一种降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌及其应用
阅读：996发布：2024-02-05
专利汇可以提供一种降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种降解奶 牛 粪便 酸臭物的赖 氨 酸芽孢杆菌及其应用。本发明提供的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC No：M 2017289。赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在木屑等 生物 质 基质中，可以有效地降解其中所含的短链酸臭类 脂肪酸 类化合物，适于制作 奶牛 养殖床生态养殖方式中的高效 微生物 菌剂产品。本发明中的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1还可以高效降解吲哚和粪臭素这两类畜禽养殖业中的有机类污染物，因此在生态养殖与环境治理等方面具有很好的应用前景。，下面是一种降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一种降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1，其保藏编号为CCTCC NO：M
2017289。
2.如权利要求1所述的降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1，其特征在于：所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1的核糖体16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1进行放大培养的方法，其特征在于，利用液体培养基进行放大培养，所述液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，干牛粪5g/L，调节pH至7.0，培养基经灭菌处理后，分别加入1g/L的乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，以及0.1g/L吲哚和0.1g/L粪臭素，调节pH至7.0；液体培养过程中，培养温度为32℃，菌种接种量按菌体湿重计为0.05-0.2g/L。
4.权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1进行放大培养的方法，其特征在于，利用固体培养基进行放大培养，所述固体培养基的配方为：草粉10％，麸皮10％，豆粕10％，5％玉米粉，15％木屑，干牛粪3％，1％微晶纤维，水含量调到40～50％；种子培养液的接种比为5～10％；固体培养中进行低速搅拌，每10分钟一次，培养温度为32℃。
5.权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在降解短链脂肪酸、吲哚及粪臭素类物质中的应用。
6.权利要求1所述的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在奶牛养殖床中进行奶牛粪污原位处理中的应用。
7.如权利要求6所述的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在奶牛养殖床中进行奶牛粪污原位处理中的应用，其特征在于：所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在养殖床中的有效生物量密度为
1.0x105～10x105CFU/ml生物垫料。
8.如权利要求6所述的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在奶牛养殖床中进行奶牛粪污原位处理中的应用，其特征在于：所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1处理奶牛粪污的处理温度为25～40℃，pH值为4.0～9.5。
一种降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 我国的畜禽养殖业逐步走向规模化、集约化，其养殖模式和养殖技术都得到了巨大的提高，但这种规模化的养殖方式在推动我国农业经济发展的同时，也因为养殖密度过高以及用地的限制等因素带来各种各样的环境污染问题，致使农业面源污染的最大源头变为养殖业污染，并促使农业污染排放在近年来逐步超过工业面源排放。
[0003] 奶牛养殖过程中的粪污处理量特别大，一个大型的奶牛场如有10000头奶牛的存栏量时，每天可产生600吨粪便和尿液，其中每天N、P、K的排放量分别达1.92吨、1.5吨和0.96吨，同时带来大量的酸臭污染物，如牛粪中含有大量挥发性的低级脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、3-甲基丁酸、戊酸)、甲硫醚、二氧化碳、二甲胺、粪臭素、氨气、二氧化氮、二氧化硫、硫化氢等，如处理不当或不及时便会带来周边水环境及土壤的严重污染。传统的集中处理方式进行粪污治理时，需要通过水冲粪的方式，再通过固液分离、厌氧发酵、堆肥等方式进行处理，这种方法需要大量的人力、水电、设备投资和消耗。而近年来发展的奶牛养殖发酵床(奶牛养殖床)技术是一种新型的生态处理方法，利用高效微生物快速降解粪便中有机物及其他残余物的能力，真正地实现无污染、零排放的目的，且操作简便、经济高效、省时省力，因而逐渐得到养殖业主及各级环保部门的青睐。运用这种技术实时粪污处理时，是将高效混合菌剂按一定比例撒到牛棚中铺好的有机垫料上，牛在发酵床上休息、拱翻、踩踏，奶牛粪尿和发酵床中的垫料经充分混合，被养殖床中的微生物快速降解。
