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基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳 烃的方法

阅读：111发布：2020-05-17

专利汇可以提供基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，采用向待测样品加入前处理剂，利用不对称相电流进行脉冲刺激，提高指示物与目标物的结合率，然后将萃取剂雾化后随增压后的CO2气体鼓入所述待萃取样本，同时进行超声空化，缩短低温萃取时间，提高萃取效率，再冷冻去除萃取相，最后利用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测尿液中未代谢的多环芳烃。本发明能有效地排除分析样品中各种基质的干扰，灵敏性和可靠性更高。，下面是基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，其特征在于，包括以下步骤；
S1：取10ml尿液标本与5ml酸性缓冲液混合，加入同位素标记的多环芳烃混标溶液作为回收率指示物，得到待测样品；
S2：向所述待测样品加入一定量的前处理剂，利用电极搅拌头在20-25℃条件下搅拌1-
5min，利用电极激发前处理剂对待测样品进行预处理，得到预处理尿液样本；
S3：利用酸性缓冲液对电极搅拌头浸泡清洗，清洗后的酸性缓冲液与预处理尿液样本混合，得到待萃取样本，降温至0-4℃，将一定量的萃取剂雾化并随增压后的CO2气体鼓入所述待萃取样本，同时进行超声空化，进行一次萃取，当鼓入完毕后，转移到旋涡混合器上搅拌1min，进行二次萃取，最后在5000rpm下离心10min，形成含沉淀尿液样本；
S4：将所述含沉淀尿液样本在-20℃至-30℃的冰柜中放置4h，进行相分离，利用氮吹浓缩至0.5ml，再次放入-20℃至-30℃的冰柜中进行二次分离，去除残留水分，得到萃取液；
S5：将所述萃取液用0.22μm 净化滤膜过滤，滤液氮吹至干，有机溶液定容至100μ，加入进样内标后，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述酸性缓冲为醋酸铵缓冲液或者乙酸缓冲液，浓度为1mol/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述同位素标记的多环芳烃混标溶液选用浓度为10ng/ml的16种氘代多环芳烃同位素标准溶液1ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理剂由三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯、氯化钠、氯化钾按照质量比为2:2:1:1组成，前处理剂加入量为1ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述电极激发前处理剂采用先阴极相后阳极相的双相不对称矩形波交替刺激，工作参数为：首先采用阴极相持续刺激5ms，然后再以阳极相持续刺激10ms，阴极相与阳极相的时间间隔为1ms，阴极相与阳极相的幅值比为5，持续交替刺激，刺激阈值为7.5mA。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述萃取剂的加入量为15-20ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述萃取剂是由乙腈和液态二氧化碳按照体积比为2-3：1混合而成。
8.如权利要求1或6或7所述的方法，其特征在于，S3中所述萃取剂雾化是采用气雾剂喷雾发生器将萃取剂雾化成粒径为2-6μm的微珠，伴随CO2气体2-4MPa压力鼓入所述所述待萃取样本，CO2气体与萃取剂的气液体积比10-50:1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述超声空化的工作频率为25-29KHz/s，萃取的时间为10min。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S5中所述气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测的方法包括：
色谱条件：进样口温度为280℃，进样量为1μL，不分流进样，流速为1.0mL/min；升温程序为：第一阶段以50℃保持3min；第二阶段以10℃/min升到150℃，保持8min；第三阶段以5℃/min升到230℃，保持4min；第四阶段以4℃/min升到310℃，保持10min；
质谱条件：采用EI源作为电子轰击离子源，电子能量为70eV；离子源温度为210℃；传输线温度为260℃，扫描范围m/z120-310。
气相色谱-三重四极杆串联质谱检出限为0.02μg/L，定量限为0.34μg/L。

