リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。

特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５糖ということがある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６糖ということがある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。

バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。 また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。

バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。 バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。 バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。

原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５〜４５％のセルロース、２５〜４０％のヘミセルロース、１５〜３０％のリグニンが含まれていると言われている。 したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。

キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。

これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。

特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５糖）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。

特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。 特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５糖）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。

非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。

非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。

しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。 すなわち外来遺伝子を導入することになる。 また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。

また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。

そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。 従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。

また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。

本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。

前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６３として寄託されていることを特徴とする。

野生型Meyerozyma guilliermondiは、グルコース資化能に加えキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。 これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ−０１９６３株ということがある。）は、Meyerozyma guilliermondiの親株を菌株育種することによりキシロースの利用効率の高い菌を選抜して得た発酵菌（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２、以下、ＢＰ−０１９６２株ということがある。）に、セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を導入したものである。

前記トランスアルドラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はいずれも、Meyerozyma guilliermondiの遺伝子である。

前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、ペントースリン酸経路中の酵素であり、これを強化することによりキシロースを利用しやすくなると予測される。 また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、アセトアルデヒドからエタノールを生産する。 また、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドとＣＯ _２とを生成する。

この結果、本発明の高効率エタノール発酵菌は、外来遺伝子を導入することなく、親株より高いエタノール産生効率を得ることができる。

ＢＰ−０１９６３株と、ＢＰ−０１９６２株、Ｎ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液における糖濃度と発酵収率との関係を示すグラフである。

アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液におけるＢＰ−０１９６３株によるグルコース及びキシロースの消化量と、エタノールの生成量との経時変化を示すグラフである。

次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。

子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondiの野生株は、グルコース資化能に加えてキシロース利用能を備えているが、そのキシロース利用能はバイオエタノール生産に十分とは言えない。 そこで、本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより得られた発酵菌（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２）に、セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ遺伝子（以下、ＴＡＬ遺伝子と略記する。）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、ＡＤＨ遺伝子と略記する。）及び、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（以下、ＰＤＣ遺伝子と略記する。）を導入したものである。

前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、次のようにして得たものを用いることができる。 まず、埼玉県熊谷市産の稲わらを等量の２５質量％アンモニア水に８０℃の温度で３時間浸漬した後、アンモニアを放散させることにより前処理する。 次に、前記前処理が施された稲わらに、ｐＨ調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。 次に、前記スラリーをフィルタープレスにより固液分離し、回収された液体分を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液とする。 前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、３〜１５質量％のグルコースと、１〜１０質量％のキシロースとを含んでいる。

前記変異剤としては、例えば、N−エチル−N−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等のエチル化剤、５−ブロモ−２´−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等の塩基類似化合物、ニトロアミン、ニトロソグアニジン等のニトロソ化合物等を用いることができる。

ＢＰ−０１９６２株は、前記親株を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌の選抜を繰り返すことにより得られた変異株である。 従って、ＢＰ−０１９６２株は、Meyerozyma guilliermondiの野生株又はＮ株に比較して、外来遺伝子を導入することなく、キシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している。

ＢＰ−０１９６２株にさらに、セルフクローニングしたＴＡＬ遺伝子、ＡＤＨ遺伝子及び、ＰＤＣ遺伝子を導入した本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、本出願人により独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国 〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に寄託されている。 受託日は２０１４年１１月１９日、受託番号は、ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６３である。

前記ＴＡＬ遺伝子、ＡＤＨ遺伝子及び、ＰＤＣ遺伝子は、いずれもMeyerozyma guilliermondiの遺伝子であるので、セルフクローニングしたこれらの遺伝子をＢＰ−０１９６２株に導入しても、外来遺伝子を導入することにはならない。

