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含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的药物组合物

阅读：573发布：2024-01-25

专利汇可以提供含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的目的在于鉴定将对新的医疗用途有用的多能干细胞(Muse细胞)诱导至损伤部位的迁移因子，并且提供包含在使用Muse细胞的再生医疗中，用于促进组织再生的迁移因子的药物组合物。与非Muse细胞进行比较，本发明确定了Muse细胞中特殊表达的受体，确认了针对该受体的配体能发挥迁移因子的作用。在本发明中，鉴定了1- 磷酸 -鞘氨醇(S1P)为迁移因子，因此本发明涉及包括S1P作为有效成分的用于将多能干细胞诱导至损伤部位的药物组合物。，下面是含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的药物组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种药物组合物，用于活化多能干细胞的迁移，其特征在于，包含作为有效成分的活化1-磷酸-鞘氨醇受体2的化合物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的活化1-磷酸-鞘氨醇受体
2的化合物为1-磷酸-鞘氨醇受体2的促效剂。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的1-磷酸-鞘氨醇受体2的促效剂为1-磷酸-鞘氨醇或者其衍生物。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的1-磷酸-鞘氨醇受体2的促效剂是选自以下物质：1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-5-(三氟甲基)吡啶-2(1H)-酮、1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)吡咯烷-2，5-二酮、1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-3-甲基咪唑啉-2，4，5-三酮、1-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-((1-甲基-1H-四氮唑-5-基)硫代)乙酮以及(S)-1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧代乙基)-2′，3′-二氢螺[咪唑烷-4，1′-茚]-2，5-二酮。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的活化1-磷酸-鞘氨醇受体
2的化合物为1-磷酸-鞘氨醇裂解酶抑制剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的1-磷酸-鞘氨醇裂解酶抑制剂是选自以下物质：(E)-1-(4-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羟基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮肟、(1R，2S，3R)-1-(2-(异噁唑-3-基)-1H-咪唑-4-基)丁烷-1，2，3，4-四醇以及
1-(5-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羟基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，迁移的活化为向生物体的损伤部位的诱导。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的多能干细胞为SSEA3阳性。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的多能干细胞为CD105阳性。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的多能干细胞为CD117阴性和CD146阴性。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性和CD271阴性。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性和Dct阴性。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的多能干细胞是具有以下全部性质的多能干细胞：(i)端粒酶活性低或者无活性；(ii)具有分化为三胚层中的任一胚层的细胞的能力；(iii)不表现出肿瘤性增殖；以及(iv)具有自我更新能力。

说明书全文

含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的药物组合

物

技术领域

[0001] 本发明涉及含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的药物组合物。

背景技术

[0002] 近年来，能对组织再生做出贡献的生物体来源的细胞正受到关注。作为从成体得到的具有分化能力的细胞，例如已知的具有向骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等分化的能力的骨髓间充质细胞部分(MSC)(非专利文献1和2)，但它是包括各种细胞的细胞群，承担其分化能力的细胞实体未知，治疗效果的偏差较大。另外，公布了iPS细胞(专利文献1)作为成体来源的多能干细胞，但是iPS细胞的建立需要在作为间充质细胞部分的皮肤纤维芽细胞等中将特定的基因、特定的化合物导入体细胞这样极其复杂的操作，而且iPS细胞还具有高的肿瘤形成能力，因此在临床应用中存在极高的障碍。

[0003] 根据本发明的发明人之一的出泽氏的研究，发现了在间充质细胞部分中存在、不进行诱导操作能够获得的、以SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3：阶段特异性胚胎抗原-3)作为表面抗原的多能干细胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells；Muse细胞)承担了间充质细胞部分所具有的多能性，了解到具有能应用于以组织再生为目标的疾病治疗的可能性(专利文献2；非专利文献3；非专利文献4)。另外，了解到多能干细胞(Muse细胞)存在于生物体内的间充质组织中，当生物体组织发生损伤时，聚集于该部位，担负组织再生(专利文献2；非专利文献3)。然而，不仅Muse细胞被诱导到损伤的组织的机理尚未阐明，将Muse细胞诱导至损伤部位的迁移因子也未鉴定出来。

[0004] 现有技术文献

[0005] 专利文献

[0006] 专利文献1：日本专利第4183742号公报

[0007] 专利文献2：国际公开第WO2011/007900号

[0008] 非专利文献

[0009] 非专利文献1：Dezawa，M.，et al.，J.Clin.Invest.，Vol.113，p.1701-1710(2004)[0010] 非专利文献2：Dezawa，M.，et al.，Science，Vol.309，p.314-317(2005)[0011] 非专利文献 3：Kuroda，Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.107，p.8639-8643(2010)

[0012] 非专利文献 4：Wakao，S，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.108，p.9875-9880(2011)

发明内容

[0013] 发明要解决的问题

[0014] 本发明的目的是提供在再生医疗中，使用多能干细胞(Muse细胞)的医疗用途，和鉴定增强Muse细胞的迁移活性，使Muse细胞高效地聚集于损伤部位的迁移因子，并且提供含有迁移因子的药物组合物。