说明书全文

基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法

技术领域

[0001] 本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法。

背景技术

[0002] 多环芳烃(PAHs)是一类广泛存在的持久性有机污染物，由于致癌性、三致效应以及在全球分布的广泛性，PAHs对人体健康的潜在危害成为世界各国广泛关注的环境污染问题，人体内暴露水平的评估是开展PAHs健康风险评价的重要基础科学数据。研究表明，尿中PAHs代谢物的测定通常与PAHs暴露密切相关，所以传统的研究一直将羟基PAHs作为为反映人体PAHs内暴露负荷的重要生物标志物。近些年，越来越多的研究倾向于使用未代谢的PAHs作为反映人体PAHs内暴露负荷的标志物，有研究认为即使在低水平的PAHs暴露情况下，尿液中未代谢的PAHs也可作为职业暴露PAHs研究的生物标志物，还有有研究认为未代谢的PAHs可以为多PAHs暴露研究获取更多的信息，甚至可能通过未代谢的多环芳来评价致癌多环芳烃的暴露量。测定尿液中未代谢的多PAHs，为多环芳烃内暴露的研究提供了一种新方法。同羟基PAHs的监测相比较，未代谢PAHs的监测具有以下优势：(1)未代谢的PAHs可以更直观的反应多环芳烃内暴露情况；(2)未代谢PAHs受其它因素的影响(譬如吸烟、排尿量(尿液肌酐浓度)更小；(3)对尿液中PAHs的检测可以获得更丰富的PAHs 单体的内暴露信息，譬如五环和六苯环的PAHs，这其中苯并(a)芘的检出尤其值得关注。

[0003] 目前的研究还存在一些缺陷，研究样本数量较少，往往只有一二十人，并且均为横断面研究，研究结论的说服力缺乏足够的说服力。尿液中未代谢PAHs的萃取方法均为固相微萃取，该技术成本较高。

发明内容

[0004] 针对上述提出的技术问题，本发明提供一种基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，建立适合尿液中未代谢PAHs检测的高灵敏度方法。

[0005] 本发明的技术方案为：一种基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，其特征在于，包括以下步骤；

[0006] S1：取10ml尿液标本与5ml酸性缓冲液混合，加入同位素标记的多环芳烃混标溶液作为回收率指示物，得到待测样品；

[0007] S2：向所述待测样品加入一定量的前处理剂，利用电极搅拌头在20-25℃条件下搅拌1-5min，利用电极激发前处理剂对待测样品进行预处理，得到预处理尿液样本；可提高指示物与目标物的结合率，进而提高尿液中多环芳烃的加标回收率。

[0008] S3：利用酸性缓冲液对电极搅拌头浸泡清洗，清洗后的酸性缓冲液与预处理尿液样本混合，得到待萃取样本，降温至0-4℃，将一定量的萃取剂雾化并随增压后的CO2气体鼓入所述待萃取样本，同时进行超声空化，进行一次萃取，当鼓入完毕后，转移到旋涡混合器上搅拌1min，进行二次萃取，最后在5000rpm下离心10min，形成含沉淀尿液样本；在低温的条件下能够有效保护待测目标物，减少误差损失，将萃取剂雾化可在低温下增大与待萃取样本中待测目标物的接触面积，此外，通入CO2气体可辅助雾化后的萃取剂以一定压力分散式与萃取样本最大化接触，超声空化可以持续保证萃取剂与萃取样本充分接触，缩短低温萃取时间，提高萃取效率。

[0009] S4：将所述含沉淀尿液样本在-20℃至-30℃的冰柜中放置4h，进行相分离，利用氮吹浓缩至0.5ml，再次放入-20℃至-30℃的冰柜中进行二次分离，去除残留水分，得到萃取液；采用低温冷冻萃取，易于待测组分富集，检测的可靠性更高。

[0010] S5：将所述萃取液用0.22μm 净化滤膜过滤，滤液氮吹至干，有机溶液定容至100μ，加入进样内标后，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测。气相色谱-三重四极杆串联质谱是一种选择性和灵敏度极佳的检测技术，这种方法在检测基质干扰严重的样品中的痕量待测物时表现非常出色。

[0011] 进一步地，S1和S3中所述酸性缓冲为醋酸铵缓冲液或者乙酸缓冲液，浓度为1mol/L。

[0012] 进一步地，S1中所述同位素标记的多环芳烃混标溶液选用浓度为10ng/ml的16种氘代多环芳烃同位素标准溶液1ml，购买于武汉睿辰标物科技有限公司。

[0013] 进一步地，所述前处理剂由三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯、氯化钠、氯化钾按照质量比为2:2:1:1组成，前处理剂加入量为1ml。所述氯化钠、氯化钾为电解质，便于提高样品的导电率，利用电流提高样本内化学物质的活跃值，同时三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯用于对待测多环芳烃进行保护，防止受其它高活跃杂质的干扰，用于提高标记物与目标物的结合率。

