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一种提高大樱桃花粉萌发率的方法

阅读：476发布：2020-06-11

专利汇可以提供一种提高大樱桃花粉萌发率的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，包括花粉的采集、保存及花粉活力测定。解决了大樱桃花粉的收集、贮藏和萌发等技术难题，使用本发明提供的大樱桃花粉萌发固体培养基，以蒸馏水为溶剂，包含组分有0.5％琼脂、10％蔗糖、1mg·L-1吲哚乙酸、0.3％硼酸、30g·L-1聚乙二醇、10mg·L-1维生素Vc，pH为6.5，25℃光暗交替条件下培养，大樱桃花粉萌发率可达到85.3％，花粉管也能得到较好生长。花粉萌发时间短、萌发率高，具有较好的应用前景。，下面是一种提高大樱桃花粉萌发率的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)花粉的采集：4月初采集含苞待放的铃铛花带回室内，用软毛牙刷刷下花药，置于光滑纸面，用50目铁筛除去花丝，把鲜花药均匀地铺在60cm×45cm的白纸上，置于20-25℃干燥培养箱中干燥散粉，每两小时翻动一次，24h后，花药开裂散出花粉，然后，把花药倒入
100目细箩筛，把花粉筛入铝盆中，最后用毛刷将白纸上以及细箩筛上的花粉也轻轻刷入盆中；
(2)花药的保存：将筛出的花粉用硫酸纸小袋包好标记后放入塑料盒子中，再添加
1.5-2倍的变色硅胶干燥剂，花粉要分散埋在变色硅胶中，然后密封，放入-18℃冰柜里贮藏备用；
(3)固体培养基的制备：在500mL的烧杯中加入100mL蒸馏水，再加入琼脂，在微波炉中加热，使之完全熔解，然后加入蔗糖，再加入少量硼酸，在其中加入微量聚乙二醇、维生素以形成花粉粒发芽的最适环境条件，促进花粉的萌发，等到溶液冷却后，调节pH值6.5，在熬制培养基时，应在烧杯上的液面处用计号笔沿液面划线标记；当液面在熬制过程中因水分蒸发下降时，应及时添加蒸馏水，以保持培养基的标准浓度，并将熬制好的培养基溶液连烧杯放入盛有35℃热水的容器中，防止冷却凝固，以备随后使用；
(4)器皿消毒：发芽实验时所用的实验用品都要经过酒精消毒处理后备用，使用时要减少和手指接触的面积，以减少污染；
(5)花粉的播种与培养：用滴管吸取培养基溶液，滴一滴于载玻片的中央，当凝固后再进行花粉的播种；播花粉时，用经酒精消毒过的头发丝蘸取花粉，在培养基的表面轻轻震动；播好后将载玻片放置于培养皿中，要事先在培养皿内放好滤纸或棉垫并加水保湿；每种花粉做3个载玻片；而后在培养皿上用玻璃铅笔标号，并进行记录，记录内容包括花粉种类、采粉时间，播种时间；用湿纱布覆盖后加盖，放于光照培养箱内培养；花粉培养15min～
25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长；
(6)花粉的活力测定：培养3.5h～4h后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3～5个视野，每视野观察花粉数30～80粒，统计花粉萌发率。
2.根据权利要求1所述的一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，其特征在于，步骤(3)所-1 -1
述的固体培养基为0.5％琼脂+10％蔗糖+0.3％硼酸+1mg·L 吲哚乙酸+30g·L 聚乙二-1
醇+10mg·L 维生素Vc。
3.根据权利要求1所述的一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，其特征在于，步骤(4)所述的实验用品包括载玻片、盖玻片、镊子；所述消毒处理是将实验用品用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒10-15s，快速取出立即浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒6min以上，在消毒过程中轻轻晃动使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次。
4.根据权利要求1所述的一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，其特征在于，步骤(5)所述的在用头发丝蘸取花粉在培养基表面震动时，一要在培养基上划波浪线，避免头发丝过重地接触培养基，破坏培养基的表面；二要注意尽量在培养基上均匀划线，使得花粉的分布松散、均匀，不能密集成堆；三要注意适宜的播种数量。
5.根据权利要求4所述的大樱桃花粉采集与活力测定方法，其特征在于，所述的播种数量为一个显微镜视野内分布80～120粒花粉粒。
6.根据权利要求1所述的一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，其特征在于，步骤(5)所述的光照培养箱培养采用光照培养和暗培养相结合的方法；光照培养20min后转为暗培养，再隔20min后切换为光照培养，如此反复。
7.根据权利要求6所述的一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，其特征在于，所述光照-2 -1 -2
培养光源采用日光灯，温度控制在20℃-25℃，光照强度为10μmol.m .s ～13μmol.m .-1
s 。