[0015] 解决问题的手段

[0016] 本发明的发明人通过运用蛋白质组学分析，成功地鉴定了将Muse细胞诱导至损伤部位的迁移因子，发现作为迁移因子之一的1-磷酸-鞘氨醇(S 1P)与Muse细胞的迁移活性的增加，向损伤部位的聚集有关，完成了本发明。所谓迁移活性增加包括使存在于间充质组织内的Muse细胞开始向损伤部位迁移。

[0017] 即，本发明如下所述。

[0018] [1]一种活化多能干细胞迁移的药物组合物，含有活化1-磷酸-鞘氨醇受体2的化合物作为有效成分。

[0019] [2]根据上述[1]所述的药物组合物，活化1-磷酸-鞘氨醇受体2的化合物为1-磷酸-鞘氨醇受体2的促效剂。

[0020] [3]根据上述[2]所述的药物组合物，1-磷酸-鞘氨醇受体2的促效剂是1-磷酸-鞘氨醇或者其衍生物。

[0021] [4]根据上述[2]所述的药物组合物，1-磷酸-鞘氨醇受体2的促效剂是从包括以下物质的组中选出的：1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-5-(三氟甲基)吡啶-2(1H)-酮、1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)吡咯烷-2，5-二酮、1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-3-甲基咪唑啉-2，4，5-三酮、1-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-((1-甲基-1H-四氮唑-5-基)硫代)乙酮以及(S)-1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-2′，3′-二氢螺[咪唑烷-4，1′-茚]-2，5-二酮。

[0022] [5]根据上述[1]所述的药物组合物，活化1-磷酸-鞘氨醇受体2的化合物为1-磷酸-鞘氨醇裂解酶抑制剂。

[0023] [6]根据上述[5]所述的药物组合物，1-磷酸-鞘氨醇裂解酶抑制剂是从包括以下物质的组中选出的：(E)-1-(4-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羟基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮肟、(1R，2S，3R)-1-(2-(异噁唑-3-基)-1H-咪唑-4-基)丁烷-1，2，3，4-四醇以及1-(5-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羟基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮。

[0024] [7]根据上述[1]～[6]所述的药物组合物，迁移的活化为向生物体损伤部位的诱导。

[0025] [8]根据上述[1]～[7]所述的药物组合物，所述的多能干细胞为SSEA3阳性。

[0026] [9]根据上述[1]～[8]所述的药物组合物，所述的多能干细胞为CD105阳性。

[0027] [10]根据上述[1]～[9]所述的药物组合物，所述的多能干细胞为CD117阴性和CD146阴性。

[0028] [11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的药物组合物，所述多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性以及CD271阴性。

[0029] [12]根据上述[1]～[11]所述的药物组合物，上述多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性以及Dct阴性。

[0030] [13]根据上述[1]～[12]所述的药物组合物，所述的多能干细胞是具有以下全部性质的多能干细胞：(i)端粒酶活性低或者无活性；(ii)具有分化为三种胚层中的任一胚层的细胞的能力；(iii)不表现出肿瘤性增殖；以及(iv)具有自我更新能力。

[0031] 发明效果

[0032] 根据本发明，在通过Muse细胞的组织再生中，提供一种药物组合物，含有增强Muse细胞的迁移活性，将Muse细胞诱导至损伤部位的迁移因子。附图说明

[0033] 图1是表示使用实时PCR(定量的PCR)，以NHDF(正常人类皮肤纤维细胞)中的表达量为基准，Muse细胞中的各种1-磷酸-鞘氨醇受体(S1PR)的表达量的相对值的测试结果图。

[0034] 图2是表示为了测试Muse细胞的迁移所使用的Boyden小室和迁移因子造成的细胞迁移的模拟图。Boyden小室在其内部具有微孔径为8μm的嵌套室。在嵌套室的上部添加含有Muse细胞或者非Muse细胞的培养液，在嵌套室的下部添加含有迁移因子的培养液，18小时后对通过了嵌套室的细胞数进行计数。

[0035] 图3是对用Boyden小室测试的迁移细胞计数进行相对评价的图。图中，横轴表示迁移因子的不同浓度，纵轴表示将由于迁移因子(0nM)而迁移的Muse细胞设为1的情况下的相对值。

[0036] 图4是用于测试Muse细胞的迁移的简易细胞动态分析装置(EZ-TAXIScan)的概念图。装置中有2个狭缝，分别添加细胞和迁移因子，用箭头表示在平板上细胞指向迁移因子的样子。

[0037] 图5是表示用简易细胞动态分析装置测试的细胞迁移的照片。Muse细胞以通过长度为250μm深度为8μm被称为平台的结构的方式，按照迁移因子的浓度梯度而移动。照片左边表示添加了2μM的1-磷酸-鞘氨醇(S1P)的情况，照片右边表示未添加S1P的情况下的细胞移动。