[0014] 进一步地，S2中所述电极激发前处理剂采用先阴极相后阳极相的双相不对称矩形波交替刺激，工作参数为：首先采用阴极相持续刺激5ms，然后再以阳极相持续刺激10ms，阴极相与阳极相的时间间隔为1ms，阴极相与阳极相的幅值比为5，持续交替刺激，刺激阈值为7.5mA。相对于直接利用对称的阴阳极电流同时刺激，本发明的刺激方法可针对性差异化地激发样本内不同化学物质的活跃度，为标记物和目标物提供了高识别率通道，提高二者的结合率，进而提高加标回收率。

[0015] 进一步地，S3中所述萃取剂的加入量为15-20ml。

[0016] 进一步地，S3中所述萃取剂是由乙腈和液态二氧化碳按照体积比为2-3：1混合而成，液态二氧化碳不仅可以促进乙腈对多环芳烃的萃取，还可以对乙腈溶液进行稀释，使其更好被雾化，雾化微粒更加细致均匀，乙腈和液态二氧化碳的体积比小于2:1时，稀释效果不够，萃取剂不易被雾化，而当比例大于3:1时则会造成乙腈浓度偏低，不利于萃取。

[0017] 进一步地，S3中所述萃取剂雾化是采用气雾剂喷雾发生器将萃取剂雾化成粒径为2-6μm的微珠，粒径太小容易随着气泡逸出，粒径太大则导致接触面积较小，不利于萃取。伴随CO2气体2-4MPa压力鼓入所述所述待萃取样本，CO2气体与萃取剂的气液体积比10-50:1。
压力可以增加萃取剂与待测物质的接触率，更易萃取成功。

[0018] 进一步地，S3中所述超声空化的工作频率为25-29KHz/s，萃取的时间为10min。

[0019] 进一步地，S5中所述净化滤膜采用活化处理后的特氟龙滤膜，活化处理过程为，先将特氟龙滤膜采用盐酸清洗1-3次，冲洗至中性，然后将纳米碳凝胶与去离子水按照体积比为1:3-4充分混合得到活化液，水温控制在恒温40℃，将酸洗后的特氟龙滤膜浸泡在所述活化液中10h，每隔2小时取出特氟龙滤膜，低温干燥后再次浸泡，即得活化后的净化滤膜。经过纳米碳凝胶活化后的特氟龙滤膜极大的改善了特氟龙滤膜的比表面积，并在其表面形成选择吸附性层，能有效对大于0.22μm孔径的杂质进行拦截，对小于0.22μm孔径的干扰物进行吸附，降低了分析的干扰误差。

[0020] 进一步地，S5中所述气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测的方法包括：

[0021] 色谱条件：进样口温度为280℃，进样量为1μL，不分流进样，流速为1.0mL/min；升温程序为：第一阶段以50℃保持3min；第二阶段以10℃/min升到150℃，保持8min；第三阶段以5℃/min升到230℃，保持4min；第四阶段以4℃/min升到310℃，保持10min；

[0022] 质谱条件：采用EI源作为电子轰击离子源，电子能量为70eV；离子源温度为210℃；传输线温度为260℃，扫描范围m/z120-310。

[0023] 气相色谱-三重四极杆串联质谱检出限为0.02μg/L，定量限为0.34μg/L。

[0024] 本发明的有益效果为：

[0025] (1)本发明向待测样品加入前处理剂，利用不对称相电流进行脉冲刺激，可提高指示物与目标物的结合率，进而提高尿液中多环芳烃的加标回收率。

[0026] (2)本发明将萃取剂雾化后随增压后的CO2气体鼓入所述待萃取样本，同时进行超声空化，；在低温的条件下能够有效保护待测目标物，减少误差损失，将萃取剂雾化可在低温下增大与待萃取样本中待测目标物的接触面积，通入CO2气体可辅助雾化后的萃取剂以一定压力分散式与萃取样本最大化接触，超声空化可以持续保证萃取剂与萃取样本充分接触，缩短低温萃取时间，提高萃取效率。

