在光学葡萄糖测定中使用蓝移基准染料专利检索-波长物理专利检索查询-专利查询网

在光学 葡萄糖测定中使用蓝移基准染料

阅读：615发布：2021-06-09

专利汇可以提供在光学葡萄糖测定中使用蓝移基准染料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种竞争性葡萄糖结合亲和测定，该竞争性葡萄糖结合亲和测定包括用测定荧光团标记的葡萄糖受体(通常为甘露聚糖结合凝集素)以及用基准荧光团标记的改性葡萄糖类似物(通常为葡聚糖)。在某些实施方案中，葡萄糖类似物是葡聚糖，并且其偶联到基准荧光团和淬灭剂染料(例如，六甲氧基结晶紫-1)两者。任选地，基准荧光团相对于测定荧光团蓝移。，下面是在光学葡萄糖测定中使用蓝移基准染料专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种葡萄糖感测复合物，包含：
葡萄糖结合剂，所述葡萄糖结合剂偶联到测定荧光团；和
葡萄糖类似物，所述葡萄糖类似物偶联到基准荧光团；
其中所述基准荧光团相对于所述测定荧光团蓝移。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖感测复合物，其中所述葡萄糖类似物进一步偶联到淬灭剂。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖感测复合物，其中所述淬灭剂是六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖感测复合物，其中：
所述葡萄糖受体选自甘露聚糖结合凝集素(MBL)、刀豆蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸；并且/或者
所述葡萄糖类似物是葡聚糖。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖感测复合物，其中所述葡萄糖受体是甘露聚糖结合凝集素。
6.根据权利要求4所述的葡萄糖感测复合物，其中所述测定荧光团和所述基准荧光团独立地选自Alexa Fluor 594(AF594)、Alexa Fluor 647(AF647)和Alexa Fluor 700(AF700)，其中所述基准荧光团的波长短于所述测定荧光团的波长。
7.根据权利要求2所述的葡萄糖感测复合物，其中所述基准荧光团和所述淬灭剂染料形成荧光共振能量转移(FRET)对。
8.根据权利要求2所述的葡萄糖感测复合物，其中所述荧光团和/或所述淬灭剂染料是水溶性的。
9.根据权利要求1所述的葡萄糖感测复合物，其中所述测定荧光团表现出的波长比所述基准荧光团的所述波长大至少50纳米。
10.根据权利要求4所述的葡萄糖感测复合物，其中所述葡聚糖大约为100kDa。
11.一种制备葡萄糖感测复合物的方法，包括通过以下方式形成葡萄糖感测复合物：
将葡萄糖结合剂偶联到测定荧光团；以及
将葡萄糖类似物偶联到基准荧光团；
其中所述基准荧光团和所述测定荧光团被选择为使得所述基准荧光团所发射的一定波长下的光相对于所述测定荧光团所发射的光蓝移。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述测定荧光团表现出的波长比所述基准荧光团的所述波长大至少50纳米。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述测定荧光团表现出的波长比所述基准荧光团的所述波长大至多100纳米。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述葡萄糖受体包含甘露聚糖结合凝集素(MBL)，并且所述葡萄糖类似物是葡聚糖。
15.一种感测溶液中的葡萄糖的方法，包括：
(a)使所述溶液与葡萄糖感测复合物接触，所述葡萄糖感测复合物包含：
葡萄糖结合剂，所述葡萄糖结合剂偶联到测定荧光团；和
葡萄糖类似物，所述葡萄糖类似物偶联到基准荧光团；
其中所述基准荧光团相对于所述测定荧光团蓝移；
(b)观察所述葡萄糖感测复合物的指示葡萄糖存在的信号；以及
(c)将所观察到的信号与葡萄糖的浓度关联。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶液包含间质液或血液。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述葡萄糖感测复合物设置在体内。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述感测包括使用两种不同光源激发所述基准荧光团和所述测定荧光团。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述测定荧光团表现出的波长比所述基准荧光团的所述波长大至多100纳米。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述测定荧光团表现出的波长比所述基准荧光团的所述波长大至少50纳米。

说明书全文

在光学葡萄糖测定中使用蓝移基准染料

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请依据美国专利法第120条要求2017年4月28日提交的美国专利申请序列号15/581,540的优先权，其内容以引用方式并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及光学分析物测定，并且具体地讲，涉及用于感测葡萄糖的荧光竞争性结合测定。

背景技术

[0004] 在体内保持正常葡萄糖水平是糖尿病患者可避免与糖尿病相关联的长期问题(诸如视网膜病变、循环问题和其他后遗症)的重要方式。为此，糖尿病患者要定期监测其血液葡萄糖水平以例如优化胰岛素给药。在这个背景下，已开发了用于监测血液葡萄糖水平的多种系统和方法。一种策略使用荧光化合物来检测葡萄糖水平，例如采用竞争性结合测定，在该测定中，葡萄糖和荧光团标记的葡萄糖配体/类似物竞争葡萄糖受体的结合位点并且所产生的荧光变化被转换为葡萄糖浓度。

[0005] 在某些竞争性葡萄糖结合测定中，葡聚糖用作可替换的葡萄糖配体。在此类测定中，可使用亲脂性(和阳离子型)染料诸如六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)来标记葡聚糖。然而，存在与葡聚糖的柔性聚-(1,6)-葡萄糖主链偶联的大量(例如，大于10个)亲脂性染料分子可使此类标记的葡聚糖分子采取水溶性更小的构象，从而可引起这些分子沉淀。此外，此类染料诱导的构象变化可迫使标记的葡聚糖处于更为亲脂性的状态，这可引起葡聚糖对葡萄糖受体的结合能力的不利变化以及影响其荧光共振能量转移(FRET)效率。另外，在常规系统中，染料可在葡聚糖上发生分子内屏蔽，这一现象可导致该测定的校准随时间推移而变化，从而给该测定带来不稳定性。