[0004] 奶牛粪便中富含短链脂肪酸，它们是多种有机物的代谢产物，特征在于 碳链中的碳原子数少于6，易挥发，主要包括乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸。它们是奶牛消化道中未被消化、吸收的食物残渣被肠道微生物菌群进一步降解产生的发酵产物。短链脂肪酸具有强烈的酸臭味，易挥发，是牛粪中的主要酸臭物，不仅会污染养牛场周边的环境，还对周边居民的生活和健康造成一定的影响，同时还会影响奶牛的身体健康以及奶制品的品种。自然环境中存在大量可以降解短链脂肪的高效微生物，它们是奶牛养殖床高效微生物的主要组成部分，对这些微生物的分离、放大生产和应用是奶牛养殖床技术的核心。
发明内容
[0005] 本发明的目的是，提供一种降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 一种降解奶牛粪便酸臭物的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis LF-N1，其保藏编号为CCTCC NO：M 2017289。
[0008] 本发明提供了一种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)，是从奶牛粪便堆积场所分离而来，命名为Lysinibacillus fusiformis LF-N1。于2017年5月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017289。保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0009] 所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1通过在液体筛选培养基中加入多种有机酸、吲哚和粪臭素进行诱导驯化培养，然后在加入琼脂的固体培养板上分离得到。分离得到的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1纯培养菌经生化功能检测，发现其具有很强的短链脂肪酸及其它酸臭类物质的降解功能。该菌革兰氏染色为阳性，在LB营养培养板上的单菌落形态呈棕黄色，半透明，边缘光滑整齐；光学显微镜下观察其细胞形态呈杆状，可生成孢子，大小约为(0.5-1.0)×(3.0-5.0)μm。
[0010] 上述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1经过核糖体16s DNA(16s rDNA)的扩 增，碱基对的PCR产物经测试获得其序列，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。该序列经BLAST序列同源性比对及遗传进化树的分析，鉴定该菌株的属于赖氨酸芽孢杆菌属，因此命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)LF-N1。
[0011] 本发明利用上述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1进行了液体培养基的放大培养，所用的液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，5g/L干牛粪，调节pH至7.0，培养基经灭菌处理后，分别加入1g/L乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，以及
0.1g/L吲哚和0.1g/L粪臭素，调节pH至7.0；液体培养过程中，培养温度为32℃，菌种接种量按菌体湿重计为0.05-0.2g/L。
0.1g/L吲哚和0.1g/L粪臭素，调节pH至7.0；液体培养过程中，培养温度为32℃，菌种接种量按菌体湿重计为0.05-0.2g/L。
[0012] 本发明利用上述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1进行了固体培养基的放大培养，所用的固体培养基的配方为：草粉10％，麸皮10％，豆粕10％，5％玉米粉，15％木屑，干牛粪3％，1％微晶纤维，水含量调到40～50％；种子培养液的接种比为5～10％；固体培养中进行低速搅拌，每10分钟一次，培养温度为32℃。
[0013] 本发明还提供了所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在降解短链脂肪酸、吲哚及粪臭素类物质中的应用。
[0014] 本发明还提供了所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在奶牛养殖床中进行奶牛粪污原位处理中的应用。
[0015] 优选地，所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在养殖床中的有效生物量密度为1.0x105～10x105CFU/ml生物垫料。
[0016] 优选地，所述赖氨酸芽孢杆菌LF-N1处理奶牛粪污的处理温度为25～40℃，pH值为4.0～9.5。
[0017] 本发明提供的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1可以快速降解短链有机脂肪酸及吲哚和粪臭素，在人工调配的生物质基垫中，各种有机酸的含量分别为0.1％～0.2％，吲哚和粪臭素的含量分别为0.01～0.02％时，加入的有活性赖氨酸芽孢杆菌LF-N1的生物量为1.0x105～5
