关重要的作用。
[0003] microRNA探针序列的设计都以基因组信息数据为基础。目前，生物信息学领域的一些算法可以看作与探针序列设计技术有关。一般是通过对相关物种基因组序列进行比较，识别出其中的进化保守序列片段，然后结合RNA二级结构的茎环特征进行分析；或者应用机器学习的方法，如SVM，利用已知microRNA序列及其周边核酸序列所有可能的特征进行分析提取。但这些方法大多只能提供microRNA所属的前体茎环结构(由介于pri-microRNA与pre-microRNA之间的序列构成)，由于成熟体microRNA的序列长度大约只占构成前体茎环结构序列的大约四分之一，所以如果用前体茎环结构对应的序列作探针将会导致芯片检测信号低弱或无信号(文献1)。目前还没有有效的方法直接产生microRNA成熟体序列。仅报道了3个尝试工作，但都未达到目的。包括一个基于SVM的研究(文献4：Reliable prediction of Drosha processing sites improvesmicroRNA gene prediction，S.A.Helvik，O. Jr and Pal Saetrom，BIOINFORMATICS，23(2)，2007，p142-149)，该方法仅能预测人microRNA的一端在其前体茎环结构中的位置(即，该方法只能给出准确的microRNA前体，即pre-microRNA)，而无法提供完整、准确的microRNA成熟体核酸序列；另外两个分别基于隐马科夫链和贝叶斯公式，但准确度过低，无法用于microRNA探针序列的设计。限制了microRNA芯片在实际应用中的价值。
发明内容
[0004] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种microRNA探针的分析方法，提高现有microRNA芯片技术对新microRNA的检测能力。
[0005] 技术方案：本发明公开了一种microRNA探针序列的设计方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤(1)，从基因组序列中收集所有能形成茎环结构的茎种序列；使用动态规划算法在序列上找出所有可以互相配对的、且配对片段之间的距离不超过120个核苷酸(120nt)的配对片段，称之为茎种。
[0007] 步骤(2)，计算各茎种序列及其附近100nt～150nt区域序列所形成的RNA二级结构；具体为将一段包含茎种的长度为130nt左右的序列从所输入的全长基因组序列中截取下来，将其对折并且固定茎种的配对，然后以递归的方式调整各个位置上碱基的配对形式以生成各种可能的二级结构。
[0008] 步骤(3)，根据microRNA前体茎环结构特征对产生的RNA二级结构进行筛选，提取含microRNA的茎环结构；
[0009] 步骤(4)，计算含microRNA茎环结构的自由能分布谱；
[0010] 步骤(5)，使用microRNA茎环结构的自由能特征谱确定microRNA前体；
[0011] 步骤(6)，使用标准转换关系将microRNA前体二级结构归属为成熟体等效长度；
[0012] 步骤(7)，用设定的等效总长度在microRNA前体二级结构中截取microRNA成熟体序列并输出结果。
[0013] 本发明步骤(2)中，所述计算各茎种及其附近区域对应序列的RNA二级结构包括以下步骤：从全长基因组序列中截取一段茎种序列，将所述茎种及其附近100nt～150nt区域的序列对折并且固定茎种的碱基配对，以递归的方式调整各个位置上碱基的配对形式从而生成各茎种所属的RNA二级结构，一般选择附近130nt的区域。
[0014] 本发明步骤(3)具体包括以下步骤：
[0015] 步骤(31)，判断茎种序列所属RNA二级结构的能量和配对碱基数是否符合判据，如果判断结果为否，则抛弃该茎种序列；否则，执行步骤(32)；
[0016] 步骤(32)，判断能量和配对碱基数的综合贡献PE值是否为最大值，如果判断结果为否，则抛弃该茎种序列；否则，执行步骤(4)。
[0017] 本发明步骤(31)中能量的判据为-0.35kJ/mol·base以下；配对碱基数所占的百分比为65％以上。配对数目越多，二级结构能量就越低，但是配对碱基数最多的结构不一定能量最低，而能量最低的结构其配对碱基数也不一定最多。
[0018] 本发明步骤(32)中能量与配对碱基数的综合贡献PE值根据以下公式计算：
[0019] PE＝PairBases×(1-k)-Energy×k，