[0038] 图6表示利用简易细胞动态分析装置分析S1P造成的Muse细胞的迁移的结果。左图表示Muse细胞向S1P直线地迁移的样子的实时测试结果。右图表示在不包含S1P的情况下Muse细胞随机扩散的样子的实时测试结果。

[0039] 图7是说明使用了小鼠的迁移因子造成Muse细胞迁移的试验过程图。所使用的小鼠为不排斥人源细胞的免疫缺陷的SCID小鼠(7周龄)。将浸染有S1P溶液的可降解水凝胶移植到小鼠的后背，将GFP阳性人类Muse细胞进行尾静脉给药后，采集水凝胶移植部位周边的组织，验证Muse细胞是否聚集在该部位。

[0040] 图8是表示将浸染于水凝胶的S1P溶液的浓度设为500nM和1000nM的情况下的聚集于水凝胶中的GFP阳性人类Muse细胞的聚集图。GFP的染色采用抗GFP抗体(Alexa568)。其结果显示了Muse细胞聚集取决于S1P溶液的浓度。

[0041] 图9为在水凝胶中，用每1mm2的细胞数评价聚集的Muse细胞。与图8的结果相同，Muse细胞聚集取决于S1P浓度。

具体实施方式

[0042] 本发明涉及含有将多能干细胞诱导至损伤部位的迁移因子的组合物及其应用。以下详细说明本发明。

[0043] 1.多能干细胞(Muse细胞)

[0044] 利用本发明的迁移因子诱导至损伤部位的多能干细胞，是本发明的发明人之一的出泽在人类体内发现其存在并命名为“Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring：多系分化持续应激)细胞”的细胞。Muse细胞能从骨髓液、真皮结缔组织等的皮肤组织得到，也散布在各脏器的结缔组织中。另外，该细胞是具有多能干细胞和间充质干细胞两者的性质的细胞，例如各自的细胞表面标记分子即“SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)”和“CD105”鉴定为双阳性。因此，包含Muse细胞或者Muse细胞的细胞集团，例如能以这些抗原标记为指标从生物体组织分离。Muse细胞的分离法、鉴定法和特征等的详细内容由国际公开第WO2011/007900号公开。另外，如由Wakao等(2011，上述)报道的那样，已知培养骨髓、皮肤等的间充质细胞，将其用作Muse细胞的母细胞群的情况下，SSEA-3阳性细胞全部为CD105阳性细胞。因此，在本发明的药物组合物中，在从生物体的间充质组织或者培养间充质干细胞分离Muse细胞的情况下，可以精制仅以SSEA-3作为抗原标记的Muse细胞并使用。应该指出，在本说明书中，有将以SSEA-3为抗原标记，从生物体的间充质组织或者培养间充质组织分离的包含多能干细胞(Muse细胞)或者Muse细胞的细胞集团记载为“SSEA-3阳性细胞”的情况。另外，本说明书中，“非Muse细胞”是指，在生物体的间充质组织或者培养间充质组织中包含的细胞中，“SSEA-3阳性细胞”以外的细胞。

[0045] 简单地说，将针对细胞表面标记的SSEA-3的抗体单独使用或者将分别针对SSEA-3和CD105抗体两者都使用，可以从生物体组织(例如间充质组织)分离包含Muse细胞或者Muse细胞的细胞集团。在此，“生物体”是指哺乳动物的生物体。在本发明中，生物体不包括比受精卵等囊胚期发育阶段靠前的胚胎，但是包括在包含胎儿、囊胚等囊胚期以后发育阶段的胚胎。哺乳动物中没有限制，能举出人类、猴等灵长类、小鼠、大鼠、兔子、土拨鼠等啮齿类、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、鼬等。在本发明中作为对象的Muse细胞，为生物体的组织来源这一点上，与胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)有明确的区别。另外，“间充质组织”是指存在于骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、腱、牙髓、脐带等组织和各种脏器中的结缔组织。例如，Muse细胞能从骨髓、皮肤得到。例如，优选采集生物体的间充质组织，从该组织分离、利用Muse细胞。另外，也可以用上述分离手段从培养的间充质细胞分离Muse细胞。

[0046] 如上所述，Muse细胞或者包含Muse细胞的细胞集团，可以以诸如SSEA-3阳性或者SSEA-3阳性和CD105阳性的双重阳性为指标从生物体组织分离，但是已知人类成人皮肤中含有各种类型的干细胞和祖细胞。然而，Muse细胞与这些细胞不同。在这样的干细胞和祖细胞中，能举出皮肤来源祖细胞(SKP)、神经嵴干细胞(NCSC)、成黑素细胞(MB)、血管周围细胞(PC)、内皮祖细胞(EP)、脂肪来源干细胞(ADSC)。在这些细胞中，将固有标记分子的“不表达”作为指标，能分离Muse细胞。更具体地说，Muse细胞能通过将从包括以下标记分子组中的11个标记分子中选择至少1个，例如将2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或者11个标记分子的不表达作为指标进行分离，上述标记分子组包括：CD34(EP和ADSC的标记分子)、CD117(c-kit)(MB的标记分子)、CD146(PC和ADSC的标记分子)、CD271(NGFR)(NCSC的标记分子)、NG2(PC的标记分子)、vWF因子(血管性血友病因子)(EP的标记分子)、Sox10(NCSC的标记分子)、Snai1(SKP的标记分子)、Slug(SKP的标记分子)、Tyrp1(MB的标记分子)以及Dct(MB的标记分子)。例如，但并非限定，能将CD117和CD146的不表达作为指标进行分离，还能将CD117、CD146、NG2、CD34、vWF和CD271的不表达作为指标进行分离，还能将上述11个的标记分子的不表达作为指标进行分离。