[0006] 基准染料也用于某些荧光测定中以便跟踪实验设置的变化，例如光源波动、光路变化(使光耦合到光导中、机械扰动(如弯曲)、温度变化等)。传统上，光学或基于荧光的感测系统利用相对于测定荧光团红移的基准荧光团。然而，通过使用具有比所需更多的能量的更低波长的光来激发荧光团，荧光分子中发生从电子基态(S0)到第二激发态(S2)而非到第一激发电子态(S1)的电子跃迁的风险会增加。处于S2的分子发生分解的可能性比处于S1的相同分子大得多。从而，如果荧光团被激发到S2而非仅S1，则会发生更快光漂白。

[0007] 因此，本领域需要这样的光学葡萄糖测定，其利用被选择为增强测定稳定性的试剂和材料。本文所公开的本发明例如通过使用被设计为包括多重标记的葡萄糖类似物/配体(例如，用促进亲水性的试剂偶联/标记的葡聚糖)和/或蓝移基准荧光团的测定来满足这一需求。如下所讨论，被设计为包括多重标记的葡萄糖类似物和/或蓝移基准荧光团的葡萄糖测定表现出材料特性(诸如测定稳定性)的改善。

发明内容

[0008] 本发明提供了用于葡萄糖测定中的优化的材料和方法。如下详细讨论，可对某些荧光葡萄糖测定中的成分进行选择和/或改性以便例如优化用于形成测定复合物的一系列成分的亲水-疏水平衡。这样产生了改进的测定，即测定成分随时间推移而发生更少不期望的构象变化的测定。对葡萄糖测定复合物的示例性改性包括通过以下方式对葡聚糖进行改性的那些：将该分子与被选择为防止葡聚糖带过多负电荷或正电荷的试剂偶联。此类改性产生的测定比其未改性的等同物更稳定。另外，在基准荧光团被选择为实现其亲水/疏水特征和/或相对于测定荧光团或指示剂荧光团蓝移(而非可能因低波长激发而变得对光不稳定的典型红移基准荧光团)的实施方案中，可增加基准荧光团和作为一个整体的测定复合物的稳定性。

[0009] 本发明的实施方案包括竞争性葡萄糖结合亲和测定以及用于制定和使用这些测定的方法。通常，该测定包括用测定荧光团标记的葡萄糖受体以及用基准荧光团和淬灭剂染料两者标记的葡萄糖类似物。在本发明的实施方案中，葡萄糖受体可选自甘露聚糖结合凝集素(MBL)、刀豆蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸。在典型实施方案中，葡萄糖受体是甘露聚糖结合凝集素。在一个示例性实施方案中，葡萄糖类似物是葡聚糖，测定荧光团和基准荧光团是Alexa 并且淬灭剂染料是六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)。在一些实施方案中，测定荧光团和基准荧光团独立地选自Alexa 647(AF647)和Alexa700(AF700)，并且测定荧光团和基准荧光团不同。通常，在此类实施方案中，该复合物的一种或多种成分(例如，葡聚糖)偶联到某试剂或用某试剂标记，该试剂被选择为具有电荷和/或亲水性/疏水性特征，从而有助于该复合物内的该试剂的稳定性并因此有助于作为一个整体的葡萄糖感测复合物的稳定性。本发明的实施方案还包括用于制定并使用这些改进的葡萄糖测定的方法。

[0010] 在本发明的其他实施方案中，该测定包括用测定荧光团标记的葡萄糖受体以及用基准荧光团标记的葡萄糖类似物，其中基准荧光团相对于测定荧光团蓝移。在一些实施方案中，还用淬灭剂染料(例如，六甲氧基结晶紫-1，HMCV1)标记葡萄糖类似物。葡萄糖受体可选自甘露聚糖结合凝集素(MBL)、刀豆蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸。在一种情况下，葡萄糖受体是甘露聚糖结合凝集素。通常，葡萄糖类似物是葡聚糖，并且测定荧光团和基准荧光团是Alexa 通常，荧光团和淬灭剂染料形成荧光共振能量转移(FRET)对。荧光团和/或淬灭剂染料通常还是水溶性的。在一个典型实施方案中，测定荧光团和基准荧光团独立地选自Alexa Fluor 594(AF594)、Alexa Fluor 647(AF647)和Alexa Fluor 700(AF700)，其中基准荧光团的波长短于测定荧光团。

[0011] 根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体示例虽然表明了本发明的一些实施方案，但是它们是以例示而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的实质的情况下，可以在本发明的范围内进行许多改变和修改，并且本发明包括所有这些修改。附图说明

[0012] 现在参见附图，在附图中，类似的附图标记始终表示对应的部分：

[0013] 图1A至图1C示出了根据本发明的一个或多个实施方案的具有发荧光配体的Optical。图1A示出了淬灭剂从染料变为荧光团并且省略基准荧光团。图1B是示出吸收光谱和发射光谱的变化的曲线图。图1C是示出葡萄糖浓度测量值和传感器剂量响应损失(DR损失)的曲线图。

[0014] 图2A至图2C示出了根据本发明的一个或多个实施方案的具有组合配体的Optical。图2A示出了标记到与染料淬灭剂相同的配体上的基准荧光团，从而消除了对基准载体的需求。图2B是示出吸收光谱和发射光谱的变化的曲线图。图2C是示出葡萄糖浓度测量值和传感器剂量响应损失(DR损失)的曲线图。

[0015] 图3是根据本发明的一个或多个实施方案的示出用于AF594-MBL/AF647-dex测定的ORS SITS数据的曲线图。

[0016] 图4是根据本发明的一个或多个实施方案的示出用于AF594-MBL/AF647-HMCV1-dex测定的ORS SITS数据的曲线图。这也用于大鼠试验76和77，如下图5至图7所示。

[0017] 图5是根据本发明的一个或多个实施方案的示出从大鼠研究76：大鼠#1，ORS传感器#2得出的数据的曲线图。在低-高转变的第一钳夹期间校准传感器。

[0018] 图6A至图6D示出了根据本发明的一个或多个实施方案的从大鼠研究76：大鼠#1，ORS传感器#2得出的钳夹1(图6A)、钳夹2(图6B)和钳夹3(图6C)的数据。图6D是外植体的图片。

