本発明は、発酵混合物から液体脂質または炭化水素を回収するための方法に関する。

当該技術分野において、発酵により液体炭化水素または脂質を生産することが知られている。 そのような発酵プロセスにおいて、好適な基質を炭化水素、脂質またはそれらの混合物に変換するために、微生物が使用される。 そのような炭化水素または脂質の微生物による生産は、例えば、バイオ燃料を生産するために使用される。 さらに、化学中間体および香味剤または芳香性化合物が、このようにして生産され得る。

発酵プロセスにより得られる発酵混合物は、微生物、基質、栄養物、液体発酵生産物（例えば炭化水素または脂質）、およびガス状発酵生産物（すなわち発酵ガス）を含む、複雑な混合物である。 混合物は、４相（Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｌ）混合物、すなわち、微生物細胞（固体（ｓｏｌｉｄ））、発酵ガスおよび／または他のガス（気体（ｇａｓ））、水性培地（液体（ｌｉｑｕｉｄ））、ならびに炭化水素または脂質（液体（ｌｉｑｕｉｄ））である。

発酵による炭化水素または脂質の微生物による生産において遭遇する問題は、生産された炭化水素および脂質を複雑な発酵混合物から分離することが困難なことである。

炭化水素および脂質の分離は、以下の先行技術においても説明されているように、一般に脂質または炭化水素の水性培地に対する低い水混和性に依存する。

ＥＰ２１９６５３９は、発酵混合物から脂質および炭化水素バイオ燃料（ＢＨＣ）を分離するための、異なる固−液−液分離技術の使用を説明している。 このための好ましいステップは、ベンチュリ型デバイス（もしくは他の減圧デバイス）と組み合わせた、溶存二酸化炭素および発酵ガス中の他の成分を使用したＢＨＣの浮選の使用、または液体遠心分離機の使用を含む。 ガスは反応器内に能動的に注入されない。

ＷＯ２００７／１３９９２４は、２相系において生物有機化合物を生産および分離するための方法に関し、この系は、第１の層としての宿主細胞を含む水性培地と、宿主細胞により生産された生物有機化合物を含む液体有機第２相とを含む。 この文献は、発酵プロセスの間、またはその後の二酸化炭素等のガスの生産に言及しており、これはガス出口を使用して排気され得る。 回分式、連続式、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、または半連続式の発酵プロセス、および好気性または嫌気性宿主細胞を含む、生産方法の多くの可能な変形例が説明されている。

ＷＯ２０１２／０２４１８６は、界面活性剤、宿主細胞および生物有機化合物を含む組成物が、組成物の転相温度未満からそれを超える温度まで加熱され、それにより乳濁液（エマルジョン）が不安定化する、より具体的な精製方法に関する。

ＷＯ２０１０／１２３９０３、ＵＳ２００９／０２９４４５およびＵＳ２０１２／１２９２４４は、微生物、特に藻類を含む水溶液から細胞内成分を採取するための方法を説明している。 これらの方法は、細胞内成分を水溶液中に放出させるために、微生物の細胞壁を破壊するステップを含む。 細胞内成分は、細胞内成分が微小気泡に付着して水溶液の表面に向かって浮上するように、微小気泡を適用してフォーム層を形成することにより溶液から分離され得る。 細胞内成分は、水溶液からフォームを分離することにより回収される。

ＵＳ７，９６０，５７４８１は、油含有種子から油を分離する方法であって、油含有種子の胚粒子の水性分散液を通気することを含む方法を説明している。 通気は、油が付着する気泡をもたらし、分散液の上部表面で気泡がフォームを形成する。 油は、分散液からフォームを分離することにより回収される。

ＷＯ２０１０／１２３９０３、ＵＳ２００９／０２９４４５、ＵＳ２０１２／１２９２４４およびＵＳ７，９６０，５７４８１の欠点は、生産物がフォームの一部として得られるため、生産物を単離するためにさらなる相分離（例えば、デカンテーション、遠心分離）が依然として必要となることである。

本発明の目的は、発酵混合物の液体生産物と水性培地との分離を向上させることによって、より効率的に発酵混合物から液体発酵生産物を回収することである。

この目的は、発酵混合物から脂質または炭化水素を回収するための方法であって、
− 発酵混合物を用意するステップであって、脂質または炭化水素は、発酵槽（例えば、発酵反応器の第１の槽または第１の区画）内での微生物発酵により生産され、上記混合物は、水相および液体生産物相を含み、液体生産物相は、脂質または炭化水素を含むステップと；
− 水相の少なくとも一部および液体生産物相の少なくとも一部を、第２の槽（例えば、発酵反応器の別個の第２の槽または第２の区画）に供給し、それにより第２の混合物を形成するステップと；
− 第２の混合物中にガスを注入し、水相および生産物相の相分離を促進し、それにより水相から生産物相を分離するするステップと；
− 脂質または炭化水素を含む生産物相を収集するステップとを含む方法を提供することにより達成される。 好ましくは、発酵槽および第２の槽は、発酵反応器（好ましくはガスリフト反応器）内の別個の区画である。 この場合、発酵槽は、第１の区画と呼ばれ、第２の槽は、第２の区画と呼ばれる。 代替として、発酵槽および第２の槽は、別個の反応器であってもよい。 発酵槽内の条件は、発酵に好適である。 第２の槽内の条件は、相分離に好適である（また一般に、発酵条件とは異なる）。