[0047] 另外，在本发明中作为对象的具有上述特征的Muse细胞也可以具有从以下一组性质中选择的至少1个性质：

[0048] (i)端粒酶活性低或者无活性；

[0049] (ii)具有分化为三胚层中的任一胚层的细胞的能力；

[0050] (iii)不表现出肿瘤性增殖；以及

[0051] (iv)具有自我更新能力。

[0052] 在本发明的一个方面，在本发明中作为对象的Muse细胞，具有全部上述性质。在此，关于上述(i)，“端粒酶活性低或者无活性”是指例如在使用TRAPEZE XL telomerase detection kit(端粒酶活性检测试剂盒)(Millipore公司：密理博公司)检测端粒酶活性的情况下，检测结果为低活性或者无法检测出。端粒酶活性“低”是指具有例如与作为体细胞的人类成纤维细胞同等程度的端粒酶活性，或者与Hela细胞相比为1/5以下，优选为1/10以下的端粒酶活性。关于上述(ii)，Muse细胞具有离体(in vitro)和在活体内(in vivo)分化为三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的能力，例如能通过离体诱导培养，分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。另外，在活体内移植到精巣的情况下也有表现出分化为三胚层的能力的情况。而且，通过静脉注射移植到生物体，具有向受到损伤的脏器(心脏、皮肤、脊髓、肝、肌肉等)中迁移并存活、分化的能力。关于上述(iii)，Muse细胞在悬浮培养时，具有以约1.3天的增殖速度增殖，在10天左右增殖停止的性质，在移植到精巣的情况下还具有至少半年间不发生癌变的性质。另外，关于上述(iv)，Muse细胞具有自我更新(自己复制)能力。在此，“自我更新”是指对通过对1个Muse细胞悬浮培养而得到的拟胚体样细胞块中包含的细胞进行培养，再次形成拟胚体样细胞块的过程。重复进行自我更新1次或者多次的周期即可。

[0053] 2.Muse细胞中特殊表达的蛋白质的鉴定

[0054] 目前已知Muse细胞向成体给药时，会向损伤部位归巢，另一方面，非Muse细胞不会向损伤部位归巢，但是将Muse细胞引导到损伤部位的迁移因子是未知的。因此，在假设存在将Muse细胞向损伤部位引导的迁移因子的情况下，首先通过确定在Muse细胞中特殊表达的而在非Muse细胞中不表达的蛋白质(特别是受体)，可以认为与其相对的配体等是迁移因子的可能性高。

[0055] 一般，已知蛋白质组学分析作为鉴定未知因子的方法是有用的。该分析是一种用于研究的分析方法，其目的在于，分析从细胞或者组织提取的蛋白质的生物化学和物理化学特性，利用通过基因组分析而明确的基因信息，明确上述蛋白质与将其编码的基因的对应，进而利用基因组排列信息，阐明有关所有基因的翻译产物的功能。

[0056] 在蛋白质组学分析中，现在通常使用的方法能举出肽质量指纹图谱(peptide mass-finger printing：PMF)法。在PMF法中，能通过二维电泳等将蛋白质分离，用胰蛋白酶等消化酶将该蛋白质消化为肽后，用质量分析装置取得肽混合物的质量谱图(肽质量指纹图谱)，通过将它和与来自基因组数据库的DNA的碱基排列对应的氨基酸排列计算出的理论质量图谱进行检索，可以鉴定蛋白质和将该蛋白质编码的基因。

[0057] 根据本发明，以鉴定对Muse细胞的迁移因子的受体为目的，能使用由东京都立大学的矶边俊明教授等的研究组开发的蛋白质组学分析。更具体地说，从进行比较的2个细胞群(Muse细胞群和非Muse细胞群)提取蛋白质(混合物)，基于分子量的差异通过电泳将它们的混合物分离。分离出的蛋白质在凝胶上被识别为各条带。接下来，通过LC-MS分析测试从凝胶切下的各个条带的质量。进而使用这些质量值从数据库自动检索并选出蛋白质，能鉴定在2个细胞群间不同的蛋白质(请参考例如田冈万悟等，“定本！蛋白质组学分析手册”(矶边俊明、高桥信弘编)pp.92-100，羊土社，2004)。此外，上述数据库没有限定，能使用已公开的蛋白质数据库的“SwissProt”。本发明的发明人通过使用上述蛋白质组学分析，来与非Muse细胞进行比较，确定Muse细胞中特殊表达的蛋白质(数据未示出)。如后所述，这些确定的蛋白质中，例如1-磷酸-鞘氨醇受体2(有时仅记为“S1PR2”)是Muse细胞特殊表达的而在非Muse细胞不表达的蛋白质(实施例2)。