この結果、ＢＰ−０１９６３株は、ＢＰ−０１９６２株又はＮ株に比較して、外来遺伝子を導入することなく、キシロース資化性及びエタノール発酵性能がさらに向上している。

ＢＰ−０１９６３株に対する、セルフクローニングしたＴＡＬ遺伝子、ＡＤＨ遺伝子及び、ＰＤＣ遺伝子の導入は、例えば、次のようにして行うことができる。

導入したい遺伝子及びそのターミネータ部（以下、遺伝子＋ターミネーター部という。）をＰＣＲ増幅する。 導入に用いたいプロモータ部をＰＣＲ増幅する。 これらは何れも本発明で用いた菌株であるMeyerozyma guilliermondiの染色体からＰＣＲ増幅する。

ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をプロモータ、遺伝子＋ターミネーター部の順になるよう、インフュージョン法を用いて、大腸菌用の市販ベクターにクローニングする。 クローニングされたベクターを大腸菌に形質転換し、ベクターを増幅する。 増幅したベクターからプロモーター及び遺伝子＋ターミネーター部を制限酵素で切出す、あるいは増幅したベクターからＰＣＲ増幅することにより、相同組換用のＤＮＡ断片を得る。

得られたＤＮＡ断片を菌株に相同組換えし、所望の菌株を得た。 相同組換にはエレクトロポレーション法を用いた。 この方法によって遺伝子を導入すると、染色体上に複数コピー導入することができるため、導入した酵素の活性を増強することができる。

相同組換用ＤＮＡ断片としては、例えば、キシロースレダクターゼのプロモーター、トランスアルドラーゼ＋ターミネーターを用いると良い。 キシロース資化の際に機能するキシロースレダクターゼのプロモーターを用いることによって、トランスアルドラーゼが効率良く作用すると考えられるからである。

キシロースレダクターゼのプロモーターは具体的には下記配列番号１及び配列番号２のプライマー、トランスアルドラーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号３及び４のプライマーを用いて増幅した。

配列番号１：AAGGCTTGGGAACTTTCTTT
配列番号２：AGCAATTGATGATTAATTTT
配列番号３：ATGACCAATTCTCTTGAACA
配列番号４：AAATTGTGCCGTGTCAAACT
また、ＧＡＰＤＨのプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ＋ターミネーターを用いると良い。 ＧＡＰＤＨは解糖系に存在する強力なプロモータであることから、解糖系の酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターとして使用することにより、効率よく作用するものと考えられる。 アルコールデヒドロゲナーゼはアセトアルデヒドをエタノールに変換する作用を持つとともに、ＮＡＤＨ依存の場合にはＮＡＤ＋を生産するため、ＮＡＤ＋依存のキシリトールデヒドロゲナーゼの作用を強化する作用がある。

ＧＡＰＤＨのプロモーターは具体的には下記配列番号５及び配列番号６のプライマー、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号７及び８のプライマーを用いて増幅した。

配列番号５：GTTGTAGCGGAGGCTCAATT
配列番号６：TGTATAATTTAAATGTGGGT
配列番号７：ATGTCAATTCCAGAATCCAT
配列番号８：CACCTTGGCTGGAAGTGCTG
ＰＤＣ遺伝子は、ＰＤＣ遺伝子のプロモーターをＧＡＰＤＨのプロモーターに置換することにより強化した。 配列番号９および配列番号１０で表される配列の間に、配列番号５および配列番号６のプライマーで増幅されるＧＡＰＤＨのプロモーターを導入することで得られるＤＮＡ断片を相同組換することで置換を行った。 配列番号９の配列がＰＤＣ遺伝子のプロモーターの終端、配列番号１０の配列がＰＤＣ遺伝子の始端を表す。

配列番号９：AGATTGCTGCAAAAATCATC
配列番号１０：ATGACAGAAATTACTTTGGG
また、この方法により得られた菌株は、遺伝子を導入しているが、セルフクローニングであるため、カルタヘナ法上、非組換菌扱いになる範疇に属するものとなっている。

次に、希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を用いて、ＢＰ−０１９６３株と、ＢＰ−０１９６３株、Ｎ株との発酵収率を比較した。