[0027] (3)本发明能有效地排除分析样品中各种基质的干扰，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测尿液中未代谢的多环芳烃，具有选择性和灵敏性高等优点。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] (1)样品的采集

[0030] 尿液样本的采集对象为小学的四年级学生，尿液样品为连续采集三天的儿童晨尿。

[0031] (2)实验材料和仪器

[0032] 仪器：气相色谱—三重四级杆串联质谱仪、氮吹仪(ETEL4MG-2200)、涡旋仪(SI Vortex-2)、离心机(DT5-2)、气雾剂喷雾发生器(TSI 3079)、二氧化碳气泵。

[0033] 材料：乙腈、正己烷、甲苯、壬烷、液体二氧化碳、三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯、氯化钠、氯化钾、16种氘代多环芳烃同位素标准溶液等，如无特殊说明，本实施例中的试剂均为市售产品。

[0034] (3)实验方法

[0035] 本实施例主要采用的是利用低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，包括以下步骤；

[0036] S1：取10ml尿液标本与5ml乙酸缓冲液混合，加入1ml 16种氘代多环芳烃同位素标准溶液(购买于武汉睿辰标物科技有限公司)作为回收率指示物，得到待测样品；乙酸缓冲液也可替换为醋酸铵缓冲液，浓度为1mol/L。

[0037] S2：向所述待测样品加入一定量的前处理剂，利用电极搅拌头在20℃条件下搅拌1min，利用电极激发前处理剂对待测样品进行预处理，得到预处理尿液样本；所述前处理剂由三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯、氯化钠、氯化钾按照质量比为2:2:1:1组成，前处理剂加入量为1ml。所述氯化钠、氯化钾为电解质，便于提高样品的导电率，利用电流提高样本内化学物质的活跃值，同时三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯用于对待测多环芳烃进行保护，防止受其它高活跃杂质的干扰，用于提高标记物与目标物的结合率。电极搅拌头的阴阳极同时刺激为10ms，每次间隔1ms，刺激阈值为7.5mA。

[0038] S3：利用乙酸缓冲液对电极搅拌头浸泡清洗，清洗后的乙酸缓冲液与预处理尿液样本混合，得到待萃取样本，降温至0℃，将15ml的萃取剂(乙腈)雾化并随增压后的CO2气体鼓入所述待萃取样本，同时进行超声空化，超声空化的工作频率为25KHz/s，萃取的时间为10min，进行一次萃取，当鼓入完毕后，转移到旋涡混合器上搅拌1min，进行二次萃取，最后在5000rpm下离心10min，形成含沉淀尿液样本；在低温的条件下能够有效保护待测目标物，减少误差损失，将萃取剂雾化可在低温下增大与待萃取样本中待测目标物的接触面积，此外，通入CO2气体可辅助雾化后的萃取剂以一定压力分散式与萃取样本最大化接触，超声空化可以持续保证萃取剂与萃取样本充分接触，缩短低温萃取时间，提高萃取效率。

[0039] S4：向所述含沉淀尿液样本中加入0.2mL正己烷+甲苯(1：1)，然后在-20℃的冰柜中放置4h，进行相分离，利用氮吹浓缩至0.5ml，再次放入-20℃至-30℃的冰柜中进行二次分离，去除残留水分，得到萃取液；采用低温冷冻萃取，易于待测组分富集，检测的可靠性更高。

[0040] S5：将所述萃取液用0.22μm净化滤膜(特氟龙滤膜)过滤，滤液氮吹至干，加入甲苯+壬烷(8：2)定容至100μ，加入进样内标后，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测。气相色谱-三重四极杆串联质谱是一种选择性和灵敏度极佳的检测技术，这种方法在检测基质干扰严重的样品中的痕量待测物时表现非常出色。

[0041] 其中，气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测的方法包括：

[0042] 色谱条件：进样口温度为280℃，进样量为1μL，不分流进样，流速为1.0mL/min；升温程序为：第一阶段以50℃保持3min；第二阶段以10℃/min升到150℃，保持8min；第三阶段以5℃/min升到230℃，保持4min；第四阶段以4℃/min升到310℃，保持10min；

