一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素以及类胡萝卜素数
据库建立方法
技术领域
[0001] 本
发明属于类胡萝卜素鉴别技术领域，具体涉及一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法以及类胡萝卜素
数据库建立方法。
背景技术
[0002] 类胡萝卜素(Carotenoids)是一类重要的
植物色素，在自然界中，广泛存在于各种植物中，在动物及
微生物中也有发现，类胡萝卜素种类很多，其中包括人们所熟知的α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等。到目前为止，已经鉴定的类胡萝卜素分子共有600多种，其中具有重要生物学功能的约有50几种。类胡萝卜素是光合生物进行光和作用必不可少的成分，在光合作用过程中起到两种作用：即光吸收和
光保护；类胡萝卜素是一类能高效去除自由基的重要物质，类胡萝卜素分子可以与自由基起反应，形成无害的产物，或者通过破坏自由基的链反应，将自由基从体内清除掉，从而使基
体细胞免受损伤。类胡萝卜素具有重要的生物学功能，人体自身不能合成类胡萝卜素，必须通过外界摄入，大量摄取各种类胡萝卜素，有益于人类健康，它们越来越受到人们关注。植物类的农产品中拥有丰富的天然类胡萝卜素资源，随着类胡萝卜素在制药、食品及
饲料工业中的广泛应用，国内的许多研究机构、大专院校、商检部
门和生产制造商都在进行胡萝卜素的分析工作。但是，一直缺乏一种可以广泛应用，高通量，高灵敏度的分析方法以满足多行业或企业的标准。
发明内容
[0003] 本发明解决的技术问题为：提供一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法以及类胡萝卜素数据库建立的方法，基于本
申请的方法，可以同时实现对植物体中存在的各种类胡萝卜素进行高通量，高灵敏度检测。
[0004] 本发明提供了一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
[0005] 1)取组织样品冻干；
[0006] 2)在冻干的组织样品中加入
碳酸氢钠，加入提取液进行色素提取得到上清液，所述冻干的组织样品与所述
碳酸氢钠的
质量比为1：(0.5～1)，所述提取液由正己烷：丙
酮：无
水乙醇按照体积比(1～3)：(1～2)：(1～2)混合制成；
[0007] 3)用质量分数为5％～10％的饱和NaCl水溶液对所述上清液进行多次清洗；
[0008] 4)取清洗后的上清液进行浓缩干燥得到类胡萝卜素样品；
[0009] 5)以步骤4)得到的类胡萝卜素样品为测试对象，进行LC-MS/MS检测，得到类胡萝卜素样品中各个类胡萝卜素的保留时间、质荷比以及二级质谱图。
[0010] 根据本发明的方法具有如下技术效果：
[0011] (1)提取方法上无需
皂化，保留了类胡萝卜素的最真实状态，本申请将上述提取方法与LC-MS/MS结合实现了复杂样品中各类胡萝卜素的快速、准确的检测。
[0012] (2)高通量，采用LC-MS/MS联用，通过质荷比进行扫描，可得到各类胡萝卜素二级质谱图，在同一时间可以测出上百种类的胡萝卜素。
[0013] (3)具有广泛的适用性，通过LC-MS/MS联用可获取各类胡萝卜素的一级质谱和二级质谱数据以及色谱数据，通过上述数据可得到类胡萝卜素的质荷比、二级质谱子离子及保留时间，利用这些数据可对检测到的类胡萝卜素进行定性分析，基于本申请的方法可用于分析鉴定任何植物任何组织内的类胡萝卜素的种类。
[0014] 在上述方案的
基础上，本发明还进行了如下改进：
[0015] 进一步，所述提取液由正己烷：丙酮：无水乙醇按照体积比2：1：1混合制成。
[0016] 目前，常采用的类胡萝卜素提取方法包括
有机溶剂提取方法、皂化后提取法。皂化提取方法：破坏样品的组织细胞，提高类胡萝卜素的提取率；使非游离态的类胡萝卜素转变为游离态的类胡萝卜素，可以使类胡萝卜素完全释放出来，无法得到类胡萝卜素的最真实状态；