カラム内でのクリームおよび油の発生における体積と時間の関係をグラフで示す図である。

カラム内でのクリームおよび油の発生における体積と時間の関係をグラフで示す図である。

実施例２の槽の構成を示す図である。

４つの異なるカラムに対する経時的な連続油層中の油の回収をグラフで示す図である。

カラム内の異なる相にわたる油の分布をグラフで示す図である。

処理前の酵母細胞を示す図である。

処理により形成された細胞残屑懸濁液を示す図である。

カラム内の異なる相にわたる油の分布をグラフで示す図である。

本発明者らは、第２の混合物中にガスを注入することにより、水性培地と液体生産物相との相分離が向上することを見出した。 ガスの能動的注入により、相は、より制御された様式で分離され得る。 これは、例えば、発酵槽内でのクリーム形成を回避もしくは低減することによって、および／または、エマルジョンが形成される場合にはそれを不安定化することによって、より効率的な相分離を可能にする。 特に、注入されるガスのガス流速および／またはガスの気泡のサイズを制御することにより、液体生産物相はより効率的に発酵混合物から分離および回収され得る。

いかなる理論にも束縛されることを望まないが、本発明者らは、発酵中に微生物により生産されるある特定の化合物が、界面活性剤として機能すると予期している。 これらの界面活性剤は、おそらくは、液体混合物中（すなわち、水相および液体生産物相の混合物中）にガスを注入することによって除去され、、それにより生産物相と水相との分離をもたらす。 本発明が役立ち得る代替の機構は、生産物相の合体（ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ）が向上するような様式で、液体生産物の液滴が、注入されたガスの気泡に付着することである。

上述のように、本発明のさらなる利点は、第２の槽内でのクリーム層の形成を低減し得る、またはさらには防止し得ることである。

カラム型の槽または反応器内で発酵を行う場合、一般に異なる複数の層が形成する。 発酵槽内では一般に激しい混合が行われるため、そのような層は一般に第２の槽内でのみ形成する。 したがって、第２の混合物は、以下で説明されるように、１つまたは複数の層を含み得る。 第１に、発酵混合物の激しい混合、酸素含有ガスの注入（好気性発酵の場合）、および発酵ガスの生産の１つまたは複数により生じるフォーム層が、カラムの上部に形成され得る。 そのようなフォーム層は、大量の気泡を含むため密度が一般に５００ｋｇ／ｍ ^３未満となる。 さらに、クリーム層が形成し得る。 クリーム層は、液体発酵生産物（脂質または炭化水素）および水のエマルジョンである。 この層は、フォーム層よりも高い密度を有し、典型的には約６００〜９８０ｋｇ／ｍ ^３であるする。 フォーム層およびクリーム層は、一般に、底部層と見なされ得る水相の上に形成する。 水層は、典型的には約１０００ｋｇ／ｍ ^３ 、例えば９９０ｋｇ／ｍ ^３超の密度を有する。

クリーム層は、例えば、発酵混合物（の一部）が沈降した場合に、例えば重力沈降または遠心分離後に形成し得る。 これはまた、時折、発酵条件下で自発的に形成し得る。 クリーム層は、典型的には、水層（底部層−水相）と油層（上部層−生産物相）との間に形成する。 形成すると、クリーム層は、一般に、発酵混合物の残りの内容物に比べ、比較的多量の液体生産物を有する。 しかしながら、クリームは、それ以上は合体し得ない液体生産物の巨大液滴を含む。 クリーム層から生産物を得るためには、クリームは、さらなる合体が生じ得るように「破壊される」必要がある。 本発明者らは、これが、本発明の方法に従ってガスを注入することにより達成され得ることを見出した。 したがって、第４の層、すなわち生産物層が形成する。 生産物層の組成は、一般に、発酵混合物中の生産物相の組成に対応する。 この層は、少なくとも９０重量％、より好ましくは少なくとも９５重量％の液体生産物（炭化水素または脂質）を含み得る。 液体発酵生成物を抽出するために有機溶媒が生産物相内に存在する場合、生産物層の少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９５重量％は、液体発酵生産物および発酵において生成されないが存在し得る炭化水素を含む有機溶液からなる。 多量の液体生産物に起因して、この層の密度は、クリーム層（形成される場合）の密度より低いが、それでもフォーム層の密度よりは高い。