说明书全文

一种提高大樱桃花粉萌发率的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提高植物花粉萌发率的方法，具体涉及一种一种提高大樱桃花粉萌发率的方法。

背景技术

[0002] 大樱桃属于蔷薇科落叶乔木果树，是中国北方落叶果树中继中国樱桃之后果实成熟最早的果树树种，因此，早有“春果第一枝”的美誉。在调节鲜果淡季，均衡周年供应和满足人民生活的需要方面，有着特殊的作用。一直以来，大樱桃适宜在辽宁、山东、陕西、河南、河北等地栽培，长江中下游暖冬地区由于存在着年均气温过高，尤其是夏季高温、雨水多、土质粘重等问题而被认为是大樱桃栽种的非适宜区，“花而不实”、花器畸形、坐果率偏低、畸形果率偏高等问题一直限制着大樱桃产区向低海拔地区推进。但是，由于长江中下游地区春季升温快，大樱桃生育期有望比北方适栽区明显缩短、果实成熟期提早、价格高，因而近年来大樱桃在南方地区引种试栽正逐渐受到重视。

[0003] 大樱桃绝大多数品种自花授粉不结实，在生产上必须配置授粉树或在花期人工辅助授粉才能获得预期的产量和品质。人工授粉所用的花粉主要是新鲜花粉，但也有用上年采集的贮藏花粉授粉。使用贮藏花粉时，其生活力的高低直接影响人工授粉的效果。在正常条件下，花粉在雌蕊柱头上所具有的萌发能力，就是花粉的生活力。采集的花粉和贮存的花粉，在使用之前必须作生活力的鉴定，以评价花粉是否有授精能力。所以，对花粉生活力进行测定，可以成为其以后分析坐果率高低的重要依据。此外，在杂交工作中，往往由于需要应用经贮藏的花粉或经邮寄的花粉，因此在杂交前检查是否具有生活力是十分必要的。其原理是人工创造一个适于花粉发芽的环境条件，从而鉴定花粉发芽能力的强弱。在人工创造花粉发芽的环境条件时，其培养基的种类及配比、培养温湿度对大樱桃花粉萌发具有十分重要的影响，因此找到合适的上述培养条件十分必要。

发明内容

[0004] 本发明针对目前的问题，本发明提供一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，可以有效的解决大樱桃花粉的收集、贮藏和萌发等问题。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种提高大樱桃花粉萌发率的方法，包括：

[0006] 1)花粉的采集与保存：4月初采集含苞待放的铃铛花带回室内，用软毛牙刷刷下花药，置于光滑纸面，用50目铁筛除去花丝，把鲜花药均匀地铺在60cm×45cm的白纸上，置于20-25℃干燥培养箱中干燥散粉，每两小时翻动一次，24h后，花药开裂散出花粉，然后，把花药倒入100目细箩筛，把花粉筛入铝盆中，最后用毛刷将白纸上以及细箩筛上的花粉也轻轻刷入盆中，将筛出的花粉用若干硫酸纸小袋包好标记后放入塑料盒子中，再添加1.5-2倍的变色硅胶干燥剂，花粉要分散埋在变色硅胶中，然后密封，放入-18℃冰柜里贮藏备用；