[0019] 图7A至图7B示出了根据本发明的一个或多个实施方案的从大鼠研究77得出的数据。图7A示出了测定荧光团和基准荧光团的基线。注意稳定的测定基线和基准基线。图7B示出了从大鼠研究77得出的葡萄糖浓度测量值。

[0020] 图8是根据本发明的一个或多个实施方案的示出从AF594/AF647测定得出的数据的曲线图。

[0021] 图9是根据本发明的一个或多个实施方案的示出从AF594MBL/AF647-Dex和AF594/AF647-HMCV1-Dex测定：AF594与AF647荧光之间的最佳比率得出的数据的曲线图。

[0022] 图10是根据本发明的一个或多个实施方案的示出从用于AF594-MBL/647-Dex和AF594-MBL/AF647-HMCV1-Dex测定的滤光镜配置得出的数据的曲线图。

[0023] 图11示出了根据本发明的一个或多个实施方案的用于AF594/647测定的滤光镜配置。

[0024] 图12A至图12C提供了根据本发明的一个或多个实施方案的多重标记的葡聚糖(MLD)的标记度(DOL)确定的示例。图12A是示出HMCV1和AF647的归一化吸收光谱的曲线图。图12B是示出缀合物#478(HMCV1 X5和AF647 X15)和#479(HMCV1 X15和AF647 X5)的吸收光谱的曲线图。图12C是示出缀合物479(HMCV1 X15和AF647 X5)光谱及HMCV1和AF647吸收光谱的线性组合的曲线图。携带HMCV1和AF647的MLD缀合物的DOL包括：DOL#472(X10/X10)＝
5.7/4.1；DOL#478(X5/X15)＝3.6/9.4；以及DOL#479(X15/X5)＝8.1/2.1。

[0025] 图13是根据本发明的一个或多个实施方案的示出单一标记的葡聚糖性能的曲线图。该曲线图示出了全都在葡萄糖响应测定中使用单一标记的葡聚糖建立的五组传感器的剂量响应(DR)发展。DR被计算为相对于40mg/dL葡萄糖下的归一化强度而言400mg/dL葡萄糖和40mg/dL葡萄糖下的归一化强度之间的差值。相对于起始DR的DR损失介于每天3％至6％之间。仅用HMCV1标记的葡聚糖表现出大剂量响应(DR)损失。

[0026] 图14是根据本发明的一个或多个实施方案的示出多重标记的葡聚糖性能—HMCV1-AF647-葡聚糖的曲线图。

[0027] 图15是根据本发明的一个或多个实施方案的示出多重标记的葡聚糖性能—HMCV1-AF700-葡聚糖的曲线图。

[0028] 图16是根据本发明的一个或多个实施方案的示出多重标记的葡聚糖性能—HMCV1-HMCV3-葡聚糖的曲线图。

[0029] 图17是根据本发明的一个或多个实施方案的示出多重标记的葡聚糖性能—琥珀酰化HMCV1-葡聚糖的曲线图。

[0030] 图18是根据本发明的一个或多个实施方案的示出胶囊传感器中的不同染料和荧光团的归一化吸收和发射光谱的曲线图。

[0031] 图19是根据本发明的一个或多个实施方案的示出胶囊传感器中具有不同DOL值的组合配体、其DR和强度水平的表格。

具体实施方式

[0032] 除非另外定义，否则本文使用的所有专门术语、符号和其他科学词语或术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的存在实质性差异。本文描述或引用的许多技术和程序是很好理解的，并且常常由本领域的技术人员使用常规方法来采用。本文引用的所有出版物、专利和专利申请据此全文以引用方式并入以用于所有目的。在对典型实施方案的描述中，可参考形成其一部分的附图，并且其中以例示方式示出可实践本发明的具体实施方案。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案并可以进行结构改变。

[0033] 通常由糖尿病患者使用市售量热测试条或电化学生物传感器(例如，酶电极)来监测血液葡萄糖，量热测试条和电化学生物传感器均需要定期使用刺血针型器械以在每次进行测量时抽取适量血液。从经济方面及疼痛和不适方面来看，这都会给糖尿病患者带来相当大的负担，特别是长期糖尿病患者，其不得不定期使用刺血针从指尖抽取血液。因此，已针对不需要从患者抽取血液的葡萄糖测量技术提出了许多建议。已观察到，皮下积液中的分析物的浓度与血液中的该分析物的浓度相关，因此已有若干报道提出使用设置在皮下位置的葡萄糖监测设备。可进行远程询问的葡萄糖的竞争性结合测定的使用受到特别关注。

[0034] 测定竞争性结合的典型方法是基于接近度的信号生成/调制部分对(参见例如美国专利No.6,232,120)，其通常是能量转移供体-受体对(包括能量供体部分和能量受体部分)。能量供体部分是光致发光的(通常是荧光的)。在此类方法中，使能量转移供体-受体对与待分析的样品(诸如皮下积液)接触。然后照明该样品并且检测所产生的发射。供体-受体对的能量供体部分或能量受体部分任一者结合于受体载体，而供体-受体对的另一部分(结合于配体载体)和存在的任何分析物竞争受体载体上的结合位点。当供体和受体被放在一起时，供体和受体之间发生能量转移，从而产生能量供体部分的荧光的可检测寿命变化(缩短)。另外，能量供体部分所发射的一定比例的荧光信号被淬灭。分析物的竞争性结合减小或甚至消除了寿命变化。因此，通过例如由相位调制荧光测定法或时间分辨荧光测定法(参见Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy(《荧光光谱学原理》)，Plenum Press(普莱南出版社)，1983年，第3章)测量表观发光寿命，可确定样品中的分析物的量。