10x10CFU/ml时，25～40℃ 条件下处理24～72小时，各种有机酸、吲哚及粪臭素的去除率在99％以上。
10x10CFU/ml时，25～40℃ 条件下处理24～72小时，各种有机酸、吲哚及粪臭素的去除率在99％以上。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0019] 1，本发明利用微生物的天然生理特性，通过分离、训化、固液发酵组合的方式，提供了奶牛粪便酸臭物降解微生物的筛选、培育和使用方法，提高了高效菌种的生物量和催化性能，为奶牛养殖业提供了可实现零排放的切实可行的生物技术。
[0021] 图1为赖氨酸芽孢杆菌LF-N1在扫描电子显微镜下的典型细胞形态示意图，其中显微镜放大倍数为10,000倍。
[0022] 图2为本发明的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1对不同有机酸及粪臭化合物的降解曲线图。
具体实施方式
[0024] 实施例1赖氨酸芽孢杆菌LF-N1的富集培养及分离纯化
[0025] 取0.2g奶牛粪便堆积物，接种于100mL液体筛选培养基中，培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，5g/L干牛粪，乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸各为1g/L，以及0.1g/L吲哚和0.1g/L粪臭素，调节pH至7.0；培养物37℃、200r·min-1摇床培养48h。然后从上述培养液中取100μL菌液，接种于新的液体筛选培养基中(培养基配方同上)，重复上述培养操作2～3次。然后从最终 培养液中取100μL菌液，接种于驯化培养基中进行驯化培养，所述驯化培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，5g/L干牛粪，乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸分别为1.5g/L，以及0.15g/L吲哚和0.15g/L粪臭素，调节pH至7.0。然后在37℃、200r·min-1摇床培养48h，重复上述驯化培养操作2～3次；在重复驯化培养操作时，逐渐将添加的各种有机酸的浓度分别增加至
2g/L，吲哚和粪臭素的浓度分别增加至0.2g/L。最后从培养液中取100μL菌液，稀释后在含有10g/L的琼脂固体筛选培养基上涂布均匀，37℃培养3～5天，挑单菌落在平板上划线分离，重复上述操作2～3次。所述琼脂固体筛选培养基是指在上述液体筛选培养基中再添加
10g/L的琼脂粉，以获得固体培养基。
2g/L，吲哚和粪臭素的浓度分别增加至0.2g/L。最后从培养液中取100μL菌液，稀释后在含有10g/L的琼脂固体筛选培养基上涂布均匀，37℃培养3～5天，挑单菌落在平板上划线分离，重复上述操作2～3次。所述琼脂固体筛选培养基是指在上述液体筛选培养基中再添加
10g/L的琼脂粉，以获得固体培养基。
[0026] 实施例2菌株的扫描电镜观察、鉴定和种属分析
[0027] 经分离纯化的单克隆菌落赖氨酸芽孢杆菌LF-N1接种到50mL液体LB培养基,培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，取5μL液体样品用于制取扫描电子显微镜样本，在放大倍数为10，000x的成像照片中，该赖氨酸芽孢杆菌LF-N1的形态如图1所示的杆状。
[0028] 取1.5ml新鲜的赖氨酸芽孢杆菌LF-N1的培养液，离心12,000g，1min，移去上清，将细胞沉淀用基因组DNA提取试剂盒(购自Axygen公司的试剂盒)中提供的溶液重悬，根据试剂盒的操作说明进行基因组DNA的提取，最后将DNA沉淀溶于100μL TE缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)，并将该基因组DNA稀释至20mg/L，取1μL作为模板用于16S rDNA的扩增。
所用的引物对分别为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'及1492R：5'-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR的反应混合液配制如下：模板DNA 1μL，PCR Taq mix 25μL，上下游引物各1.0μL(20μM)，加ddH2O至50μL。PCR程序运行如下：94℃5min，94℃30s，53℃
1min，72℃ 1.5min，30个循环，再72℃10min，4℃1min。PCR扩增产物由PCR清洁试剂盒纯化，再由专业生物公司测序完成，如金唯智生物科技有限公司进行分析，所获得的序列利用网络工具完成Blastn分析，并由生物信息学软件Mega6完成遗传树分析。
所用的引物对分别为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'及1492R：5'-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR的反应混合液配制如下：模板DNA 1μL，PCR Taq mix 25μL，上下游引物各1.0μL(20μM)，加ddH2O至50μL。PCR程序运行如下：94℃5min，94℃30s，53℃
1min，72℃ 1.5min，30个循环，再72℃10min，4℃1min。PCR扩增产物由PCR清洁试剂盒纯化，再由专业生物公司测序完成，如金唯智生物科技有限公司进行分析，所获得的序列利用网络工具完成Blastn分析，并由生物信息学软件Mega6完成遗传树分析。