さらに、異なる層は、油の体積分率により区別され得る。 油の体積分率は、生産物相において最も高い。 生産物層は、０．９から１．０の間にある油の体積分率を有し得る。 クリーム層は、０．５から０．９の間にある油の体積分率を有し得る。 フォーム層は、０．０１から０．４の間にある油の体積分率を有し得る。 「油の体積分率」という用語は、層内に存在する液体発酵生産物の総量（特に、層内に存在する微生物により生産された脂質および炭化水素の総量）を、層の総体積で除したものを指す。

本発明による層分離は、誘導ガス浮選（ｉｎｄｕｃｅｄ ｇａｓ ｆｌｏｔａｔｉｏｎ；ＩＧＦ）により促進され得る。 この技術を使用して、ガスの気泡は、液体中に能動的に注入される。

特に、相分離は、表面ガス速度を制御することにより促進され得る。

表面ガス速度は、ある特定の時間内で（例えば毎秒）槽の断面積（例えばｃｍ ^２単位）を通過するガスの総体積（例えばｃｍ ^３単位）として定義される。 好ましくは、ガスは、第２の槽において、０．０１〜２．０ｃｍ／秒、より好ましくは０．０５〜１．５ｃｍ／秒、さらにより好ましくは０．１〜１．０ｃｍ／秒の範囲内の表面ガス速度を得るために注入される。 表面ガス速度のそのような値は、好気性発酵において典型的に使用される値よりも大幅に低い。 好気性発酵の場合、微生物に十分な酸素を好適に提供するために、酸化性ガスはより高いガス速度で供給される。

表面ガス速度は、ガスの注入点において測定される。 これは、槽の断面積が、ガスが注入される槽の高さにおいて決定されることを意味する。 複数の注入点の場合、表面ガス速度は、複数の注入点の少なくとも１つにおいて上述の範囲内となるべきである。 断面積は、典型的には、ガス流の方向に対し垂直に測定される。 槽がカラムまたはカラム型槽である場合、断面積は、典型的には、カラムの長さに対し垂直に測定される。 槽の断面積がほぼ均一である場合（例えばカラム型槽において）、表面ガス速度は、槽全体にわたってほぼ同じとなり得る。 ある特定の表面ガス速度は、槽の幾何形状に対してガスの流速を調節することにより達成され得る。 例えば、使用される槽の断面積をまず決定し、次いで所望の表面ガス速度を達成するためにガスの流速（すなわち、単位時間当たり注入されるガスの体積）を調節することができる。

本発明において使用されるガスは、典型的には、ガスの気泡の形態で注入される。 本発明者らは、気泡のサイズが、相分離の効率および／または速度をさらに向上させ得ると予期している。 例えば、ある特定の条件下において、より大きな気泡サイズを使用することによってより強力な相分離が達成され得る。

ガスは、当該技術分野において知られている任意の好適な様式により、第２の混合物中に注入され得る。 典型的には、ガスの気泡は、液体混合物中に注入される。 ガスは、有利には、所望の気泡サイズおよび／または流速を得るために、スパージャおよび／または焼結板を通して分配され得る。 液体混合物にガスを効率的に注入するために、ガスは、典型的には反応槽に、または第２の槽が使用される場合は第２の槽に供給される。

本発明によれば、ガスは、液体混合物中に、すなわち水相および液体生産物相の混合物中に注入される。 液体混合物は、第２の混合物に対応する。 液体混合物は、エマルジョンであって、液体生産物相は、水相中に分散していてもよい。 液体混合物はまた、液体生産物を含むクリームを含んでもよい。

ガスは、不活性ガスまたは発酵ガス等の非酸化性ガスであってもよい。 不活性ガスは、例えば、希ガス、窒素またはＣＯ _２であってもよい。 ガスはまた、発酵ガスであってもよい。 例えば、発酵により形成された発酵ガスは、収集され第２の混合物中に注入され得る。 この場合、発酵ガスは、典型的には、まず発酵混合物から分離され、その後それを第２の槽に供給することによりリサイクルされる。

代替として、ガスは、空気等の酸化性ガスであってもよい。 例えば、酸素が富化された空気を使用し得る。 そのような富化空気はまた、好気性発酵において、微生物に酸素を提供するために使用される。