[0035] 除了激发态的寿命之外，所发射的荧光的强度也与葡萄糖浓度相关。与寿命测量相比，所发射的荧光的实测强度受到光源的强度以及该测定与光学系统之间的耦合的影响。因此，强度测量需要内部基准荧光团结合到该测定中。基准荧光团必须以一定方式区别于测定荧光团，使得来自该测定和来自该基准的所发射的荧光可彼此分开，例如因具有不同吸收光谱或发射光谱而分开。基准荧光团可为例如Alexa 594(AF594)，其标记到大体上不会结合于葡萄糖受体的人血清白蛋白(HSA)或另一种大分子上。Alexa700(AF700)可与AF594同时被激发，因为它们的吸收光谱是光谱重叠的。来自AF594的发射光谱相对于AF700略微蓝移，这使得可以在单独波长区域中检测其相应荧光发射。由于它们由相同的光源同时激发，光源强度的任何变化将使来自AF594和AF700的荧光同等地缩放。
因此，可抵消源自光源强度变化的任何效应。该测定和该基准的所发射的荧光的激发以及检测遵循从光学系统到该测定的相同光路。因此，来自该基准的所检测的信号用作光学询问系统与该测定之间的光耦合的量度。可抵消源自光耦合(诸如对准)变化的任何效应。

[0036] 当一个荧光团(即，供体)的受激电子的能量传递到附近受体染料(要么是淬灭剂(非发射发色团)，要么是具有与供体的发射光谱重叠的激发光谱的另一个荧光团)时，发生称为荧光共振能量转移(FRET)的荧光特殊特性。能量转移在没有出现光子的情况下发生，并且是供体和受体之间的长程偶极-偶极相互作用的结果。FRET的重要特性是其在与生物大分子的尺寸相当的距离内发生。FRET为50％有效的距离(称为距离)通常在的范围内。20至范围内的距离便于进行竞争性结合研究。WO91/09312描述了采用基于葡萄糖的亲和测定(结合能量转移供体-受体对)的皮下方法和设备，该亲和测定通过光学装置进行远程询问。示例WO1997/19188、WO2000/02048、WO2003/
006992和WO2002/30275各自描述了通过能量转移进行葡萄糖感测，该能量转移产生的光信号可被远程读取。

[0037] 本文所公开的本发明整体涉及光学或基于荧光的测定和分析物感测组合物。在本发明的示例性实施方案中，本发明的测定、组合物、系统和方法是结合作为要确定其水平/浓度的分析物的葡萄糖来描述的。然而，这仅作为示例而非限制，因为本发明的原理、设备、系统和方法可用于感测和/或确定多种其他生理参数、试剂、特性和/或组合物的水平。

[0038] 如本文所述，本发明的实施方案提供了传感器，该传感器被设计为包括设置在传感器的特定区域中的组合物以便为传感器提供增强的功能特性和/或材料特性。本公开还提供了用于制备并使用此类传感器的方法。本文所述的本发明的实施方案(诸如下文紧接的段落中讨论的那些)可适于传感器中的多种多样的元件并且使用传感器中的多种多样的元件来实现，该传感器具有感测复合物，该感测复合物生成的光信号可与分析物(诸如葡萄糖)的浓度相关。多个这些传感器和元件例如在美国专利6,6761,527、7,228,159、7,884,338、7,567,347、8,305,580和8,691,517以及美国专利申请公布2008/0188723、2009/
0221891、2009/018708、2009/0131773、2013/0060105和2014/0200336中有所公开，这些专利和专利申请公布各自的内容以引用方式并入本文。

[0039] 本文公开的本发明具有许多实施方案。一个示例性实施方案是葡萄糖感测复合物，该葡萄糖感测复合物包含偶联到测定荧光团、基准荧光团(例如，Alexa Fluor 647(AF647)或Alexa Fluor 700(AF700))的甘露聚糖结合配体；在该测定中充当葡萄糖类似物并且偶联到基准荧光团的葡聚糖、增强葡聚糖的亲水性的试剂以及淬灭剂(例如，六甲氧基结晶紫-1(HMCV1))。在该实施方案中，测定荧光团和淬灭剂形成荧光共振能量转移(FRET)对。通常，荧光团和/或淬灭剂染料是水溶性的。任选地，荧光团的标记度(DOL)为至少4.1并且淬灭剂染料的DOL为至少5.7。在本发明的一些实施方案中，增强葡聚糖的亲水性的试剂是淬灭剂。任选地，葡聚糖由酸酐化合物改性(例如，以便将葡聚糖偶联到调节葡聚糖的亲水性的部分)。通常，葡聚糖包含小于1500个葡萄糖单元。在本发明的一些实施方案中，葡萄糖感测测定复合物表现出每天小于2.5％的传感器剂量响应(DR)损失。

[0040] 本发明的实施方案可包括竞争性葡萄糖结合亲和测定，其包含用测定荧光团标记的葡萄糖受体以及用基准荧光团(例如，Alexa Fluor 647(AF647)或Alexa Fluor 700(AF700))和淬灭剂染料两者标记的葡萄糖类似物。在本发明的某些实施方案中，葡萄糖受体选自甘露聚糖结合凝集素(MBL)、刀豆蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸，葡萄糖类似物是葡聚糖，测定荧光团和基准荧光团是Alexa Fluors，并且淬灭剂染料是六甲氧基结晶紫化合物。在典型实施方案中，葡聚糖偶联到增强其亲水性的化合物或由增强其亲水性的化合物改性。

[0041] 感测溶液(例如，间质液或血液)中的葡萄糖的方法的另一个实施方案包括使该溶液与葡萄糖感测复合物接触，该葡萄糖感测复合物包含偶联到测定荧光团、基准荧光团的甘露聚糖结合配体；被选择为在该测定中充当葡萄糖类似物并且进一步偶联到基准荧光团的葡聚糖。该复合物还包含增强葡聚糖的亲水性的试剂以及淬灭剂。任选地，增强葡聚糖的亲水性的试剂是淬灭剂。在该实施方案中，测定荧光团和淬灭剂形成荧光共振能量转移(FRET)对。该方法包括观察葡萄糖感测复合物的指示葡萄糖存在的信号，然后将所观察到的信号与葡萄糖的浓度关联。