[0043] 质谱条件：采用EI源作为电子轰击离子源，电子能量为70eV；离子源温度为210℃；传输线温度为260℃，扫描范围m/z120-310。

[0044] 气相色谱-三重四极杆串联质谱检出限为0.02μg/L，定量限为0.34μg/L。

[0045] 实施例2

[0046] 本实施例主要采用的是利用低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，包括以下步骤；

[0047] S1：取10ml尿液标本与5ml乙酸缓冲液混合，加入1ml 16种氘代多环芳烃同位素标准溶液(购买于武汉睿辰标物科技有限公司)作为回收率指示物，得到待测样品；乙酸缓冲液也可替换为醋酸铵缓冲液，浓度为1mol/L。

[0048] S2：向所述待测样品加入一定量的前处理剂，利用电极搅拌头在25℃条件下搅拌3min，利用电极激发前处理剂对待测样品进行预处理，得到预处理尿液样本；所述前处理剂由三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯、氯化钠、氯化钾按照质量比为2:2:1:1组成，前处理剂加入量为1ml。所述氯化钠、氯化钾为电解质，便于提高样品的导电率，利用电流提高样本内化学物质的活跃值，同时三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯用于对待测多环芳烃进行保护，防止受其它高活跃杂质的干扰，用于提高标记物与目标物的结合率。所述电极激发前处理剂采用先阴极相后阳极相的双相不对称矩形波交替刺激，工作参数为：首先采用阴极相持续刺激5ms，然后再以阳极相持续刺激10ms，阴极相与阳极相的时间间隔为1ms，阴极相与阳极相的幅值比为5，持续交替刺激，刺激阈值为7.5mA。相对于直接利用对称的阴阳极电流同时刺激，本发明的刺激方法可针对性差异化地激发样本内不同化学物质的活跃度，为标记物和目标物提供了高识别率通道，提高二者的结合率，进而提高加标回收率。

[0049] S3：利用乙酸缓冲液对电极搅拌头浸泡清洗，清洗后的乙酸缓冲液与预处理尿液样本混合，得到待萃取样本，降温至0℃，将20ml的萃取剂(乙腈)雾化并随增压后的CO2气体鼓入所述待萃取样本，同时进行超声空化，超声空化的工作频率为29KHz/s，萃取的时间为10min，进行一次萃取，当鼓入完毕后，转移到旋涡混合器上搅拌1min，进行二次萃取，最后在5000rpm下离心10min，形成含沉淀尿液样本；在低温的条件下能够有效保护待测目标物，减少误差损失，将萃取剂雾化可在低温下增大与待萃取样本中待测目标物的接触面积，此外，通入CO2气体可辅助雾化后的萃取剂以一定压力分散式与萃取样本最大化接触，超声空化可以持续保证萃取剂与萃取样本充分接触，缩短低温萃取时间，提高萃取效率。

[0050] S4：向所述含沉淀尿液样本中加入0.2mL正己烷+甲苯(1：1)，然后在-30℃的冰柜中放置4h，进行相分离，利用氮吹浓缩至0.5ml，再次放入-30℃的冰柜中进行二次分离，去除残留水分，得到萃取液；采用低温冷冻萃取，易于待测组分富集，检测的可靠性更高。

[0051] S5：将所述萃取液用0.22μm净化滤膜(特氟龙滤膜)过滤，滤液氮吹至干，加入甲苯+壬烷(8：2)定容至100μ，加入进样内标后，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测。气相色谱-三重四极杆串联质谱是一种选择性和灵敏度极佳的检测技术，这种方法在检测基质干扰严重的样品中的痕量待测物时表现非常出色。

[0052] 其中，气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测的方法包括：

[0053] 色谱条件：进样口温度为280℃，进样量为1μL，不分流进样，流速为1.0mL/min；升温程序为：第一阶段以50℃保持3min；第二阶段以10℃/min升到150℃，保持8min；第三阶段以5℃/min升到230℃，保持4min；第四阶段以4℃/min升到310℃，保持10min；

[0054] 质谱条件：采用EI源作为电子轰击离子源，电子能量为70eV；离子源温度为210℃；传输线温度为260℃，扫描范围m/z120-310。

[0055] 气相色谱-三重四极杆串联质谱检出限为0.02μg/L，定量限为0.34μg/L。

[0056] 实施例3

[0057] 本实施例主要采用的是利用低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，包括以下步骤；