[0020] 其中，PairBases表示该茎环结构的配对碱基数，Energy表示该茎环结构的总自由能，k为两者间的权重值，取值范围为0.6～1.0，最优选地k值取为0.8。同一个序列片段存在多个低能态结构，取PE值最大者为最佳候选结构。
[0021] 本发明步骤(4)中含microRNA茎环结构的自由能分布谱由每个面的自由能值构成，所述每个面由一碱基配对与其最邻近的碱基配对、以及两碱基配对之间的两条边构成；若两边碱基数相等，则按碱基数平均分割成小面，并对各个分割小面赋予平均能量值；若两边的碱基数目不相等，对其中较长的一边按碱基数目进行平均分割并对各个分割小面赋予平均能量值。计算含microRNA茎环结构的自由能分布谱，对于茎环结构的每一个面，根据Zuker(MFOLD)等人提供的能量表(文献5：Expanded sequencedependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure，Mathews DH，Sabina J，Zuker M，Turner DH.，J.Mol.Biol.(1999)288(5)，p911-940)对含microRNA茎环结构的每个小面逐个赋予能量值，即得到自由能分布谱。具体为：对于连续的碱基配对结构，直接在能量表中查询各个碱基堆积面的自由能值；对于各类非对称的环结构，在其较长的一边按碱基平均分割成小面，各个小面的自由能取环面自由能的平均值；对于对称的环结构，按碱基将环面分割成小面，各个小面的自由能取环面自由能的平均值。通过这个计算可以使能量与结构的实际空间位置对应起来。
[0022] 本发明步骤(5)中使用microRNA茎环结构的自由能特征谱对各个microRNA前体二级结构的自由能分布谱扫描，以与自由能特征谱匹配得分值最高的位置确定microRNA前体(Pre-miRNA)末端位置。利用microRNA所属茎环结构的自由能特征谱，确定Pre-miRNA末端的位置。Pre-miRNA茎环结构末端位置下游的自由能分布谱具有特征模式，本步骤所用自由能特征谱由对上步中已知的Pre-miRNA茎环结构末端区域的自由能分布谱计算所得。具体为：1)从mirBase数据库(http://www.mirbase.org)中获取所有human pre-microRNA，去除冗余数据(即重复性数据)；2)再根据mirBase中的microRNA基因组位置注释信息从人基因组序列(http://www.ensembl.org)中以pre-microRNA为中心提取130nt长的序列片段；3)使用RNAfold of Vienna package 1.8(文献6：Ivo L.H.(2003)Vienna RNA Secondary Structure Server.Nucleic Acids Research.31，3429-3431)计算其RNA二级结构(茎环结构)；4)进一步计算这些含microRNA茎环结构的自由能分布谱(方法如步骤(4)中所述)；5)将所有这些已知的人的含microRNA茎环结构自由能分布谱以其pre-microRNA末端位置对齐，即构成人microRNA茎环结构自由能特征谱(矩阵)。其它哺乳动物物种的microRNA茎环结构自由能特征谱可以用同样的方法产生。
[0023] 对待测茎环结构的自由能分布谱扫描，找到与特征模式最匹配的位置，即可确定待测茎环结构中Pre-microRNA末端的位置。与特征能谱的匹配可使用多种方法，如随机森林法、支持向量机、神经网络等机器学习中常用的分类方法，以找到最佳匹配为原则。
[0024] 本发明步骤(6)中所述标准转换关系为microRNA前体二级结构与microRNA成熟体等效长度之间的转换关系矩阵：
[0025]
[0026] 转换矩阵T用于处理microRNA前体所含的三种结构类型：第一行是类型一，即3’端非配对结构的转换参数，第二行是类型二，即对称的内环结构的转换参数，第三行是类型三，即鼓包结构的转换参数；
[0027] 根据转换关系矩阵，用下式计算等效长度：
[0028]
[0029] 其中，x为各种类型的结构所含的核苷酸数目，L为转换后的等效长度。将Pre-miRNA二级结构归属为成熟体等效长度后，统一以等效长度20在各Pre-miRNA二级结构中截取相应的成熟体序列。
[0030] 本发明方法中所用到的基因表达谱芯片检测和识别装置为本领域常用的检测设备。
[0031] 本发明步骤(7)设定的等效总长度为10～30，优选地为20。