本発明の方法によれば、ガスは、第２の混合物中に注入される。 しかしながら、ガスはまた、発酵混合物中に導入されてもよい。 例えば、発酵混合物は、静的ミキサーにより混合し得る。 さらに、好気性発酵の場合、微生物に酸素を提供するために、酸素含有ガス（例えば空気）が発酵混合物に導入され得る。 さらに、ガスは、微生物により発酵混合物中で発酵生産物（例えば発酵ガス）として生産され得る。 発酵混合物へのそのようなガスの導入にもかかわらず、これは一般に生産物相の相分離をもたらさず、ましてや発酵混合物中の脂質および炭化水素液滴の合体を向上させない。 発酵槽内の条件は、単純にそのような槽分離に好適ではない。 むしろ、条件は、発酵に好適または最適化されている。 例えば、第１の槽に注入または生産されたガスの表面ガス速度は、一般に、第２の槽内よりも発酵槽内において高い（典型的には１．５ｃｍ／秒超、またはさらには２．０ｃｍ／秒超）。 発酵槽内の条件を考慮して、水相の少なくとも一部および液体生産物相の少なくとも一部は、第２の槽に移され、そこで条件は相分離に好適となるように選択され得る。

したがって、水相の少なくとも一部および液体生産物相の少なくとも一部は、第２の槽に供給され、それにより第２の混合物が形成される。 これは単純に、発酵混合物の少なくとも一部を第２の槽に供給することにより行うことができる。 第２の槽内に溜まる任意の固体物質は、発酵槽にリサイクルされ得る。 例えば、第２の槽内の微生物は、発酵槽にリサイクルされ得る。 特に、液体混合物（上で定義される通り）の少なくとも一部は、第２の槽に供給され、第２の混合物を形成し得る。 したがって、第２の混合物は、水相および液体生産物相の混合物を含む（例えばエマルジョンの形態で）。 第２の混合物は、さらに、クリーム（例えば発酵槽内または第２の槽内で形成され得る）をさらに含んでもよい。 供給ステップが上述のように使用される場合、発酵混合物中へのガスの注入の代わりに、またはそれに追加して、ガスは第２の混合物中に注入される。

第２の槽内の条件は、相分離の促進に好適であるべきである。 一般に、第２の槽内では発酵は生じない。 したがって、第２の槽内の条件は発酵槽内の条件とは異なってもよい。 まず、第２の槽内の表面ガス速度は、異なるように選択され得る。 また、第２の槽内では、異なる温度および／または圧力が使用され得る。 さらに、第２の槽内では混合が行われないことが望ましいが、これは、合体および相分離に悪影響を及ぼし得るためである。

第２の槽内の条件は、発酵のために最適化されていなくてもよいが、それでも微生物がこの段階で破壊されるのは望ましくない。 第２の混合物中の微生物の細胞内生産物（特に細胞残屑）の存在は、実施例５において示されるように、相分離および生産物層の形成に干渉することが判明した。 したがって、そのような細胞内生産物が第２の混合物中に存在するのは望ましくない。 本明細書において使用されるような細胞内生産物は、微生物の破壊、特に発酵生産物を生産する微生物の破壊により得られる材料を示し得る。 破壊は、細胞溶解による破壊か、または物理的、化学的および／もしくは酵素的破壊を示し得る。 細胞内生産物は、細胞壁断片等の固体細胞内生産物を含む細胞残屑を含む。 したがって、第２の混合物は、好ましくは、５重量％未満、より好ましくは１重量％未満、さらにより好ましくは０．１重量％未満の細胞内生産物を含み、さらにより好ましくは細胞内生産物を全く含まない。 特に、第２の混合物は、これらの値を下回る量の細胞残屑を含む。

好ましくは、第２の槽内の微生物は、それらを発酵槽に再供給することによりリサイクルされる。 したがって、第２の槽内に存在するバイオマスの好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも７５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％が、無傷微生物集団の質量に対応する。 バイオマスは、本明細書において使用される場合、乾燥重量で表現される、微生物により生成される脂質または炭化水素以外の、発酵混合物中の微生物から生じるバイオマスを示す。 無傷微生物の再供給は、微生物が発酵槽に迅速に再供給され、第２の槽内に短期間滞留するのみとなり得るように、発酵槽および第２の槽を構成することにより達成され得る。 これは、発酵槽および第２の槽を統合することにより達成され得る。 そのような統合システムの例は、第１の区画内で発酵が行われ、第２の区画内で相分離が行われる、２つの区画を有する発酵反応器である。