[0058] S1：取10ml尿液标本与5ml乙酸缓冲液混合，加入1ml 16种氘代多环芳烃同位素标准溶液(购买于武汉睿辰标物科技有限公司)作为回收率指示物，得到待测样品；乙酸缓冲液也可替换为醋酸铵缓冲液，浓度为1mol/L。

[0059] S2：向所述待测样品加入一定量的前处理剂，利用电极搅拌头在22℃条件下搅拌5min，利用电极激发前处理剂对待测样品进行预处理，得到预处理尿液样本；所述前处理剂由三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯、氯化钠、氯化钾按照质量比为2:2:1:1组成，前处理剂加入量为1ml。所述氯化钠、氯化钾为电解质，便于提高样品的导电率，利用电流提高样本内化学物质的活跃值，同时三甲基氯硅烷、二叔丁基二碳酸酯用于对待测多环芳烃进行保护，防止受其它高活跃杂质的干扰，用于提高标记物与目标物的结合率。所述电极激发前处理剂采用先阴极相后阳极相的双相不对称矩形波交替刺激，工作参数为：首先采用阴极相持续刺激5ms，然后再以阳极相持续刺激10ms，阴极相与阳极相的时间间隔为1ms，阴极相与阳极相的幅值比为5，持续交替刺激，刺激阈值为7.5mA。相对于直接利用对称的阴阳极电流同时刺激，本发明的刺激方法可针对性差异化地激发样本内不同化学物质的活跃度，为标记物和目标物提供了高识别率通道，提高二者的结合率，进而提高加标回收率。

[0060] S3：利用乙酸缓冲液对电极搅拌头浸泡清洗，清洗后的乙酸缓冲液与预处理尿液样本混合，得到待萃取样本，降温至0℃，将18ml的萃取剂雾化并随增压后的CO2气体鼓入所述待萃取样本，同时进行超声空化，超声空化的工作频率为27KHz/s，萃取的时间为10min，进行一次萃取，当鼓入完毕后，转移到旋涡混合器上搅拌1min，进行二次萃取，最后在5000rpm下离心10min，形成含沉淀尿液样本；萃取剂是由乙腈和液态二氧化碳按照体积比为2-3：1混合而成，液态二氧化碳不仅可以促进乙腈对多环芳烃的萃取，还可以对乙腈溶液进行稀释，使其更好被雾化，雾化微粒更加细致均匀，乙腈和液态二氧化碳的体积比小于2:
1时，稀释效果不够，萃取剂不易被雾化，而当比例大于3:1时则会造成乙腈浓度偏低，不利于萃取。在低温的条件下能够有效保护待测目标物，减少误差损失，将萃取剂雾化可在低温下增大与待萃取样本中待测目标物的接触面积，此外，通入CO2气体可辅助雾化后的萃取剂以一定压力分散式与萃取样本最大化接触，超声空化可以持续保证萃取剂与萃取样本充分接触，缩短低温萃取时间，提高萃取效率。

[0061] S4：向所述含沉淀尿液样本中加入0.2mL正己烷+甲苯(1：1)，然后在-25℃的冰柜中放置4h，进行相分离，利用氮吹浓缩至0.5ml，再次放入-25℃的冰柜中进行二次分离，去除残留水分，得到萃取液；采用低温冷冻萃取，易于待测组分富集，检测的可靠性更高。

[0062] S5：将所述萃取液用0.22μm净化滤膜(特氟龙滤膜)过滤，滤液氮吹至干，加入甲苯+壬烷(8：2)定容至100μ，加入进样内标后，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测。气相色谱-三重四极杆串联质谱是一种选择性和灵敏度极佳的检测技术，这种方法在检测基质干扰严重的样品中的痕量待测物时表现非常出色。

[0063] 其中，气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测的方法包括：

[0064] 色谱条件：进样口温度为280℃，进样量为1μL，不分流进样，流速为1.0mL/min；升温程序为：第一阶段以50℃保持3min；第二阶段以10℃/min升到150℃，保持8min；第三阶段以5℃/min升到230℃，保持4min；第四阶段以4℃/min升到310℃，保持10min；