[0042] 本发明的又一个实施方案是葡萄糖感测复合物，该葡萄糖感测复合物包含偶联到测定荧光团的葡萄糖结合剂(例如，甘露聚糖结合凝集素)以及偶联到基准荧光团的葡萄糖类似物。在该实施方案中，被选择用于该复合物的基准荧光团相对于测定荧光团蓝移。通常，基准荧光团的波长低于测定荧光团的波长。任选地，测定荧光团表现出的波长比基准荧光团的波长大至少50纳米。任选地，葡萄糖类似物进一步偶联到淬灭剂(例如，六甲氧基结晶紫化合物)。在某些实施方案中，葡萄糖受体选自甘露聚糖结合凝集素(MBL)、刀豆蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸；并且/或者葡萄糖类似物是葡聚糖(例如，分子量介于90kDa-110kDa之间的葡聚糖)。在某些实施方案中，测定荧光团和基准荧光团独立地选自Alexa Fluor 594(AF594)、Alexa Fluor 647(AF647)和Alexa Fluor 700(AF700)。通常，基准荧光团和淬灭剂是水溶性的，形成荧光共振能量转移(FRET)对。

[0043] 本发明的另一个实施方案是制备葡萄糖感测复合物的方法，该方法包括通过将葡萄糖结合剂(例如，甘露聚糖结合凝集素(MBL))偶联到测定荧光团并且将葡萄糖类似物(例如，葡聚糖)偶联到基准荧光团来形成葡萄糖感测复合物。在该实施方案中，基准荧光团和测定荧光团被选择为使得基准荧光团所发射的一定波长下的光相对于测定荧光团所发射的光蓝移。通常，测定荧光团表现出的波长比基准荧光团的波长大至少50纳米。通常，测定荧光团表现出的波长比基准荧光团的波长大至多100纳米。在某些情况下，葡萄糖类似物进一步用琥珀酸酐处理。通常，葡聚糖大约为100kDa。在某些实施方案中，该组合物表现出每天小于2.5％的传感器剂量响应(DR)损失。在一种情况下，荧光团的标记度(DOL)为至少4.1并且淬灭剂染料的DOL为至少5.7。

[0044] 本发明的另一个实施方案是感测溶液(例如，间质液或血液)中的葡萄糖的方法，该方法包括使该溶液与葡萄糖感测复合物接触，该葡萄糖感测复合物具有偶联到测定荧光团的葡萄糖结合剂以及偶联到基准荧光团的葡萄糖类似物，其中基准荧光团被选择为相对于测定荧光团蓝移。该方法包括观察葡萄糖感测复合物的指示葡萄糖存在的信号，并且将所观察到的信号与葡萄糖的浓度关联。任选地，该方法包括使用两种不同光源激发基准荧光团和测定荧光团。通常，测定荧光团表现出的波长比基准荧光团的波长大至多100纳米，并且测定荧光团表现出的波长比基准荧光团的波长大至少50纳米。

[0045] 存在本发明的多种排列。如本文所述，分析物受体通常是凝集素，其包含任何碳水化合物结合蛋白。在典型实施方案中，葡萄糖受体是荧光团标记的甘露聚糖结合凝集素(MBL，也称为甘露糖/甘露聚糖结合蛋白，Sheriff等人，Structural Biology(《结构生物学》)，第1卷，第789-794页，1994年；Dumestre-Perard等人，Molecular Immunology(《分子免疫学》)，第39卷，第465-473页，2002年)。通常，该凝集素在该测定中提供至少10天、更典型地至少14天的稳定信号。特别优选的是，在传感器植入人体内时提供稳定信号。令人惊讶的是，已发现MBL在葡萄糖测定中稳定至少17天。

[0046] 可在本文所述的测定和传感器系统中替代地使用其他分析物受体或分析物结合部分。例如，分析物受体可为来源于人体的人凝集素，包含人肺表面活性蛋白A(SP-A，Allen等人，Infection and Immunity(《感染与免疫》)，第67卷，第4563-4569页，1999年)、人肺表面活性蛋白D(SP-D，Persson等人，The Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)，第265卷，第5755-5760页，1990年)或CL-43(人血清蛋白)。另选地，凝集素可为重组制造的凝集素或人源化动物凝集素，例如人源化牛凝集素。凝集素可另选地为动物凝集素、鸟凝集素、鱼凝集素、脊椎动物凝集素、无脊椎动物凝集素(例如，昆虫凝集素)或植物凝集素。合适的动物凝集素包含共凝集素、胶原凝集素-43(例如，牛CL-43)、肺表面活性蛋白(肺胶原凝集素)、PC-凝集素(US 2003/0216300、US 2004/0265898)、CTL-1(US 2010/179528)、角质形成细胞膜凝集素(Parfuemerie und Kosmetik《( 香水和化妆品》)，第74卷，第164-180页)、CD94(Eur J Immunol(《欧洲免疫学杂志》)，第25卷，第2433-2437页)、P35(又名：人L-纤维胶凝蛋白，一组凝集素)(Immunol Lett(《免疫学快报》)，第67卷，第109-112页)、ERGIC-53(又名：MR60)(Mol Biol Cell(《细胞分子生物学》)，第7卷，第483-493页)、HIP/PAP(Eur J Biochem(《欧洲生物化学杂志》)，第267卷，第1665-1671页)、CLECSF8(Eur J Immunol(《欧洲免疫学杂志》)，第34卷，第210-220页)、DCL(凝集素组)(申请no 00231996/US)以及GLUT家族蛋白，尤其是GLUT1、GLUT4和GLUT11(PNAS(《美国国家科学院院刊》)，第97卷，第1125-1130页)。其他合适的动物凝集素在“Handbook of Animal Lectins:
Properties and Biomedical Applications”(《动物凝集素手册：特性与生物医学应用》)，David C.Kilpatrick,Wiley 2000的附录A、B和C中列出。合适的植物凝集素或植物血凝素(PHA)包含刀豆蛋白A(Con A)以及来源于pisum sativum(豌豆)、lathyrus odoratus(香豌豆)、lens culinaris(小扁豆)、narcissus pseudonarcissus(黄水仙)、vicia faba(蚕豆)和vicia sativa(箭舌豌豆)的那些。分析物受体还可为周质葡萄糖/半乳糖结合受体、在葡萄糖样分子刺激下生成的抗体或硼酸。