[0032] 有益效果：本发明的主要目的是针对现有方法无法准确地从基因组序列中提取microRNA成熟体(功能形式)序列探针的问题，提供一种基于自由能量分布特征的microRNA探针序列的设计方法。鉴于microRNA数据库能够提供的数据不足，传统上仅使用数据库的序列作为microRNA检测探针，其检测范围和数量受到限制，而使用本方法设计的探针则具有检测新microRNA的能力，且可用于多种脊椎动物microNRA表达谱的检测。附图说明
[0033] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0034] 图1为本发明中microRNA表达谱芯片检测装置的工作流程图。
[0035] 图2为本发明方法的流程图。
[0036] 图3为本发明判断含microRNA茎环结构的方法流程图。
[0037] 图4为本发明含microRNA茎环结构的自由能谱计算示意图。
[0038] 图5为本发明随机森林法确定待测Pre-miRNA茎环结构末端位置流程图。
[0039] 图6为本发明microRNA芯片探针序列设计效果检验结果图。具体实施方式：
[0040] 如图1所示，按检测需求根据数据库收录的和计算方法分析microRNA成熟体序列设计芯片探针，并设计内标和外标探针；在基底上合成探针或探针合成后用点样仪点制固定在芯片的基底上；将待测样本进行荧光标记后，加样于高通量生物芯片检测装置中，与芯片上的microRNA探针杂交，杂交完毕后清洗去杂物；光电部分检测，例如荧光信号图像扫描，记录microRNA表达强度数据，将数据预处理，产生microRNA表达谱数据。
[0041] 本发明实施例的方法具体如图2所示：
[0042] 步骤1，输入基因组的核酸序列，使用现有的计算机技术提取间距小于120nt的相互配对作为茎种。
[0043] 步骤2，计算茎种所属序列区域(对于短序列需将序列延伸之130bp)的二级结构，将序列对折并且固定茎种的配对，然后以递归的方式调整各个位置上碱基的配对形式以生成各种可能的二级结构。
[0044] 步骤3，判断茎种所属二级结构是否符合含microRNA茎环结构的判据，如果判断结果为否，则抛弃该结构，重新进行步骤3；如果判断结果为是，输出含microRNA茎环结构，执行步骤4。图3详细说明了步骤3，包括：
[0045] 步骤31，判断茎种所属二级结构的能量、配对碱基数是否符合判据，其中能量的判据为-0.35kJ/mol·base以下，配对碱基数所占的百分比为65％以上；
[0046] 步骤32，计算综合贡献PE值，并判断能量和配对碱基数的综合贡献PE值是否为最大值，如果是最大值，则进行下一步骤，如果不是最大值，则重新计算综合贡献PE值。两者的综合贡献根据公式PE＝PairBases×(1-k)-Energy×k计算，其中，PairBases表示该茎环结构的配对碱基数，Energy表示该茎环结构的能量，k为两者间的权重值，取值范围为0.6～1.0，最优选地的k值为0.8，取PE值最大为最佳二级结构。
[0047] 步骤4，计算含microRNA茎环结构的自由能分布谱。计算一个含microRNA茎环结构的自由能分布谱的方法示于图4，其中斜体字母代表已知的microRNA成熟体序列。图4以含人microRNA：has-mir-96的部分茎环结构为例解释自由能分布谱的计算方法。图4中，最左边的环状结构为含microRNA茎环结构的环部，其余部分为茎部。以下针对茎部进行叙述。茎部最左边为连续的3个碱基配对(又称碱基对)，形成2个面。对于连续配对结构，直接利用文献数据赋值(文献5：David H.Mattews et al.(1999)Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction ofRNA Secondary Structure.J.Mol.Biol.288：p911-940)，这两个面的自由能参数值从左到右依次为：-1.4和-2.5；紧接着是一个不对称的非配对结构，较长的一边比另一边多3个碱基。对于各类不对称的非配对环结构，在其较长的边上按碱基平均分割。对于这个不对称结构，分割为4个小面，每个小面的能量值均为0.8。间隔一段连续的配对结构之后，继续向右是一个对称的非配对结构，两边均为4个碱基长，分割成3个小面，每个小面赋平均值0.57。对每个小面赋环面自由能平均值，即每个小面的能量之和等于环结构的自由能。因为尽管较大的结构在mfold算法中只有一个能量值，但实际上却与好几个堆积面的大小相当，这样处理是为了使能量与结构的实际空间位置对应起来。图4中，椭圆中的数字表示该例中各个小面具体的能量值。