[0065] 质谱条件：采用EI源作为电子轰击离子源，电子能量为70eV；离子源温度为210℃；传输线温度为260℃，扫描范围m/z120-310。

[0066] 气相色谱-三重四极杆串联质谱检出限为0.02μg/L，定量限为0.34μg/L。

[0067] 实施例4

[0068] 作为实施例3的进一步改进，本实施例对作为净化滤膜的特氟龙滤膜进行活化处理，活化处理过程为，先将特氟龙滤膜采用盐酸清洗3次，冲洗至中性，然后将纳米碳凝胶与去离子水按照体积比为1:3.5充分混合得到活化液，水温控制在恒温40℃，将酸洗后的特氟龙滤膜浸泡在所述活化液中10h，每隔2小时取出特氟龙滤膜，低温干燥后再次浸泡，即得活化后的净化滤膜。经过纳米碳凝胶活化后的特氟龙滤膜极大的改善了特氟龙滤膜的比表面积，并在其表面形成选择吸附性层，能有效对大于0.22μm孔径的杂质进行拦截，对小于0.22μm孔径的干扰物进行吸附，降低了分析的干扰误差。

[0069] 对比例

[0070] 利用低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法，包括以下步骤；

[0071] 尿液中未代谢PAHs前处理：取10mL尿液样品，加入1ml 16种氘代多环芳烃同位素标准溶液(购买于武汉睿辰标物科技有限公司)作为回收率指示物，加入5mL醋酸铵缓冲溶液(1mol/L)，加入10mL乙腈。样品经涡旋混匀后静置1min，然后5000r/min离心10min。将离心处理后的样品至于-30℃冰箱中冷冻4h左右，取出样品，倒出有机相。重复上述操作一次，合并有机相于玻璃试管中。样品经氮吹浓缩至0.5mL左右后，加入0.2mL正己烷+甲苯(1：1)，涡旋混匀后将样品置于-30℃冰箱中冷冻0.5h左右，然后取有机相进行过滤(0.22μm特氟龙滤膜)，氮吹浓缩过滤样品并将溶剂体系转溶为甲苯+壬烷(8：2)，加入进样内标后，采用气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测。检测方法与上述实施例相同。

[0072] 实验例

[0073] 1.对尿液中未代谢的多环芳烃浓度进行检测

[0074] 将连续采集三天的儿童晨尿分为1d组，2d组，3d组，每组50例样本，采用本发明实施例1的方法对尿液中未代谢的多环芳烃浓度进行检测，验证其特征相关度。

[0075] 表1尿液样品中未代谢PAHs的浓度(ng/L)

[0076]

[0077] 由表1可以看出，利用本发明实施例1的方法对16种PAHs在儿童尿液中的未代谢水平进行了检测，其中五环、六环BbF、BkF、BaP、IcdP、DahA和BghiP为未检出，不详细讨论，其余10种环芳烃在所有样品中均有检出。结果表明，3d尿液中未代谢PAHs的浓度几何平均值的范围为20.7～2418ng/L，所有尿液样品中浓度最高的单体均为Nap，浓度几何平均值为(2165.67±220.25)，浓度最低的单体均为Chr，浓度几何平均值(24.07±4.44)。

[0078] 2.加标回收率的测定

[0079] 分别采用本发明实施例1-4以及对比例的方法对多环芳烃混合样品进行检测，混合样品共分为10组，其中，样品1和样品2采用实施例1的检测方法，样品3和样品4采用实施例2的检测方法，样品5和样品6采用实施例3的检测方法，样品7和样品8采用实施例4的检测方法，样品9和样品10采用对比例的检测方法。

[0080] 分别采用本发明实施例1、2、3的方法对多环芳烃混合样品进行检测，其中，样品1和样品2采用实施例1的检测方法，样品3和样品4采用实施例2的检测方法，样品5和样品6采用实施例3的检测方法，检测结果见表2：

[0081] 表2：各样品中NaP、Acy、Ace、Fl、Phe的定量结果

[0082]

[0083]

[0084] 由上表2可以看出，本发明的检测方法有效地排除了杂质的干扰，其检测结果中回收率在67.9％-97.9％之间，较为合理，因此本发明的检测方法对多环芳烃的的定量分析结果较为准确。

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基于低温冷冻萃取技术检测尿液中未代谢多环芳烃的方法

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