[0007] 2)花粉生活力测定

[0008] 固体培养基的制备：在500mL的烧杯中加入100mL蒸馏水，再加入琼脂，在微波炉中加热，使之完全熔解，然后加入蔗糖，制成糖液。注意在熬制时要用玻璃棒不断搅拌，使其融化均匀，还可加入微量聚乙二醇、维生素等以形成花粉粒发芽的最适环境条件。再加入少量硼酸，以促进花粉的萌发。等到溶液冷却后，调节pH值6.5。在熬制培养基时，应在烧杯上的液面处用计号笔沿液面划线标记。当液面在熬制过程中因水分蒸发下降时，应及时添加蒸馏水，以保持培养基的标准浓度，并将熬制好的培养基溶液连烧杯放入盛有35℃热水的容器中，防止冷却凝固，以备随后使用。

[0009] 器皿消毒：发芽实验时所用的载玻片、盖玻片、镊子等都要经过酒精消毒后备用，使用时要尽量减少和手指接触的面积，以减少污染。

[0010] 花粉的播种与活力测定：用滴管吸取培养基溶液，立即滴一滴于载玻片的中央，越薄越好，否则透光性差，影响在显微镜下观察，当凝固后再进行花粉的播种。播花粉时，用经酒精消毒过的头发丝蘸取花粉，在培养基的表面轻轻震动。一要在培养基上划波浪线，避免头发丝过重地接触培养基，破坏培养基的表面；二要注意尽量在培养基上均匀划线，使得花粉的分布松散、均匀，不能密集成堆；三要注意适宜的播种数量。一般情况下，一个显微镜视野以分布80～120粒花粉粒为宜。播好后将载玻片放置于培养皿中，该培养皿要事先在皿内放好滤纸或棉垫并加水用于保湿。每种花粉做3组即3个载玻片。而后要在培养皿上用玻璃铅笔标号，并进行记录，记录内容包括花粉种类、采粉时间，播种时间。用湿纱布覆盖后加盖，放于25℃的光暗培养箱内采用光照培养和暗培养相结合的方法培养。花粉培养15min～25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长。培养3.5h～4h后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复
3次，每重复随机观察3～5个视野，每视野观察花粉数30～80粒，统计花粉萌发率。

[0011] 所述的消毒处理是将实验用品用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒10-15s，快速取出立即浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒6min以上，在消毒过程中轻轻晃动使其消毒充分，最后用无菌水冲洗多次。

[0012] 所述的固体培养基为0.5％琼脂+10％蔗糖+0.3％硼酸+1mg·L-1吲哚乙酸-1 -1+30g·L 聚乙二醇+10mg·L 维生素Vc。

[0013] 所述的光照培养箱培养花粉是采用光照培养和暗培养相结合的方法，光照培养光-2 -1 -2 -1源采用日光灯，温度控制在20℃-25℃，光照强度10μmol.m .s -13μmol.m .s ，光照培养20min后转为暗培养，再隔20min后切换为光照培养，如此反复。

[0014] 本发明的有益效果是：本发明解决了大樱桃花粉的收集、贮藏和萌发等技术难题，通过采用固体培养基结合光照培养和暗培养相结合的方法交替培养花粉来测定花粉发芽情况。本发明培养基测定的花粉具有良好的萌发率，用本发明的方法对大樱桃的花粉进行培养，具有花粉萌发时间短、萌发率高等优点，具有较好的应用前景。