[0058] 3.迁移因子的鉴定和确认

[0059] 在上述鉴定出的Muse细胞中特殊表达的蛋白质中，选择例如能成为迁移因子的受体的蛋白质，通过研究对这些受体的配体是否能成为迁移因子，能确定Muse细胞的迁移因子。一般，测试细胞迁移的方法没有限定，在离体的实验系统中能使用Boyden小室法、细胞动态分析技术等。简单地说，Boyden小室法是对细胞趋化性进行定量的有效方法，在Boyden小室内有作为独立的隔间的嵌套室，该嵌套室的底面装载有具有大量尺寸均匀(例如约为8μm)的微细孔的过滤器。在该过滤器上添加含有细胞的细胞培养液，在嵌套室的下部添加含有迁移因子的培养液，由此利用细胞沿着在过滤器的微细孔中产生的迁移因子的浓度梯度而穿过过滤器移动到下方的现象(图2)(请参照例如Boyden，S.，J.Exp.Med.，Vol.115，p.453-466(1962))。这样，对通过了过滤器的细胞数进行计数从而能定量地测试趋化性的程度。在本发明中，将迁移因子的候选物质添加到嵌套室的下侧，在上侧添加Muse细胞后，对Muse细胞的移动数进行计数，由此能评价所添加的候选物质是否能发挥迁移因子的作用。

[0060] 另一方面，细胞动态分析技术是ECI公司开发的细胞迁移能分析法(请参照Nitta，et al.，免疫学方法杂志(Journal of Immunological method)；320，
155-163(2007))，是如下系统：使用运用最新的微加工技术作成的硅晶片，在玻璃基板上形成一定的趋化性因子的浓度梯度，可以测试取决于该梯度的细胞在水平方向上的迁移性。
对用该系统得到的图像进行实时分析，由此能对方向性(例如Muse细胞相对于迁移因子的高浓度侧，向多少个方向的前进)进行定量化。如后所述，在使用1-磷酸-鞘氨醇(S1P)作为候选物质之一的情况下，在使用了Boyden小室法和细胞动态分析技术的实验系统中均明显观察到了Muse细胞的迁移性(实施例2)。

[0061] 另外，在活体内的实验系统中，例如能使用将小鼠作为实验模型的系统来鉴定迁移因子。更具体地说，向不排斥人源细胞的免疫缺陷小鼠的组织内移植浸染有迁移因子的凝胶(例如水凝胶)，然后从尾静脉将进行了GFP标示的人类Muse细胞给药，由此能通过组织化学观察该Muse细胞是否向包含所移植的迁移因子的凝胶聚集，来确定迁移因子。如后述的实施例2所示，可知GFP阳性Muse细胞取决于S1P浓度而聚集。

[0062] 4.迁移因子的应用

[0063] 本发明提供含有使Muse细胞的迁移活性增强并将Muse细胞诱导至损伤部位的迁移因子作为有效成分的药物组合物。本发明的药物组合物中使用的“迁移因子”意为如下物质：例如与在Muse细胞的细胞表面上表达的受体结合，通过该结合，使参与细胞的迁移的信号传递系统活化，结果使细胞指向迁移因子迁移。另外，在本发明中使用时，用语“损伤部位”意为在生物体内的各种脏器、器官和组织中由于外伤、炎症、疾病、缺血、坏死、形成肿瘤或者老化等原因各种细胞和组织变性或者脱落导致失常的特定部位。根据本发明，为了使Muse细胞聚集于损伤部位，可以使用将迁移因子和医药可接受的载体和/或稀释剂配合而成的药物组合物，或者也可以单独使用迁移因子。在此，本发明的药物组合物中含有的迁移因子，只要是具有将Muse细胞诱导至损伤部位的能力的物质(例如蛋白质、肽、脂质、化合物等)即可，没有特别限定。更优选迁移因子是1-磷酸-鞘氨醇(S1P)、1-磷酸-鞘氨醇衍生物以及1-磷酸-鞘氨醇受体的促效剂。在此，“1-磷酸-鞘氨醇(S1P)”是指具有下式：

[0064] [化学式1]

[0065]

[0066] 的构成的细胞膜的鞘脂类的代谢产物。S1P也作为如下生理活性物质而被知晓：在利用某种酶从细胞膜中切割出并游离后，与在细胞膜上表达的G蛋白质偶联受体结合，由此引起细胞迁移等。另外，作为针对S1P的受体，已知G蛋白质偶联受体的S1P受体，目前已知存在S1PR1～S1PR5这5种。在此，本发明的发明人在尝试调查Muse细胞和非Muse细胞中的S1P受体的表达时，明确了S1PR1在两细胞中表达，而S1PR2在Muse细胞中表达(数据未示出)。