有机溶剂提取方法：选择合适的溶剂或溶剂组合以及优化提取步骤是有效提取类胡萝卜素的关键因素，但由于不同的类胡萝卜素极性大小有很大的差异，没有一种溶剂或溶剂配比能适合所有样品中的类胡萝卜素。采用基于本申请的有机溶剂配比进行可提取得到植物中绝大多数的类胡萝卜素，经过实验发现，提取得到的各类胡萝卜素的含量、纯度均可达到LC-MS/MS检测要求。
[0017] 进一步，所述提取液中含有0.01％(v/v)二丁基羟基
甲苯(BHT)。
[0018] BHT
稳定性高，抗
氧化能
力强，在提取液中加入BHT可以防止类胡萝卜素在提取过程中被氧化。
[0019] 进一步，步骤4)中浓缩干燥处理过程为：取清洗后的上清液加入
硫酸钠粉末，然后在
真空浓缩仪中30℃条件下干燥。
[0020] 硫酸钠粉末的加入可除去上清液中存在的水，
加速样品的浓缩干燥。
[0021] 进一步，步骤1)中具体处理内容为：取组织样品于真空
冷冻干燥仪中干燥5～7天。
[0022] 该条加下可除去样品中多余的水分，有利于后续类胡萝卜素的提取。
[0023] 进一步，步骤2)中色素提取的具体处理操作为：在所述冻干样品中，按照冻干样品、碳酸氢钠以及提取液1g：(0.5～1)g：15ml的配比加入碳酸氢钠和提取液，进行提取。
[0024] 进一步，步骤5)中检测的具体内容为：取步骤S3中得到的类胡萝卜素样品溶解于乙酸乙酯中，在-15～-20℃氮气条件下保存48小时，然后低温过滤得到滤液，将滤液在13000r/min条件下离心20-30min，取上清液经0.22μm微孔滤
膜过滤后上样检测。
[0025] 由此，氮气条件和低温条件下可防止类胡萝卜素氧化，保证上样检测结果的准确性。
[0026] 进一步，所述LC-MS/MS检测的色谱条件包括：色谱柱为C30 YM
C柱，柱温为35℃；流动相A：0.1％的
甲酸溶液，溶剂由甲醇：甲基叔丁基醚：水溶液按照体积比81：15：4混合制成；流动相B：0.1％甲
酸溶液，溶剂由甲醇：甲基叔丁基醚：水按照体积比16：80.4：3.6混合制成，梯度洗脱条件如下：
[0027] 0～30min，B：1％～34％；
[0028] 30～35min，B：34％；
[0029] 35～50min，B：34％～56％；
[0030] 50～70min，B：56％～78％；
[0031] 70～75min，B：78％～100％；
[0032] 75～80min，B：100％～1％；
[0033] 80～85min，B：1％；
[0034] 所述LC-MS/MS检测的紫外
光谱检测条件包括：检测器为PDA检测器；检测
波长为286、348和450nm；
[0035] 所述LC-MS/MS检测的质谱条件包括：质谱仪为Q-Exactive；离子源为APCI；质量分析器为四极杆和Orbitrap；检测器为Orbitrap；喷雾
电压3200V；毛细管
温度320℃；
汽化器温度550℃；放电
电流5.00μA；扫气流量0.02；质量扫描范围100～1400m/z。
[0036] 基于本申请的方法，采用上述色谱条件、液相条件和质谱条件，在无需皂化的条件下，仍然可以实现不同种类类胡萝卜素高效分离，并实现类胡萝卜素的高准确度、高灵敏度、高通量检测。
[0037] 本发明还提供了一种类胡萝卜素数据库建立方法，以上述方法得到的保留时间、质荷比、二级质谱子离子以及分析得到的对应的化合物结构为主要内容建立类胡萝卜素数据库。
[0038] 由此，以化合物结构、保留时间为、质荷比以及二级质谱子离子主要内容的本地代谢数据库，方便后续类胡萝卜素样品中的类胡萝卜素的检索分析。
[0039] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0040] 图1A为利用本发明的方法检测到的类胡萝卜素的色谱图。
[0041] 图1B为利用传统皂化提取方法检测到的类胡萝卜素的色谱图。
[0042] 图2A为利用本发明方法检测样品一果肉中的类胡萝卜素的色谱图。
[0043] 图2B为利用本发明方法检测样品一果肉中的类胡萝卜素的总离子流图。
[0044] 图3A为利用本发明方法检测样品二果肉中的类胡萝卜素的色谱图。