発酵後（但しガスの注入前）、発酵混合物の少なくとも一部は、沈降ステップ、例えば重力沈降または遠心分離ステップに供されてもよい。 そのようなステップは、発酵混合物中の液体生産物の含量を増加させるために使用され得る。 液体生産物と水との間の密度の違いに起因して、液体生産物のより高い含量を有する発酵混合物の一部を分離することができる。 したがって、富化された液体混合物、すなわち液体生産物が富化された液体混合物が得られる。 例えば、富化発酵混合物は、第２の混合物として使用され、ガス注入が行われる第２の槽に供給されてもよい。 沈降ステップが発酵混合物の一部（例えば第２の混合物）のみに対して行われる場合、これは、典型的には発酵槽以外の槽内（すなわち沈降タンク内）で行われる。 例えば、第２の混合物は、第２の槽に供給される前または後に、沈降に供されてもよい。 生じ得るいかなるクリーム形成も、上述のようにガスの注入により容易に処理され得るため、沈降ステップはこのように、発酵混合物から液体生産物を得るためのプロセスステップとして好適に使用され得る。

微生物等の固体物質は、発酵槽（例えば発酵反応器の第１の区画）から第２の槽（例えば発酵反応器の第２の区画）に移されてもよい。 連続プロセスの場合、固体物質は、典型的には、発酵槽に再供給される。 さらに、第２の槽において、第２の混合物は、液体生産物相の一部および水相の一部を沈降させることにより形成され得る。 これは、クリームまたはエマルジョンの形成をもたらし得る。 発酵混合物は、一般に混合される必要があるため（例えば撹拌により、またはガスの添加により）、そのような形成は、発酵混合物に常に生じるわけではない。

第２の槽および発酵槽は、発酵混合物および第２の混合物が互いに直接接触するように、任意選択で接続されていてもよい。 したがって、液体混合物の一部は、第２の槽に連続的に供給され得る。

発酵槽および第２の槽は、発酵反応器内の別個の区画であってもよい。 代替として、発酵槽および第２の槽は、別個の反応器である。

発酵槽の一般的構成、およびプロセスが行われる条件に関するより具体的な詳細を、以下で説明する。

発酵槽は、出口であって、水相の少なくとも一部および液体生産物相の少なくとも一部が当該出口を通して第２の槽に移され得る出口を備える。 好ましくは、水相の少なくとも一部および液体生産物の少なくとも一部において、ガスの気泡は存在しない。

発酵槽は、ガスの気泡が発酵槽から出ることを可能にするガス出口をさらに備えてもよい。 そのようなガス出口は、発酵混合物に導入された（例えば注入または形成された（例えば発酵ガス））ガスの気泡が、第２の槽に直接進入しないことを確実にし得る。 ガスの気泡は合体および相分離に悪影響を及ぼし得るため、これは望ましくない。

第２の槽は、出口であって、微生物が該出口を通して発酵槽にリサイクルされ得る出口をさらに備えてもよい。

発酵槽および第２の槽が発酵反応器内の別個の区画である場合。 発酵反応器内の第１の区画は、発酵が生じる区画である。 第１の区画は、微生物の大部分（５０重量％超、典型的には８０重量％超）を含む。 第２の区画は、相分離が促進される発酵反応器の区画である。 発酵反応器は、２つの区画を有するガスリフト反応器または気泡カラム反応器であってもよい。 好ましくは、発酵反応器は、ガスリフト反応器である。 ガスリフト反応器は、内部再循環、例えばドラフトチューブを使用した内部再循環や、または外部再循環を有してもよい。

２つの別個の反応器の場合、発酵槽は、例えば発酵反応器（例えば気泡カラム反応器またはガスリフト反応器）であってもよく、一方第２の槽は、分離反応器、例えば気−液反応器（例えば気泡カラム反応器）、または誘導ガス浮選反応器（例えば誘導ガス浮選分離器）である。

好ましくは、発酵槽および／または第２の槽は、カラム型槽または反応器、例えばカラム型発酵反応器である。 プロセスは、典型的には上向流で行われるが、これは、発酵混合物の水相の少なくとも一部が、発酵槽内で上方に移動することを意味する。 発酵槽および第２の槽が発酵反応器内の別個の区画である場合、発酵反応器は、水相および生産物相が、第１の区画（発酵槽）から第２の区画（第２の槽）内に流動するように構成される。 さらに、発酵槽にわたり再循環があってもよい。 これは、内部再循環、例えばドラフトチューブを使用した内部再循環や、または外部再循環であってもよい。

本発明の方法は、回分式、流加培養式、または連続的に行うことができる。

発酵槽および第２の槽は、１．０〜１．２バールの間の圧力で、好ましくは周囲圧力（約１．０バール）で操作され得る。 ５〜６０℃の間、典型的には２０〜４０℃の間の温度が使用され得る。 水および液体生産物の両方が固化しない限り、低い温度が使用されてもよい。 上述のように、発酵槽および第２の槽内の温度および圧力は異なってもよいが、それらは一般に（互いに独立して）上記範囲内で選択される。