[0048] 步骤5，使用相应物种的自由能特征谱，对含microRNA茎环结构的能谱扫描，确定Pre-microRNA末端位置。特定物种microRNA茎环结构拥有其特定的自由能特征谱，脊椎动物拥有相近的自由能特征谱。对某物种所有已知microRNA茎环结构的自由能分布谱进行统计分析，可获得该物种的自由能特征谱。具体为：1)从mirBase数据库(http://www.mirbase.org)中获取所有human pre-microRNA，去除冗余数据(即重复性数据)；2)再根据mirBase中的microRNA基因组位置注释信息从人基因组序列(http://www.ensembl.org)中以pre-microRNA为中心提取130nt长的序列片段；3)使用RNAfold of Vienna package 1.8(文献6：Ivo L.H.(2003)Vienna RNA SecondaryStructure Server.Nucleic Acids Research.31，3429-3431)计算其RNA二级结构(茎环结构)；4)进一步计算这些含microRNA茎环结构的自由能分布谱(方法如步骤(4)中所述)；5)将所有这些已知的人的含microRNA茎环结构自由能分布谱以其pre-microRNA末端位置对齐，即构成人microRNA茎环结构自由能特征谱(矩阵)。
[0049] 本步骤中使用随机森林(RF)法确定待测Pre-microRNA茎环结构末端位置，图5为流程图。以待测茎环结构的环区为中心，取50nt至80nt之间的茎区为能谱扫描范围，用长度为20nt的窗口扫描待测茎环结构的能谱，使用随机森林算法程序计算该窗口与特征能谱具有相同特征的概率，取概率最大处对应的位置为pre-microRNA末端。在执行随机森林法计算时，先对特征能谱采样，获得以已知pre-microRNA末端为起点、长度为20nt的特征能谱构成的正样本集和末端在随机位置的负样本集，生成100个决策树，然后利用决策树对待测茎环结构能谱在指定扫描区域逐点计算取正概率。取正概率最大，即表明以该点为起点的能谱与正样本集最匹配。利用与特征谱的匹配确定待测Pre-microRNA茎环结构末端位置也可以使用SVM、神经网络等其它机器学习方法，关键是找到与特征谱的最佳匹配。方法不同，寻找最佳匹配的效果会有差异。
[0050] 步骤6，利用标准转换关系将Pre-miRNA二级结构归属为成熟体等效长度。标准转换关系指Pre-miRNA二级结构与成熟体等效长度之间的转换关系矩阵：
[0051]
[0052] 转换矩阵T用于处理Pre-miRNA所含的三种结构类型：第一行是类型一，3’端非配对结构，(所述3’端指Pre-microRNA序列的末端，序列起始端称为5’端)的转换参数，第二行是结构类型二(对称的内环结构)的转换参数，第三行是结构类型三(鼓包结构)的转换参数。设各种类型的结构所含的核苷酸数目为x，则转换为成熟体中的序列长度为L；使用转换矩阵中的参数对一个Pre-miRNA二级结构中所含的结构类型进行处理，分别获得其对应的等效长度；对于配对结构，则不需处理，其等效长度与配对长度相等。
[0053]
[0054] 步骤7，用特定等效长度在Pre-microRNA二级结构中截取microRNA成熟体序列并输出所获得的microRNA成熟体序列。即利用步骤6获得的Pre-miRNA二级结构归属结果，从分析的Pre-miRNA的3’末端以等效长度20截取相应序列，输出microRNA成熟体序列。
[0055] 由于目前人们还没有获得任何一个物种的全部microRNA，所以只能利用已知microRNA为样本来检验本发明的效果。利用900条含已知microRNA的序列进行成熟体序列设计检验，准确率达91％。其中，对于末端存在2个核苷酸的设计误差，因其对芯片检测能力影响较小，所以可认为是成功的设计。图6展示了部分检验结果，其中，编号为microRNA数据库的标识号，粗斜体代表已知的准确microRNA成熟体序列，在其下面是使用本方法设计的microRNA探针序列。以人microRNA：has-mir-320c-1为例，预测的探针序列在起始端仅比已知的准确序列多出一个碱基；对于has-mir-1468，预测的探针序列在末端仅比已知的准确序列多出一个碱基；而对于小鼠mmu-mir-743b，预测的探针序列与已知序列完全一致。由此可以得出，本发明方法设计的microRNA探针具有较高的准确性。
[0057] 本发明提供了一种microRNA探针序列的设计方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
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