具体实施方式

[0015] 下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

[0016] 实施时间：2015年4月-2015年8月

[0017] 实施地点：镇江农科院华阳园区果树示范区

[0018] (一)具体实施例：

[0019] 实验品种为4年生‘布鲁克斯’大樱桃。4月初采集含苞待放的铃铛花带回室内，用软毛牙刷刷下花药，置于光滑纸面，用50目铁筛除去花丝，把鲜花药均匀地铺在60cm×45cm的白纸上，置于20-25℃干燥培养箱中干燥散粉，每两小时翻动一次，24h后，花药开裂散出花粉，然后，把花药倒入100目细箩筛，把花粉筛入铝盆中，最后用毛刷将白纸上以及细箩筛上的花粉也轻轻刷入盆中；

[0020] 采用固体培养法进行花粉萌发条件的筛选。其中固体培养基的配制方法为：在500mL的烧杯中加入100mL蒸馏水，再加入琼脂，在微波炉中加热，使之完全熔解，然后加入糖液，再加入少量硼酸，在其中加入微量聚乙二醇、维生素以形成花粉粒发芽的最适环境条件，促进花粉的萌发，等到溶液冷却后，调节pH值6.5，在熬制培养基时，应在烧杯上的液面处用计号笔沿液面划线标记；当液面在熬制过程中因水分蒸发下降时，应及时添加蒸馏水，以保持培养基的标准浓度，并将熬制好的培养基溶液连烧杯放入盛有35℃热水的容器中，防止冷却凝固，以备随后使用；

[0021] 花粉培养以10％蔗糖、硼酸0.1％、0.5％琼脂为基本培养基，pH值6.5，温度25℃，在凹玻片上用滴管滴上配好的培养基，然后用头发丝条播花粉，播好后放入铺有加湿滤纸的消毒处理好的培养皿中，然后放于25℃的光暗培养箱内采用光照培养和暗培养相结合的方法培养。花粉培养15min～25min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始快速生长。培养3.5h～4h后，以花粉管长度大于花粉粒直径为花粉萌发标准，每处理重复3次，每重复随机观察3～5个视野，一个显微镜视野分布80～120粒花粉粒，每视野观察花粉数30～80粒，统计花粉萌发率。

[0022] (二)、实施处理：

[0023] 实验(1):以不同蔗糖浓度(0，5％，10％，15％)+0.1％H3BO3+0.5％琼脂为培养基，探讨蔗糖浓度变化对花粉萌发的影响，确定最佳蔗糖浓度；

[0024] 实验(2):以最佳蔗糖浓度+不同H3BO3浓度(0，0.1％，0.3％，0.5％)+0.5％琼脂为培养基，探讨H3BO3因子对花粉萌发的影响，确定最佳H3BO3浓度；

[0025] 实验(3):以最佳蔗糖浓度+最佳H3BO3浓度+0.5％琼脂+吲哚乙酸不同浓度(0，-10.5，1，1.5，2mg·L )为培养基，探讨生长激素吲哚乙酸因子对花粉萌发的影响，确定最佳吲哚乙酸浓度；

[0026] 实验(4):以最佳蔗糖浓度+最佳H3BO3浓度+0.5％琼脂+最佳吲哚乙酸浓度+不-1同维生素Vc浓度(0，10，20mg·L )为培养基，筛选最佳Vc浓度；

[0027] 实验(5):以最佳蔗糖浓度+最佳H3BO3浓度+0.5％琼脂+最佳吲哚乙酸浓度+最-1 -1 -1佳维生素Vc浓度+不同聚乙二醇浓度(0，10g·L ，30g·L ，50g·L )为培养基，筛选最佳聚乙二醇浓度。

[0028] (三)、实施效果

[0029] 1、不同蔗糖含量对大樱桃花粉萌发率的影响

[0030] 表1不同蔗糖含量对‘布鲁克斯’大樱桃花粉萌发率的影响

[0031]蔗糖/％花粉萌发率/％
0 8.51±1.23

[0032]5 31.35±6.16
10 56.98±7.4
15 43.14±9.31

[0033] 在保持H3BO30.3％、0.5％琼脂不变时，进行不同蔗糖浓度处理的结果表明，蔗糖以10％时最适合花粉萌发，萌发率平均达约57％，与其他处理差异较为明显(表1)。