[0067] 根据本发明，用于本发明的药物组合物的迁移因子只要是使Muse细胞的迁移性提高的物质即可，不限定为S1P，也可以使用S1P衍生物。S1P衍生物没有特别限定，能举出鞘磷脂、半乳糖基鞘氨醇(吐根素)，葡萄糖鞘氨醇(葡萄糖神经酰胺)，磺酸半乳糖基鞘氨醇(溶血硫脑苷脂)，N，N-二甲基鞘胺醇1-磷酸，N，N，N-三甲基鞘胺醇1-磷酸，神经酰胺1-磷酸，二氢鞘氨醇1-磷酸，植物鞘氨醇1-磷酸和脱氢植物鞘氨醇1-磷酸以及它们的盐。
另外，根据本发明，本发明的药物组合物中使用的迁移因子能使用针对S1PR2的促效剂。这种促效剂能举出具有下述结构：

[0068] [化学式2]

[0069]

[0070] 的1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧代乙基)-5-(三氟甲基)吡啶-2(1H)-酮(参照例如Park，S.W.，et al.，J.Am.Soc.Nephrol.，23，p.266-80(2012))、具有下述结构：

[0071] [化学式3]

[0072]

[0073] 的1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)吡咯烷-2，5-二酮、具有下述结构：

[0074] [化学式4]

[0075]

[0076] 的1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-3-甲基咪唑啉-2，4，5-三酮、具有下述结构：

[0077] [化学式5]

[0078]

[0079] 的1-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-((1-甲基-1H-四氮唑-5-yl)硫代)乙酮以及具有下述结构：

[0080] [化学式6]

[0081]

[0082] 的(S)-1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-2′，3′-二氢螺[咪唑烷-4，1′-茚]-2，5-二酮等。

[0083] 另外，S1P在生物体内由存在于内质网的1-磷酸-鞘氨醇裂解酶进行脱磷氧化，分解为反-2-十六烯醛和乙醇胺磷酸，通常，已知该脱磷氧化反应与反-2-十六烯醛附加磷酸的反应处于平衡状态。因此，为了提高S1P的浓度，也能将阻碍负责脱磷氧化反应的S 1P裂解酶的物质在本发明的药物组合物中使用。这种阻碍S1P裂解酶的物质能举出具有下述结构：

[0084] [化学式7]

[0085]

[0086] 的(E)-1-(4-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羟基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮肟(参照例如Bagdanoff，J.T.，et al.，J.Med.Chem.，vol.53，p.8650-8662(2010))；具有[0087] [化学式8]

[0088]

[0089] 的(1R，2S，3R)-1-(2-(异噁唑-3-基)-1H-咪唑-4-基)丁烷-1，2，3，4-四醇(Bagdanoff(波格丹诺夫)等，如上所述)；和具有

[0090] [化学式9]

[0091]

[0092] 的1-(5-((1R，2S，3R)-1，2，3，4-四羟基丁基)-1H-咪唑-2-基)乙酮(例如，Cayman Chemical Item Number(开曼化工货号)13222Cayman Chemical Com.(开曼化工公司)，密歇根，USA)等。

[0093] 在将含有本发明的迁移因子的药物组合物以组织再生为目的应用于治疗的情况下，给药路径没有特别限定，能根据治疗目的而适当选择。例如可以是注射剂、口服剂、栓剂、吸入剂等的任一种，在目的为使Muse细胞聚集于损伤部位的情况下，优选将本发明的迁移因子或者药物组合物于损伤部位直接给药。另一方面，在为了将本发明的药物组合物送达损伤部位而进行了修饰等的情况下，不限于直接注入损伤部位，也可以将药物组合物进行静脉给药。另外，在以生物体内间充质组织中存在的Muse细胞开始迁移为目的下，也可以进行静脉给药等全身性给药。此外，适合于这些给药方式的药物组合物能运用公知的制药方法来制备。

[0094] 在调制注射剂的情况下，能向迁移因子添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、张度剂、局部麻醉剂等，利用常规方法制备局部用注射剂。pH调节剂和缓冲剂能举出例如柠檬酸钠、醋酸钠、磷酸钠等。稳定剂能举出例如焦亚硫酸钠，EDTA(依地酸钠)、硫代乙醇酸，硫代乳酸等。局部麻醉剂能举出例如盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。张度剂能举出例如氯化钠、葡萄糖等。

[0095] 另外，在将本发明的药物组合物或者迁移因子直接注入损伤部位的情况下，也可以使用在含有上述注射剂成分的可降解水凝胶等的载体中包含本发明的药物组合物或者迁移因子的薄片。能使用的可降解水凝胶没有限定，能举出胶原蛋白、纤维连接蛋白、明胶、琼脂糖等作为主成分的凝胶。另外，除了可以直接注入损伤部位，在发生梗塞等时，也可以将本发明的药物组合物或者迁移因子涂敷在用于进行血管扩张的支架的内径。另外，为了帮助Muse细胞带来的组织再生，也可以混入使聚集的Muse细胞的生存性提高的成分(例如增殖因子、细胞活素)。