上述のように、発酵混合物は、典型的には、微生物、基質、ならびに発酵生産物（炭化水素および／または脂質、発酵ガス）を含む。

発酵槽内の微生物は、発酵により炭化水素または脂質を生産することができる微生物である。 したがって、発酵混合物は、微生物が脂質または炭化水素を生産するのに好適な条件下で維持される。 発酵槽内の条件は、さらに、発酵混合物中の微生物が成長および／または繁殖するのに好適であってもよい。 したがって、条件は、発酵槽内の大量の微生物が破壊、損傷、またはそれらがもはや発酵することができないような任意の他の様式で不活性化されないように選択されることが明らかであろう。 好ましくは、発酵混合物は混合される。 混合は、例えば、ミキサーおよび／またはガスの添加により行われてもよい。 気体の混合は、比較的高い表面ガス速度でガスを注入することにより達成され得る。 不均一混合を生成するために、ガスは、好ましくは、１．５ｃｍ／秒超またはさらには２．０ｃｍ／秒超の表面ガス速度で添加される。

液体生産物（脂質または炭化水素）は、生きた微生物により、発酵混合物中に分泌される。 微生物は、脂質および炭化水素を得るために採取される必要はない。

発酵に好適な微生物は、当該技術分野において知られている。 嫌気性および好気性微生物の両方が使用され得る。 微生物は、任意選択で担持されてもよい。 現在、多くの可能な炭化水素および脂質が、バイオ燃料の生産のために特別に開発された微生物により生産され得る。 使用される微生物の最も一般的な群は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。 好適な微生物の他の例は、ＷＯ２００８／１１３０４１（ＬＳ９）、ＷＯ２０１２／０２４１８６、ＷＯ２００７／１３９９２４、ＵＳ７６５９０９７Ｂ２、ならびにＫａｌｓｃｈｅｕｅｒ Ｒ、Ｓｔｏｌｔｉｎｇ ＴおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ Ａ． ２００６． Ｍｉｃｒｏｄｉｅｓｅｌ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｏｒ ｆｕｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５２：２５２９〜２５３６、またはＬｉ Ｑ、Ｄｕ ＷおよびＬｉｕ Ｄ． ２００８． Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｉｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０：７４９〜７５６、またはＳｃｈｉｒｍｅｒら、２０１０． Ｍｉｃｏｒｂｉａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｋａｎｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９：５５９〜５６２、またはＬａｄｙｇｉｎａら、２００６． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１００１〜１０１４から知られる。 これらの文献において言及されている液体有機生産物（例えば炭化水素またはバイオ燃料）を生産するための具体的な好気性および嫌気性細菌は、参照により本明細書に組み込まれる。

微生物は、例えば、自由に懸濁させたり、固定させたり、顆粒を形成したり、凝集物を形成したり等してもよい。 このようにして、反応器内の細胞濃度を最適化することができ、余分な細胞集団の生産がより少ない。 さらに、細胞集団の分離が向上され得る。

微生物発酵は、好気性または嫌気性条件下で行われる。

発酵混合物中に存在する基質は、一般にバイオ原料、例えば炭水化物（例えば糖）、デンプンおよびセルロース（またはその加水分解物）である。 他の好適な原料は、グリセロール、低価格バイオ燃料（メタノール、エタノール等）、農業／林業残渣、農業／林業残渣の加水分解物、およびそのガス化形態（例えば合成ガス）から得ることができる。

これらの基質は、一般に、槽内に直接、または存在する場合にはリサイクル流内に、水溶液として発酵槽内へ導入される。

発酵混合物はまた、液体発酵生産物の他に、有機酸およびそのポリマー（例えばポリアルカノエート）等の他の（例えば酸化）生産物を含有してもよい。

本発明の方法において回収された脂質または炭化水素は、微生物を使用した好気性または嫌気性発酵により生産され得る任意の脂質または炭化水素であってもよい。 例えば、脂質または炭化水素は、例えば少なくとも８個の炭素原子を有する長鎖脂質または脂肪酸であってもよい。 脂質または炭化水素は、特に、それが生産される発酵条件下で液体（例えば油）である。 脂質または炭化水素は、本明細書において、液体発酵生産物、または単に液体生産物とも呼ばれる。 形成されるこの生産物はまた、１種もしくは複数の脂質および／または１種もしくは複数の炭化水素の混合物であってもよい。 液体発酵生産物が生産される場合、それは、発酵混合物中に液体生産物相を形成する。 液体生産物相は、主に液体発酵生産物からなってもよい（例えば、少なくとも７５重量％、好ましくは少なくとも９０重量％、またはさらには少なくとも９５重量％の生産物からなってもよい）。 しかしながら、液体生産物相はまた、以下で生産物抽出実施形態に関して説明されるように、有機溶媒または溶液（例えば５０重量％超）を含んでもよい。