[0047] 如本文所述，分析物类似物可包含多个碳水化合物或碳水化合物模拟部分，这些部分结合于分析物受体的结合位点。分析物类似物的分子量应足够高以防止逃离传感器，但应足够低，使得在分析物类似物结合于分析物受体时不会发生沉淀。分析物类似物可具有25至250kDa范围内且更典型地90至120kDa之间的重量。在葡萄糖是分析物的典型实施方案中，葡聚糖用作可替换的葡萄糖类似物/配体。葡聚糖是由至多1500个葡萄糖单元组成的柔性大分子。在某些情况下，葡聚糖由大约600个葡萄糖单元(约100kDa)组成，或由500-700个葡萄糖单元组成。

[0048] 可在本文所述的示例性测定和传感器系统中替代地使用其他分析物类似物和配体。分析物类似物可为合成聚合物，其带有对MBL和类似凝集素具有不同亲和力的不同碳水化合物或碳水化合物模拟部分。另选地，分析物类似物可为碳水化合物-蛋白缀合物或碳水化合物-树状大分子缀合物。适用于此类缀合物的碳水化合物的示例是单糖和低聚糖。合适的单糖是任选衍生的四糖、戊糖、己糖、庚糖或更高级的同系醛糖或酮糖，例如任选衍生的D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-岩藻糖、D-果糖、D-塔格糖或D-山梨糖醇。合适的低聚物可为直链或支链的均低聚物或混合低聚物，例如含有2至50个碳水化合物单元。

[0049] 如本文所述，荧光团或荧光色素是能够吸收特定波长的光能并且在更长的波长下重新发射光能的化合物。荧光团还可用于淬灭其他荧光染料的荧光或在甚至更长的波长下传递其荧光(FRET)。通常，Alexa (AF)594、647和/或700用作分别标记葡萄糖类似物和葡萄糖受体的基准荧光团和测定荧光团。本领域技术人员理解，也可替代地使用适用于光学葡萄糖测定的其他荧光团，例如香豆素、罗丹明、呫吨、花菁以及覆盖其他激发和发射波长的Alexa Fluor染料(例如，AF350、AF405、AF488、AF532、AF546、AF555、AF568、AF594、AF680、AF750)。

[0050] 不发射荧光的能量受体称为淬灭部分。WO05/059037中所述的HMCV染料是适用于本发明的能量受体部分。这些染料是稳定的碳正离子。在典型实施方案中，六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)用作淬灭剂/受体染料。另选地，QSY 21可用作能量受体部分且AF594作为能量供体部分。

[0051] 生成光信号的结合测定通常应可逆，使得可实现分析物的波动水平的连续监测。该可逆性是使用不消耗该测定的组分的结合测定格式的一个特定优点。通常，传感器适用于检测或测量体液(例如皮下积液)中的葡萄糖。期望传感器适合在体内使用。通常，该测定能够针对在0至35mM葡萄糖范围的至少一部分内、通常在2至10mM葡萄糖范围内的浓度来测量血液葡萄糖。合适的检测技术包括FRET荧光能量转移、荧光偏振、荧光淬灭、磷光、发光增强、发光淬灭、衍射或等离子体共振。通常，本发明的传感器结合了使用FRET技术来生成光学读出的测定。

[0052] 如上所讨论，本领域需要光学或基于荧光的测定，该测定具有增强的稳定性并且需要光学传感器的更低校准频率。在本发明的一个方面，提供了具有显著改善的稳定性和溶解度的分析物感测组合物。分析物感测组合物包含用荧光团和淬灭剂染料两者标记的分析物类似物。在典型实施方案中，分析物感测组合物是葡萄糖感测组合物，其包含用荧光团(例如，Alexa 647、Alexa 700)和淬灭剂染料(例如，六甲氧基结晶紫-1，HMCV1)两者标记的多重标记的葡萄糖类似物(例如，葡聚糖)。

[0053] 在本发明的另一个方面，提供了基于分析物感测组合物的竞争性分析物结合亲和测定。竞争性分析物结合亲和测定包括用测定荧光团标记的分析物受体以及用基准荧光团和淬灭剂染料两者标记的分析物类似物。在某些情况下，基准荧光团相对于测定荧光团或指示剂荧光团蓝移，这改善了该测定和更具体地基准荧光团的稳定性。在典型实施方案中，竞争性分析物结合亲和测定是竞争性葡萄糖结合亲和测定，其包括用测定荧光团(Alexa647，AF647)标记的葡萄糖受体/凝集素(例如，甘露聚糖结合凝集素，MBL)以及用基准荧光团(例如，Alexa 594，AF594)和淬灭剂染料(例如，HMCV1)两者标记的多重标记的葡萄糖类似物(例如，葡聚糖)。

[0054] 在本发明的实施方案中，MBL和葡萄糖样分子(例如，葡聚糖)之间的结合是可逆的。当不存在葡萄糖时，将主要是MBL和葡聚糖结合在一起。当将葡萄糖添加到该测定时，葡萄糖将竞争掉葡聚糖群体的一部分，使得该测定进入新的平衡态。平衡态始终对应于葡萄糖浓度。为了确定该平衡态，用荧光团(例如，AF647、AF700)标记MBL，并且用淬灭剂染料(例如，HMCV1)和基准荧光团(例如，AF594)对葡聚糖进行多重标记。供体测定荧光团和受体淬灭剂染料一起形成荧光共振能量转移(FRET)对，即，测定荧光团的发射光谱和淬灭剂染料的吸收光谱重叠。应当注意，荧光团和染料通常是水溶性的，因为它们须在水性环境中发挥功能。