[0096] 本发明的药物组合物中包含的迁移因子的浓度能根据损伤部位的损伤程度、迁移因子的种类而适当变更。对于诱导Muse细胞有效的迁移因子的浓度没有限定，例如为1nM～100μM。另外，在将迁移因子作为药物组合物进行注入或者给药的情况下，考虑上述迁移因子的浓度或者损伤的程度，能适当地决定药物组合物的注入量或者给药量、给药方式及其次数、期间等。

[0097] 通过以下实施例，更具体地说明本发明，但是本发明不受这些实施例的任何限定。

[0098] 实施例

[0099] 实施例1：通过蛋白质组学分析选出迁移因子的候选物质

[0100] 为了选出将Muse细胞诱导至损伤部位的迁移因子的候选物质，使用由东京都立大学的矶边教授等的研究组开发的蛋白质组学分析法(田冈等(2004)，参照上述)。该方法是对蛋白质混合物的蛋白酶消化中产生的复杂的肽混合物进行分析，由此大量鉴定原样品中含有的蛋白质的方法，也称为“枪序列法”。用于实施该方法的自动化系统由结合离子交换LC、分离用的反相LC和脱盐系统的复合型LC系统、混合型质量分析计、数据分析系统构成。在复合型LC系统中，特别地，以将分离样式不同的两种LC(离子交换系统和反相系统)组合为特征，能获得的系统整体的分离能力为各个分离法所具有的分离能力的积，因此能将非常大量的蛋白质或者肽分离。然后，根据质量，对生物体样品以高分辨率进行分离，进而利用提供质量信息的MS，通过接下来的比对信息的数据库检索，能对蛋白质或者肽进行鉴定。例如，对细胞或者组织的粗提取液进行胰蛋白酶消化得到的非常复杂的肽混合物，经1次分析获得约10,000～15,000的MS/MS图谱，能鉴定源自大致1,000种蛋白质的2,000～3,000种肽。在本实施例中，通过使用上述矶边等的自动化系统，与非Muse细胞进行比较，确定Muse细胞中特殊表达的蛋白质。

[0101] 实施例2：迁移因子的鉴定

[0102] (1)人类Muse细胞的准备

[0103] 人类Muse细胞的准备根据国际公开第WO2011/007900号小册子记载的方法进行。更具体地说，培养人类骨髓液的具有粘着性的间充质细胞，经过增殖，将慢病毒-GFP导入细胞。将包含用GFP标识的Muse细胞或者Muse细胞的细胞集团通过FACS分离为GFP和SSEA-3的双重阳性细胞。另外，非Muse细胞是上述间充质细胞中的SSEA-3为阴性GFP为阳性的细胞群，作为对照使用。然后，用磷酸缓冲生理食盐水或者培养液调整为规定浓度，使用以下的Boyden小室法和细胞动态分析技术。此外，在将培养骨髓间充质细胞等间充质细胞所得到的细胞用作Muse细胞母细胞群的情况下，如由Wakao等(2011，上述)的报道，可知SSEA-3阳性细胞全部是CD105阳性细胞。

[0104] 在上述实施例1中得到的作为迁移因子的候选之一的1-磷酸-鞘氨醇受体2(S1PR2)暗示了Muse细胞中特殊表达的可能性。因此，当尝试用蛋白质组学分析调查Muse细胞和非Muse细胞中针对S1P的受体的表达时，可知S1PR2仅在Muse细胞中表达(数据未示出)。另外，S1PR1在Muse细胞和非Muse细胞中均表达(数据未示出)。而且，S1PR根据其表达部位、氨基酸排列、碱基排列等不同已知有S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5这5种，在Muse细胞中，通过实时PCR(定量的PCR)对它们表达的有无和表达量的差异进行了比较(图1)。考虑到上述结果，暗示了S1PR2在Muse细胞中特殊表达。因此，用以下的实验系统确认了与S1PR2结合的S1P是对Muse细胞特异的迁移因子之一。

[0105] (2)Boyden小室法

[0106] 为了定量测试迁移因子造成的Muse细胞的迁移而使用了Boyden小室法。所使用的Boyden小室法是使用从密理博(Millipore)出售的QCM趋化细胞迁移检测试剂盒(QCM Chemotaxis Cell Migration Assay Kit)(QCM 24Well Colorimetric Cell Migration Assay：QCM 24色细胞迁移实验)。该Boyden小室在腔室内部包括具有8μm的均匀微细孔的底部具有过滤器的嵌套室。在嵌套室的过滤器上部添加含有Muse细胞或者非Muse细胞的培养液，在嵌套室的下部添加含有迁移因子的培养液，培养18小时后，对通过了过滤器的微细孔的细胞数进行计数(参照图2)。使用该方法对在实施例1中得到的迁移因子的候选分别进行试验，由此能确定针对Muse细胞的迁移因子。