[0034] 2、不同硼酸含量对大樱桃花粉萌发率的影响

[0035] 表2不同硼酸含量对‘布鲁克斯’大樱桃花粉萌发率的影响

[0036]硼酸/％萌发率/％
0 32.53±5.2
0.1 60.45±6.15
0.3 70.12±3.48
0.5 21.75±2.94

[0037] 在保持蔗糖浓度10％、0.5％琼脂不变时，进行不同硼酸浓度处理。由表2可知，当H3BO3浓度为1％时，花粉萌发率较不加H3BO3显著提高；当H3BO3浓度为3％时，花粉萌发率最高，达到了70.12％，为不加的2倍；当H3BO3浓度为5％时，较不加H3BO3时的萌发率低。由上可见，确定H3BO3的最佳浓度为3％。

[0038] 3、不同吲哚乙酸浓度对大樱桃花粉萌发率的影响

[0039] 表3不同吲哚乙酸浓度对‘布鲁克斯’大樱桃花粉萌发率的影响

[0040]吲哚乙酸/mg·L-1 萌发率/％
0 67.1±3.06
0.5 70.78±5.63
1 73.75±5.97
1.5 66.5±4.25
2 65.12±8.29

[0041] 在保持蔗糖浓度10％、H3BO3浓度0.3％、0.5％琼脂不变时，进行不同吲哚乙酸浓度处理。由表3可知，在0～1mg/L范围内，布鲁克斯花粉萌发率随吲哚乙酸浓度增大而递增，当浓度达1mg/L时萌发率达到最高，然而当浓度达2mg/L时萌发率有所下降，并且比对照要低。

[0042] 4、不同维生素Vc浓度对大樱桃花粉萌发率的影响

[0043] 表4不同维生素Vc浓度对‘布鲁克斯’大樱桃花粉萌发率的影响

[0044]Vc/mg·L-1 萌发率/％
0 70.83±7.4
10 78.78±3.14
20 75.75±4.75

[0045] 在保持蔗糖浓度10％、H3BO3浓度3％、吲哚乙酸1mg·L-1、0.5％琼脂不变时，进行不同维生素Vc浓度处理。结果表明(表4)随着维生素Vc浓度加大，布鲁克斯花粉萌发率随之增大，当Vc浓度为20mg·L-1，花粉萌发率有所下降。综合来看，Vc浓度10mg·L-1为最佳浓度。

[0046] 5、不同聚乙二醇浓度对大樱桃花粉萌发率的影响

[0047] 表5不同聚乙二醇浓度对‘布鲁克斯’大樱桃花粉萌发率的影响

[0048]聚乙二醇/g·L-1 萌发率/％
0 69.73±4.4
10 75.13±2.49
30 83.5±7.12
50 50.47±6.19
-1 -1

[0049] 在保持蔗糖浓度10％、H3BO3浓度3％、吲哚乙酸1mg·L 、Vc浓度10mg·L 、0.5％琼脂不变时，进行不同浓度聚乙二醇处理。结果表明(表5)，适中浓度的聚乙二醇对大樱桃-1花粉的萌发具有促进作用。当聚乙二醇浓度在10～30g·L 之间时，随着浓度的升高，花-1
粉的萌发率也提高，其中聚乙二醇浓度为30g·L 时，花粉的萌发率达到最高值，为83.5％，而随着聚乙二醇浓度继续升高，花粉的萌发率反而急剧降低。

[0050] 综合以上5个实验，我们筛选出的大樱桃花粉萌发培养的最佳固体培养基组分为-1 -1 -10.5％琼脂+10％蔗糖+0.3％硼酸+1mg·L 吲哚乙酸+30g·L 聚乙二醇+10mg·L 维生素Vc。

[0051] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领

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一种提高大樱桃花粉萌发率的方法

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