[0055] 多重标记的分析物类似物

[0056] 本发明的实施方案包括葡萄糖测定复合物，其包含作为葡萄糖类似物的葡聚糖。葡聚糖是由至多1500个葡萄糖单元构成的柔性大分子。在某些典型情况下，葡聚糖由大约
600个葡萄糖单元(约100kDa)构成。葡聚糖可用作基于甘露聚糖结合凝集素(MBL)的葡萄糖响应竞争性光学测定中的可替换的分析物类似物/配体。为了在荧光共振能量转移(FRET)测定中发挥功能，通常使用亲脂性(和阳离子型)染料诸如六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)来(重度地)标记葡聚糖。葡聚糖的柔性聚-(1,6)-葡萄糖主链上存在大量(大于10个)亲脂性染料可使HMCV1标记的葡聚糖折叠成水溶性更小的构象，从而产生沉淀。染料诱导的构象变化使HMCV1标记的葡聚糖转变成更为亲脂性的状态，这会造成各种问题，包括葡聚糖对葡萄糖受体的结合能力的不利变化以及影响其荧光共振能量转移(FRET)效率。由于染料在葡聚糖上发生分子内屏蔽，还会发生内滤效应，这引起该测定的校准改变，即，在该过程中，该测定表现不稳定。

[0057] 在本发明的一个方面，使用典型淬灭剂(例如，HMCV1)与具有更为亲水的特性的染料或其他组分一起对葡聚糖进行复合取代，从而实现更好的亲水-疏水平衡，其中葡萄糖配体/类似物随时间推移发生更少构象变化。该复合取代还可包括带正电荷和带负电荷的取代物，这些取代物防止葡聚糖变为完全负或正的。示例性实验已证实，这些因素允许光学传感器的明显更稳定的测定。

[0058] 在一个实施方案中，如图1A所示，淬灭剂从染料变为荧光团并且省略基准荧光团。这通过改善配体的溶解度而改善了该测定的稳定性。这还降低了该测定的复杂性，因为AF647标记的葡聚糖同时充当受体和基准两者。另外，这通过激发基准荧光团而改善了该测定的光稳定性。在这个背景下，基准荧光团朝向激发源蓝移将防止荧光团激发达到第二激发态，这一现象可引起染料降解。通过使染料朝向光源激发波长移动，我们可获得更少的光漂白(UV光对可见染料漂白的程度强于可见光)。可用于本发明的实施方案的蓝移基准染料(取决于例如激发滤光镜和光源的波长宽度)包括Alexa Fluor(AF)546、AF555、AF568、AF594以及Cy3、Cy3B和Cy3.5。这些是与AF647供体和HMCV1受体FRET系统相容的蓝移基准染料。

[0059] 多种其他试剂可偶联到葡聚糖以改善其构象和/或亲水-疏水平衡，通常增强亲水性。示例性试剂包括环酐(例如，邻苯二甲酸酐)、酒石酸酐衍生物(例如，O,O-二乙酰基-L-酒石酸酐)以及下表1中所示的试剂：

[0060]

[0061] 在另一个实施方案中，如图2A所示，基准荧光团被标记/偶联到与染料淬灭剂相同的配体上，从而消除了对基准载体的需求。这通过改善配体的溶解度而改善了该测定的稳定性。这已表现出比发荧光配体甚至更好的稳定性。这还降低了该测定的复杂性，因为AF647标记的葡聚糖同时充当受体和基准。另外，这通过激发该基准(“其在此吸收更多”)而改善了该测定的光稳定性。这还实现了进一步的剂量响应优化。

[0062] 已发现，当使用仅用荧光团(例如，AF647-100Dex(d))标记的配体时，增加该测定中的(AF647-100Dex(d))浓度会产生更高的基准(REF)信号(REF饱和的风险)和向测定(ASY)通道中的更大溢波，从而降低传感器剂量响应(DR)。由于上述问题，纯AF647配体的(dex)浓度和标记度(DOL)是有限度的。高DOL HMCV1-dex具有溶解度问题，并且AF647-dex似乎更溶于Tris或水。将HCMV1添加到AF647配体降低了REF信号和溢波而未降低淬灭能力。将AF647添加到HMCV1配体增加了溶解度。因此，本发明的具体实施方案提供了将AF647添加到HMCV1-葡聚糖，从而形成溶解度改善的AF647-HMCV1-Dex配体，进而改善测定稳定性。
AF647可用AF700替换。可使组合配体以及仅HMCV1-Dex配体略微琥珀酰化以进一步改善测定稳定性。

[0063] 在本发明的另一个方面，提供了用于制备多重标记的/组合葡萄糖类似物/配体的方法。在典型的实施方案中，组合配体是携带淬灭剂染料和荧光团两者(例如HMCV1和AF647两者)的葡聚糖。这两种染料同时对葡聚糖染色。在一种情况下，将10X的HMCV1-SE和10X的AF647-SE添加到100Dex(d)。之后通常是纯化、透析或通过小凝胶渗透色谱(GPC)柱。

[0064] 通过紫外可见光谱来确定多重标记的葡聚糖(MLD)上的单独染料的标记度(DOL)。改变这两种染料的DOL以获得最佳契合点。从葡聚糖上的这两种染料产生的光谱是单独染料的光谱和与相应染料浓度(Dyex)的线性组合。通过在三个记录的光谱中求解下列方程的所有λ来确定染料浓度(使用HMCV1和AF647作为示例)。

[0065]

[0066]

[0067] εHMCV1(λmax)＝42000M-1cm-1

[0068] εAF647(λmax)＝270000M-1cm-1

[0069] 作为传感器的性能评估，传感器剂量响应(DR)使用下列方程来计算：

[0070]

[0071] 其中I400和I40是400mg/dL和40mg/dL葡萄糖下的归一化强度。传感器剂量响应的损失(DR损失)使用下列方程来计算：

[0072]

[0073] 或由DR对时间的线性回归(Excel函数斜率)：

[0074]

[0075] 相对DR损失用作评估传感器质量的关键参数。历史上，该项是DR损失，因此DR中的负发展结果是正损失，从而是“斜率”公式中的(-1)乘法。评估了基线漂移，但基线漂移的漂移程度小得多。在示例性实验中，如图13至图17所示，单一标记的葡聚糖表现出每天3％至6％之间的相对DR损失，而多重标记的葡聚糖令人惊讶地仅在0.5％和2.5％之间漂移。