[0029] 测序完成的16S rDNA的有效序列长度为1442bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示。将该序列与NCBI数据库及GenBank中的16s rDNA序列进行同源性比对，结果表明其与Lysinibacillus fusiformis strain 4(NCBI登录号为KF916674.1)相似性最高，同源性高达97％，说明该菌为赖氨酸芽孢杆菌属中的一株菌，因此命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)LF-N1。
[0030] 实施例3赖氨酸芽孢杆菌LF-N1的有机酸臭物降解效果分析
[0031] 将LB平板上的单菌落赖氨酸芽孢杆菌LF-N1接种到50mL液体筛选培养基中，培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，5g/L干牛粪，调节pH至7.0，培养基经灭菌处理后，加入1g/L乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，以及0.1g/L吲哚和粪臭素。37℃、200r·min-1摇床培养24～48h，再将全部培养液接种至1000ml液体筛选培养基中，培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，5g/L干牛粪，另外含有0.1g/L吲哚和粪臭素，以及1g/L或者2g/L乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，调节pH至7.0；37℃，200rpm，振荡培养24～192h，定期取样1ml，经离心取上清，上清样品以高效效相色谱进行有机酸及其它酸臭物浓度的测定，结果如图2所示，测定氨氮(NH3-N)、硝酸盐(NO3-N)和亚硝酸盐(NO2-N)的浓度，通过分析总氮(TN)的残余量来计量菌株对无机氮的脱除率，并由此来判断菌株的异养硝化好氧反硝化性能。由图2可以看出，粪臭素和吲哚在48小时内降解完毕，有强烈异味的正丁酸也在48小时内降解完全，其余有机酸在4～6天内均获得完全降解。而对照组中的有机物质的浓度基本保持不变，所述对照组的培养基成分和实验 组相同但不添加赖氨酸芽孢杆菌LF-N1菌液。
[0032] 实施例4赖氨酸芽孢杆菌LF-N1的放大培养和生物量分析
[0033] 将单菌落赖氨酸芽孢杆菌LF-N1接种到液体培养基，所用的液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，5g/L干牛粪，1g/L乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，以及0.1g/L吲哚和粪臭素，调节pH至7.0；液体培养过程中，培养温度为
37℃，菌种接种量按菌体湿重计为0.05-0.2g/L，接种体积比约为1～5％，在摇床培养箱中
200r·min-1培养24～48h，再将50ml培养液接种至1000ml液体放大培养基中，液体放大培养基的配方为：草粉3％，麸皮6％，豆粕5％，5％玉米粉，干牛粪2％，1％微晶纤维，并含有
1g/L乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，以及0.1g/L吲哚和粪臭素；液体放大培养的温度为32℃，菌种接种量按菌体湿重计为0.05-0.2g/L，接种体积比约为1～5％，在摇床培养箱中37℃、200r·min-1培养3～5天。经二级液体培养放大的发酵液当作种子培养液，接种到固体培养基进行固体发酵，所用的固体培养基的配方为：草粉10％，麸皮10％，豆粕
10％，5％玉米粉，15％木屑，干牛粪3％，1％微晶纤维，水含量调到40～50％；种子培养液的接种比为5～10％；固体培养时进行低速搅拌，每30分钟一次，培养温度为32℃，连续发酵10～14天，对固体发酵物进行持续观察，到发酵固体呈黄褐色，酸臭味消失，并呈现微弱的酒香味时可终止发酵并检测发酵物的生物量。
37℃，菌种接种量按菌体湿重计为0.05-0.2g/L，接种体积比约为1～5％，在摇床培养箱中
200r·min-1培养24～48h，再将50ml培养液接种至1000ml液体放大培养基中，液体放大培养基的配方为：草粉3％，麸皮6％，豆粕5％，5％玉米粉，干牛粪2％，1％微晶纤维，并含有
1g/L乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸，以及0.1g/L吲哚和粪臭素；液体放大培养的温度为32℃，菌种接种量按菌体湿重计为0.05-0.2g/L，接种体积比约为1～5％，在摇床培养箱中37℃、200r·min-1培养3～5天。经二级液体培养放大的发酵液当作种子培养液，接种到固体培养基进行固体发酵，所用的固体培养基的配方为：草粉10％，麸皮10％，豆粕
10％，5％玉米粉，15％木屑，干牛粪3％，1％微晶纤维，水含量调到40～50％；种子培养液的接种比为5～10％；固体培养时进行低速搅拌，每30分钟一次，培养温度为32℃，连续发酵10～14天，对固体发酵物进行持续观察，到发酵固体呈黄褐色，酸臭味消失，并呈现微弱的酒香味时可终止发酵并检测发酵物的生物量。
[0034] 上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
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