[0107] 更具体地说，在过滤器上按1×105细胞/孔的浓度接种Muse细胞或者非Muse细胞，在嵌套室的下部添加含有规定浓度(0，100，500，1000，5000nM)S1P的培养液。对细胞进行18小时培育后，对通过了过滤器的微细孔的细胞进行计数。结果如图3所示。在图中，横轴表示S1P的不同的浓度，纵轴表示将由于S1P(0nM)而迁移的Muse细胞设为1的时，针对各浓度的细胞数的相对值。从图3可知，在添加了Muse细胞的系统中，迁移的细胞数取决于S1P的浓度而增大，因此暗示了S1P对Muse细胞发挥迁移因子的功能。另一方面，非Muse细胞对任一浓度的S1P均不表示出迁移性，因此暗示了S1P是对Muse细胞特殊的迁移因子。

[0108] (3)细胞动态解析技术(TAXIScan技术)

[0109] 细胞动态分析技术是ECI公司开发的细胞迁移能分析法(请参照Nitta，et al.，免疫学方法杂志(Journal of Immunological method)；320，155-163(2007))。在使用该分析法的装置中使用如下系统：用运用最新的微加工技术制备的硅晶片，形成一定的趋化性因子的浓度梯度，能测试细胞取决于该梯度而在水平方向上的迁移活性(图4)。对从该系统得到的结果进行图像分析，由此能对方向性(例如Muse细胞相对于迁移因子高浓度侧，向多少个方向前进)进行定量化(图5)。

[0110] 更具体地说，在芯片上部的腔室设置的约的孔的一方按任意的细胞密度添加Muse细胞，从另一方狭缝添加S1P(2μM)作为迁移因子。从添加细胞和S1P后开始微速摄影，观察约14小时。在设于硅晶片设置的具有宽度为1200μm、平台长为250μm以及深度为8μm的结构的平台中，测试各细胞在其长度方向上移动的距离，由此来评价细胞的迁移性。此外，将未添加S1P的系统作为对照。图6左边是按2μM添加了S1P的情况下的Muse细胞(A～N)的迁移性的实时观察结果。图6右边表示未添加S1P的情况下的Muse细胞的运动的观察结果。在添加了S1P的系统中，观察到Muse细胞(A～N)根据S1P的浓度梯度直线地通过平台的情况。另外，在一部分细胞中，也存在无法通过平台的细胞，但认为它们主要是被设于平台的柱阻碍了迁移(图6右边)。另一方面，在未添加S1P的系统中，Muse细胞(a～j)只是随机扩张(图6左)。根据上述结果，与使用Boyden小室法进行评价的情况相同，强烈暗示了S1P是针对Muse细胞的特殊的迁移因子。

[0111] 另外，使用作为S1PR2的促效剂的1-(2-(1-苯甲基-2，5-二甲基-1H-砒咯-3-基)-2-氧乙基)-5-(三氟甲基)吡啶-2(1H)-酮来代替S1P，与上述相同地实时观察Muse细胞的迁移性(数据未示出)。在添加了该促效剂(2μM)的系统中，观察到Muse细胞根据该促效剂的浓度梯度而直线通过平台的情况。根据上述结果确认了该促效剂对Muse细胞的迁移活性。

[0112] (4)活体内的迁移因子造成的Muse细胞的聚集

[0113] 将小鼠作为实验模型，按如下方式进行在生物体内Muse细胞是否会由于迁移因子而聚集(参照图7)的试验。所使用的小鼠是不排斥人源细胞的免疫缺陷的SCID小鼠(雄性7周龄)，从日本SLC株式会社或者日本查尔斯河株式会社(日本チャールス·リバー株式会社)购入。使用S1P作为迁移因子。将预先浸染有S1P溶液(500nM或者1000nM)的大小为0.5cm×0.5cm的可降解水凝胶(MedGel(注册商标)制造)移植到小鼠后背的任意部位。然后，从小鼠的尾静脉注入在实施例1中准备的GFP标识的人类Muse细胞。2天后，从移植的部位取出水凝胶周边的组织，用GFP的抗体检测GFP标识，用激光显微镜对GFP阳性的Muse细胞进行计数。

[0114] 更具体地说，用针对GFP的抗GFP抗体(Alexa568，从英骏(Invitrogen)购入)，通过常用的组织化学方法对取出的水凝胶进行染色。染色图如图8所示。用箭头表示的部分表示GFP阳性Muse细胞。将S1P的浓度设为500nM的情况(图8左)和1000nM的情况(图8右)进行比较，可知Muse细胞的数量取决于S1P的浓度而增加。图中，右上的图像是中央部的方框包围的部分的放大图。另外，基于分别得到的图像对细胞数进行计数的结果如图9所示。根据其结果也可知Muse细胞取决于S1P的浓度而聚集。

[0115] 工业上的可利用性

[0116] 本发明的药物组合物，能够使Muse细胞聚集于损伤部位，在使用Muse细胞的再生医疗中，提供了以高效的组织再生为目的的新的医疗用途。

[0117] 本说明书中引用的全部刊物和专利文献通过参照而整体地援引到本说明书中。此外，以举例说明的目的，在本说明书中说明了本发明的特定实施方式，但是不脱离本发明的精神和范围进行各种的改变，对本领域技术人员而言均是显而易见的。

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