[0045] 图3B为利用本发明方法检测样品二果肉中的类胡萝卜素的总离子流图。
[0046] 图4A为利用本发明方法检测样品三果肉中的类胡萝卜素的色谱图。
[0047] 图4B为利用本发明方法检测样品三果肉中的类胡萝卜素的总离子流图。
[0048] 图5A为利用本发明方法检测样品四果肉中的类胡萝卜素的色谱图。
[0049] 图5B为利用本发明方法检测样品四果肉中的类胡萝卜素的总离子流图。
[0050] 图6A为利用本发明方法检测样品温州蜜柑的
果皮中的类胡萝卜素的色谱图。
[0051] 图6B为一种利用本发明高通量检测样品温州蜜柑的果皮中的类胡萝卜素的总离子流图。
[0052] 图7A为β-Citraurin二级质谱图m/z 433.3074
[0053] 图7B为β-Carotene二级质谱图m/z 537.4417
[0054] 图8为(all-E)-violaxanthin myristate-palmitate断键规律解析。
[0055] 图9A为利用本发明检测到样品中存在的类胡萝卜素1,2-epoxy phytoene的结构图。
[0056] 图9B为利用本发明检测到样品中存在的类胡萝卜素8,8-dihydroxy-trans-neoxanthin的结构图。
[0057] 图9C为利用本发明检测到样品中存在的类胡萝卜素15,15'-dihydroxy-β-carotene的结构图。
[0058] 图9D为利用本发明检测到样品中存在的类胡萝卜素Antheraxanthin的结构图。
[0059] 图9E为利用本发明检测到样品中存在的类胡萝卜素β-cryptoxanthin laurate的结构图。
具体实施方式
[0060] 下面详细描述本发明的
实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0061] 实施例1：
[0062] (1)取温州蜜柑的果肉放于真空冷冻干燥仪中一周，充分冻干。
[0063] (2)取冻干样品在研钵中加液氮磨成粉状，分别称取2g放入2个50ml离心管中，加入等质量NaHCO3，加入15ml色素提取液(正己烷：丙酮：无水乙醇＝2：1：1，含0.01％BHT)后，磁力搅拌30min(避光)，其中正己烷、丙酮、无水乙醇均为分析纯
试剂(国药集团)，6000r/min离心10min，将上清转入新50ml离心管中，再加入15ml色素提取液，重复萃取2次至组织无色并将上清液合并；
[0064] (3)加入5ml的10％饱和NaCl水溶液洗3次，吸取上层有机相；
[0065] (4)将样品温州蜜柑加入适量的Na2SO4粉末，真空浓缩仪中30℃浓缩上清液至干燥；(非皂化提取)
[0066] (5)准确吸取400μl乙酸乙酯(质谱级，国药集团)充分溶解类胡萝卜素，-18℃氮气条件下保存48小时，然后在
冰上过滤，13000r/min离心20min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后上样检测。
[0067] 仪器条件
[0068] (1)色谱条件为：色谱柱为C30 YMC柱，柱温为35℃；流动相A：0.1％的甲酸溶液，溶剂由甲醇：甲基叔丁基醚：水溶液按照体积比81：15：4混合制成；流动相B：0.1％甲酸溶液，溶剂由甲醇：甲基叔丁基醚：水按照体积比16：80.4：3.6混合制成，梯度洗脱条件如下：
[0069] 0～30min，B：1％～34％；
[0070] 30～35min，B：34％；
[0071] 35～50min，B：34％～56％；
[0072] 50～70min，B：56％～78％；
[0073] 70～75min，B：78％～100％；
[0074] 75～80min，B：100％～1％；
[0075] 80～85min，B：1％；
[0076] (2)紫外光谱检测条件为：检测器为PDA检测器；检测波长为286、348和450nm；