前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、次のようにして得たものを用いた。 まず、米国アイオワ州産のコーンストーバを２倍量の３．７質量％硫酸に１７０℃の温度で１０分間浸漬した後、常温に戻すことにより前処理する。 次に、前記前処理が施されたコーンストーバにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨ４に調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。 次に、前記スラリーを遠心分離により固液分離し、回収された液体分をＮａＯＨ水溶液でｐＨ６に調整し、前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液とした。 前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、例えば、３〜１５質量％のグルコースと、１〜１０質量％のキシロースとを含んでいる。

次に、１５質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６３株の培養液を培地のＯＤ _６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。 前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース４５ｇ／Ｌ、キシロース３８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。 そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、次式（１）により発酵収率を算出した。 結果を図１に示す。

発酵収率＝生成エタノール濃度/（グルコース濃度＋キシロース濃度）/０．５１１４
・・・（１）
（グルコース濃度及びキシロース濃度は培養開始前の初期濃度である）
次に、２０質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株の培養液を培地のＯＤ _６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。 前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース６４ｇ／Ｌ、キシロース４８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。 そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、式（１）により発酵収率を算出した。 結果を図１に示す。

次に、２６質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にMeyerozyma guilliermondi Ｎ株の培養液を培地のＯＤ _６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。 前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース６４ｇ／Ｌ、キシロース４８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。 そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、式（１）により発酵収率を算出した。 結果を図１に示す。

図１から、ＢＰ−０１９６３株は、Ｎ株よりも低濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液に対して、ＢＰ−０１９６２株及びＮ株よりもエタノール発酵性能に優れていることが明らかである。

次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６３株の培養液を培地のＯＤ _６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。 前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース７３．８ｇ／Ｌ、キシロース２８．３ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。 そして、所定時間毎に前記培地を採取し、キシロースの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ−８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）によりそれぞれ測定した。 結果を図２に示す。

図２から、培養開始から１２０時間後にはグルコース及びキシロースの全量が消化されており、エタノール濃度は培養時間が長くなるほど高くなることがわかる。 また、培養開始から４８時間後にはグルコース濃度が殆どゼロになっているが、その後もキシロース濃度は低下し、エタノール濃度は増加を続けていることから、ＢＰ−０１９６３株はグルコースの全量が消化された後は、キシロースを基質としてエタノール発酵を行っていることが明らかである。

符号なし。

【０００３】
ローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入している。 すなわち外来遺伝子を導入することになる。 また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
［００１５］
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
［００１６］
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。 従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
［００１７］
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。
［００１８］
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。
課題を解決するための手段［００１９］
前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６２として寄託されている菌に、セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を導入した菌であり、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９６３として寄託されていることを特徴とする。
［００２０］
野生型Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉは、グルコース資化能に加えキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。 これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ−０１９６３株ということがある。）は、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉの親株を菌株育種することによりキシロースの利用効率の

【０００８】
る配列の間に、配列番号５および配列番号６のプライマーで増幅されるＧＡＰＤＨのプロモーターを導入することで得られるＤＮＡ断片を相同組換することで置換を行った。 配列番号９の配列がＰＤＣ遺伝子のプロモーターの終端、配列番号１０の配列がＰＤＣ遺伝子の始端を表す。
［００４２］

［００４３］

次に、希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を用いて、ＢＰ−０１９６３株と、ＢＰ−０１９６２株、Ｎ株との発酵収率を比較した。

［００４４］

前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、次のようにして得たものを用いた。 まず、米国アイオワ州産のコーンストーバを２倍量の３．７質量％硫酸に１７０℃の温度で１０分間浸漬した後、常温に戻すことにより前処理する。 次に、前記前処理が施されたコーンストーバにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨ４に調整後、糖化酵素（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａ ファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。 次に、前記スラリーを遠心分離により固液分離し、回収された液体分をＮａＯＨ水溶液でｐＨ６に調整し、前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液とした。 前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、例えば、３〜１５質量％のグルコースと、１〜１０質量％のキシロースとを含んでいる。

［００４５］

次に、１５質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６３株の培養液を培地のＯＤ

_６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。 前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース４５ｇ／Ｌ、キシロース３８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。 そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３