発酵混合物の生産物相は、１種または複数の有機溶媒、例えばアルカンまたはアルケン、好ましくは１０個から２０個までの炭素原子を有するアルカンまたはアルケン、例えばドデカン、ヘキサデカンまたはファルネセンをさらに含んでもよい。 生産物相はまた、複数の有機溶媒の混合物、例えばディーゼルまたは灯油等の燃料を含んでもよい。 発酵混合物の生産物相はまた、有機溶媒に溶解し得る、発酵において生産されない１種または複数の炭化水素を含んでもよい。 有機溶媒は、発酵中の生産物抽出に使用し得る。 そのような実施形態において、液体発酵生産物は、有機溶媒中に抽出され、それにより抽出物を（典型的には液滴の形態で）形成するが、これは、液体発酵生産物および有機溶媒を含む有機溶液である。 そのような生産物抽出は、当該技術分野において周知であり、例えば、生産物阻害を防止するために、または有機溶媒を液体発酵生産物で富化するために使用し得る。 この抽出技術を行う方法は当業者に知られている。 そのようにして抽出され得る液体発酵生産物の例は、モノおよびセスキテルペンである。

本発明の方法において生成される液体発酵生産物の液滴は、小（＜１０μｍ）、中（１０〜１００μｍ）または大（＞１００μｍ）の範囲の様々なサイズを有し得る。 生産物抽出の場合、これらの液滴サイズは、抽出物（すなわち、液体発酵生産物および有機溶媒を含む有機溶液）の液滴サイズに対応する。

脂質または炭化水素は、一般に、乳化形態で存在し、これは、微生物ならびに他の生物学的粒子および分子の存在により安定化させ得る。 したがって、発酵は、水中の炭化水素および／または脂質のエマルジョンを含み得る。

発酵槽内の発酵混合物は、典型的には、例えば撹拌および／またはガススパージにより混合される。 発酵混合物が発酵槽内で沈降する場合、当然ながらそのような混合はもはや行われない。

本発明の方法において、大量の発酵ガスが生成され得る。 発酵ガスは、典型的には、発酵槽内で乱流混合および分散を生じさせ、槽内で有用なガスリフト機能を提供し得る。 発酵ガスは、一般に、主に二酸化炭素（主要ガス成分として、例えば少なくとも５０体積％）で構成される。 典型的には、発酵ガスは、水蒸気をさらに含む。 発酵ガスはさらに、実質的な量のメタンもまた含み得る。

発酵ガスはまた、ある特定の条件下において、発酵混合物からの液体発酵生産物の分離において有用な機能を有し得る。 しかしながら、水相および液体生産物相の分離を向上させるための発酵ガスの使用の欠点は、正確に制御することができないことである。 特に、発酵の気泡サイズおよび流速を制御することができない。 一般に、発酵ガスは、発酵混合物中に溶解し、発酵混合物中の２つの液相を効率的に分離するには小さすぎる気泡サイズを有する。 対照的に、本発明は、まずガスを収集し、次いでそれを適正な条件および速度下で注入することにより、間接的な発酵ガスの使用を提供する。

液体発酵生産物は、当該技術分野において知られている技術、例えばデカンテーションにより第２の槽から収集され得る。 生産物層は、単純に第２の槽から排出する、または汲み出すことができる。 生産物が発酵混合物中の有機溶媒中に抽出される場合、液体発酵生産物は、有機溶液として収集される。

本発明は、以下の実施例においてさらに例示される。

（実施例１）
回分式油回収 まず、発酵混合物を調製した。 バッチ当たり１．６リットルの水中１０体積％ヘキサデカン分散液を調製した。 添加前に全ての成分を秤量し、４ブレードのラシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）タービンおよび２つのバッフルを含む２Ｌ槽に添加した。 成分は、以下の順番で添加した。
１． Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水 １４０２．６７ｇ
２． 湿潤パン酵母 ５３．３３ｇ
３． ヘキサデカン １２３．６８ｇ

バイオマスを混合し、油層を微小油滴に破壊するために、撹拌器速度をＮ＝９００ＲＰＭでｔ＝１８０分に設定した。 低温保持装置を取り付けて、温度をＴ＝２３℃で一定に維持した。 温度測定には温度計を使用し、そのために発酵装置の蓋の指定されたポートに設置した。

ｔ＝１８０分で撹拌器を停止し、その後速やかに蓋を取り外して、分散液をガラスカラム内に注ぎ込んだ。

分散液を調製した後、漏斗を介して各カラムに３００ｍｌの分散液を充填した。 ガラスカラムは底部に焼結板を有し（推定気泡直径＝２〜３ｍｍ）、内径＝３７ｍｍおよび高さ（焼結板から上）＝６４５ｍｍであった。 １つのカラムは重力沈降実験に使用し（カラムＩ−沈降タンク）、１つのカラムはガス相による向上した油分離に使用した（カラムＩＩ−第２の槽）。