[0077] (3)质谱条件为：质谱仪为Q-Exactive；离子源为APCI；质量分析器为四极杆和Orbitrap；检测器为Orbitrap；喷雾电压3200V；毛细管温度320℃；汽化器温度550℃；放电电流5.00μA；扫气流量0.02；质量扫描范围100～1400m/z。
[0078] 对比例1
[0079] 对比例1采用皂化处理进行样品提取并进行检测和分析，具体步骤如下：
[0080] (1)取温州蜜柑的果肉放于真空冷冻干燥仪中一周，充分冻干。
[0081] (2)取冻干样品在研钵中加液氮磨成粉状，分别称取2g放入2个50ml离心管中，加入等质量NaHCO3，加入15ml色素提取液(正己烷：丙酮：无水乙醇＝2：1：1，含0.01％BHT)后，磁力搅拌30min(避光)，其中正己烷、丙酮、无水乙醇均为分析纯试剂(国药集团)，6000r/min离心10min，将上清转入新50ml离心管中，再加入15ml色素提取液，重复萃取2次至组织无色并将上清液合并；
[0082] (3)加入5ml的10％饱和NaCl水溶液洗3次，吸取上层有机相；
[0083] (4)皂化提取：将样品温州蜜柑真空浓缩后溶于2ml甲基叔丁基醚(MTBE)(含0.01％BHT)，再加2ml 10％KOH-甲醇溶液(含0.01％BHT)充氮，避光条件下皂化过夜(10h)。
然后加4ml饱和NaCl水溶液和2ml MTBE(含0.01％BHT)使之更好的分层，洗走水层，再加3次
5ml饱和NaCl水溶液洗至中性。加入适量的Na2SO4粉末，真空浓缩仪中30℃浓缩上清液至干燥；
[0084] (5)准确吸取400μl乙酸乙酯(质谱级，国药集团)充分溶解类胡萝卜素，-18℃氮气条件下保存48小时，然后在冰上过滤，13000r/min离心20min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后上样检测。
[0085] 仪器条件同实施例1。
[0086] 结果分析：
[0087] 图1A为样品温州蜜柑基于本申请的方法检测到的类胡萝卜素的色谱图，如图1B为样品温州蜜柑果肉经皂化提取后检测到的类胡萝卜素的色谱图，由色谱图图1A和图1B可知，图1A中柑橘样品的果肉类胡萝卜素色谱峰远多于图1B，基于本申请的方法，色谱分离效果更好、检测得到的类胡萝卜素的种类远多于样品皂化处理后的类胡萝卜素种类。
[0088] 实施例2-5
[0089] 与实施例1相似，不同之处在于，在步骤1)中选取不同的果肉样品不同，分别为一果肉(实施例2)、二果肉(实施例3)、三果肉(实施例3)、四果肉(实施例4)。
[0090] 实施例6
[0091] 与实施例1相似，不同之处在于，在步骤1)中选取的样品为温州蜜柑的果皮。
[0092] 结果分析
[0093] 如图2-6为基于本发明方法检测到的柑橘样品中类胡萝卜素的色谱图和总离子流图，图7为检测到的柑橘样品中类胡萝卜素β-Citraurin以及β-Carotene的二级质谱图，利用所得到的质荷比、二级质谱子离子及保留时间等信息可以对类胡萝卜素进行定性分析。基于本申请的方法，在一果肉中检测到的部分类胡萝卜素有50多种，在二果肉中检测到的部分类胡萝卜素有40多种，在三果肉中检测到的部分类胡萝卜素有80多种，在四果肉中检测到的部分类胡萝卜素有40多种，在温州蜜柑的果皮中检测到的部分类胡萝卜素有60多种，在柑橘样品的果皮和果肉中一共检测到110多种类胡萝卜素。然后，利用所得到的质荷比、二级质谱子离子及保留时间以及分析得到的类胡萝卜素的结构建立类胡萝卜素数据库，如表1所示，为类胡萝卜素数据库的几种类胡萝卜素的部分信息。
[0094] 表1：
[0095]
[0096] 如图8-9所示，基于本申请的方法，在进行胡萝卜素进行定性分析时，通过检测到的质荷比、二级质谱子离子及保留时间等信息，分析类胡萝卜素分子的断键规律，从而得到类胡萝卜素的结构，其中图8为一种类胡萝卜素(all-E)-violaxanthin myristate-palmitate的断键规律解析，图9A-E为得到的部分类胡萝卜素的结构。
[0097] 尽管上面已经详细描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由
权利要求及其等同物限定。