カラムＩＩを、空気０〜１０ｌ／分のマスフローコントローラに接続した。 空気供給は、カラムに３００ｍｌの分散液を充填した後に作動させた。 カラム内の表面ガス速度は、０．０１〜２ｃｍ／秒の範囲であった。

クリーム層および透明油層の体積は、空気供給を止めることなく経時的に測定した。 カラム内のガスホールドアップは、ガス供給ありおよびなしでのクリームおよび油層の体積の差を測定することにより、各実験の終わりに測定した。 経時的に測定された体積は、このガスホールドアップに対して補正された。

図１および２は、両方のカラム内での経時的なクリームおよび油の発生を示す（左：カラムＩ、重力沈降による分離；右：カラムＩＩ、ガス相による向上した分離）。 明らかに、クリーム層内の安定化された油滴を生成する重力分離（グラフ中の赤い線）とは対照的に、ガス相は、油のほとんどを別個の油層として直接的に回収することを可能にする（グラフ内の青い線）。 驚くべきことに、カラムＩＩ内ではクリーム形成が見られなかった。

（実施例２）
連続的油回収 連続構成は、発酵混合物調製用の直径１０ｃｍの８Ｌ気泡カラム、濃縮された油分画を含む混合物（クリーム）を得るための沈降タンクとしての０．５Ｌ円錐漏斗、油分離用の０．５Ｌ気泡カラム（例えば上記実施例におけるカラムＩＩ−第２の槽）、および油回収用の槽からなっていた。 槽の間の全ての流動は、８Ｌ気泡カラムから円錐漏斗へのオーバーフローを除き、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘポンプを使用して制御した。 構成の概略図を図３に示す。

開始段階は、３ｃｍ／秒の表面ガス速度で６時間圧縮空気をスパージすることにより、８Ｌ気泡カラム（発酵槽）内で７００ｍＬのヘキサデカンを有する上述と同様の組成の発酵混合物を調製することからなっていた。 その後、円錐漏斗（沈降タンク）を充填し、５分間沈降させた後、０．５Ｌ気泡カラム（第２の槽）を１時間で充填し、リサイクル流を始動させた。 ０．５Ｌ気泡カラム内に、０．０１〜２ｃｍ／秒の範囲内の表面ガス速度で空気を注入した。 約２時間後、ある程度の透明な油が既に油回収用の槽内に回収され、新鮮な油の流入を始動させることにより、連続操作モードを開始させた。

３００ｍＬの新鮮な油が約６時間でシステムに供給される一方で、２８５ｍＬの透明な油が油回収用の槽内に回収され、連続操作下で体積基準で９５％の油回収収率が得られた。

（実施例３）
回分式油回収に対する表面ガス速度の効果 まず、発酵混合物を、実施例１に従って調製した。 分散液を調製した後、実施例１の場合と同じ寸法の５つのガラスカラムに、それぞれ３００ｍＬの分散液を充填した。 ５つのカラムを異なる表面ガス速度（０、０．１、０．２、０．５、１．０ｃｍ／秒）で２時間操作した。 図４は、４つの異なるカラムに対する経時的な連続油層中の油の回収を示す。 ２時間の分離後、図５に示すように、カラム内の異なる相にわたる油の分布を決定した。 これは、表面ガス速度の増加が、分散液中の最初に存在する油滴であるクリームの量の減少をもたらすことを示している。 連続油層は、０．１ｃｍ／秒および０．２ｃｍ／秒の表面ガス速度でのカラム内でのみ形成した。 ０．５ｃｍ／秒および１．０ｃｍ／秒では、油は、連続油層を形成しないミリメートルオーダーのサイズを有する油滴の層である粗クリーム層として回収される。

（実施例４）
回分式油回収に対する細胞破壊の効果 実施例１における手順に従い、２つの分散液を調製したが、一方の分散液では、分散液を調製する前に水性細胞懸濁液を高圧細胞破壊デバイス（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｏｗ Ｍａｒｃｈ、Ｄａｖｅｎｔｒｙ、Ｎｏｒｔｈａｎｔｓ）で処理した（２．７キロバールで１回の通過（ｐａｓｓ））ことが異なる。 図６は、標準分散液の調製において使用されるような、処理前の酵母細胞を示す。 図７は、処理により形成された細胞残屑懸濁液を示す。 この細胞残屑を用いて、同じ分散液調製に従った。 調製された分散液を、実施例１の場合と同様のガラスカラムに移し、分離手順を０．１ｃｍ／秒の表面ガス速度で２時間行った。 これらの条件下では、図８に示されるように、連続油は回収され得なかった。 細胞残屑の存在は、水相からの生産物相の分離、特に生産物層の形成に悪影響を及ぼすと結論付けることができる。