[0076] 蓝移基准染料

[0077] 本发明的实施方案包括一组不同的荧光染料(例如，基准荧光团和测定荧光团)，这些荧光染料因其波长特征而被选择为一起使用。需要(强度)荧光测定中的基准染料以便跟踪实验设置的变化，例如光源波动、光路变化(使光耦合到光导中、机械扰动(如弯曲)、温度变化等)。传统上，光学或基于荧光的感测系统已选择相对于测定荧光团红移的基准荧光团。当使用具有比所需更多的能量的更低波长的光来激发荧光团时，荧光分子中发生从电子基态(S0)到第二激发态(S2)而非到第一激发电子态(S1)的电子跃迁的风险会增加。处于S2的分子发生分解的可能性比处于S1的相同分子大得多，因此激发到S2时获得光漂白的速度比仅S1被占用时更快。由于基准染料必须非常稳定，因此使用相对于测定荧光团红移的基准荧光团可为次优选择。

[0078] 作为可因低波长激发而表现出对光不稳定的惯常红移基准荧光团的替代，本发明的某些实施方案转而使用相对于测定荧光团或指示剂荧光团蓝移的基准荧光团。换句话讲，基准荧光团具有比测定荧光团更短的波长/增加的频率。在可见光中，基准荧光团更接近光谱的蓝色端，而测定荧光团更接近红色端。这改善了基准荧光团的稳定性，该稳定性是提供准确测定测量的关键特性。在一个或多个实施方案中，竞争性葡萄糖结合亲和测定包括用测定荧光团(Alexa 647)标记的葡萄糖受体/凝集素(例如，甘露聚糖结合凝集素)以及用基准荧光团(例如，Alexa 594)和淬灭剂染料(例如，六甲氧基结晶紫-1)两者标记的多重标记的葡萄糖类似物(例如，葡聚糖)，其中基准荧光团相对于测定荧光团蓝移。

[0079] 如本领域所知，采用此类系统时，光谱和可用光源决定荧光团的选择和光学设置的设计。存在多种可与本发明的实施方案一起使用的半导体光源(LED)，诸如可见于MIGHTEX SYSTEMS LED波长组合中的那些。另外，在本发明的实施方案中，可对连续光源(具有激光特性的白光源)进行滤光以选择激发的特定波长范围，从而提供任意波长(范围)[0080] 通常，对于红移基准而言，原则上可增加该基准的浓度以降低测定荧光团“红”尾溢波的效应，并且必须分开大约50nm以避免基准荧光团“蓝”尾溢波到测定荧光团并因此降低剂量响应。对于蓝移基准而言，荧光团通常必须蓝移大约50nm以避免基准测定“蓝”尾溢波到基准荧光团并因此使该基准对测定荧光团荧光水平不敏感。在这种情况下，可减小基准荧光团浓度以便避免因基准“红”尾溢波到测定荧光团发射中而使剂量响应降低。对于大多数荧光团对而言，通常难以将荧光团分开超过100nm且仍能够使大多数红移荧光团与蓝移荧光团同时激发。规避这一问题的一种方式是使用两种不同光源来激发，但这增加了光学系统的复杂性，因为需要监测这些光源的输出以补偿输出的变化。

[0081] 命名

[0082] 如本文和附图中所述，不同葡聚糖缀合物具有以下通用命名：

[0083] Dye1-Dye2-XXXDex(Y)succ(a/b/Xc)

[0084] 如本文和附图中所述，不同MBL缀合物具有以下通用命名：

[0085] Dye1-zMBL(a)

[0086] Dye1和Dye2是染料名称的缩写；

[0087] XXX是葡聚糖的以kDa计的Mw；

[0088] Y是氨基-葡聚糖的离子交换色谱(IEX)级分；

[0089] Z是代表重组MBL的“r”、代表血浆MBL的“p”、代表超高纯MBL的“UHP”；

[0090] succ表示葡聚糖用摩尔过量“c”的琥珀酸酐处理的情况。如果未指明succ，则葡聚糖仅用一种或多种染料染色；并且

[0091] (a/b/Xc)表示染料的标记度(DOL)和所使用的过量琥珀酸酐。“a”是Dye1的DOL，“b”是Dye2的DOL，并且“Xc”是所使用的摩尔过量的琥珀酸酐。DOL被定义为单位葡聚糖的染料数，即无量纲数。

[0092] 示例性示例如下：

[0093] HMCV1-AF647-100Dex(d)(5.2/3.9)

[0094] 该缀合物是100kDa葡聚糖IEX peak-d，其用HMCV1和AF647标记并且分别具有5.2和3.9的DOL。

[0095] HMCV1-100Dex(c)succ(12.1/X10)

[0096] 该缀合物是100kDa葡聚糖IEX peak-c，其用HMCV1和琥珀酸酐标记，具有12.1的DOL，并且使用10倍摩尔过量的琥珀酸酐来改性。

[0097] AF647-rMBL(0.51)

[0098] 该缀合物是重组MBL，其用AF647标记并且具有0.51的DOL。

[0099] 测定根据相同命名来描述为MBL和ref-缀合物(在需要时)并且单独缀合物的浓度列于方括号中(PP；DD；RR)，其中PP是以μM计的MBL(rMBL)浓度，DD是以μM计的配体葡聚糖浓度(Dex)，并且RR是以μM计的基准葡聚糖浓度。

[0100] 在以下实施例中公开了本发明的其他方面和实施方案。

[0101] 实施例

[0102] 实施例1：所生成的示例性多重标记的葡聚糖

[0103] HMCV1-AF647-葡聚糖

[0104] 携带HMCV1淬灭剂染料和AF647荧光团两者的葡聚糖。HMCV1和AF647两者充当葡萄糖感测测定中的AF594供体的淬灭剂。AF647还充当该系统中的基准。因光源的直接激发而发射的荧光比该系统中的FRET引起的葡萄糖依赖性荧光来源大得多。

[0105] HMCV1-AF700-葡聚糖

[0106] 携带HMCV1淬灭剂染料和AF700荧光团两者的葡聚糖。HMCV1充当葡萄糖感测测定中的AF594供体的淬灭剂。AF700充当该系统中的基准。

[0107] HMCV1-HMCV3-葡聚糖

[0108] 携带HMCV1淬灭剂染料和HMCV3淬灭剂染料两者的葡聚糖。HMCV3是HMCV1(带正电荷)的带负电荷形式。HMCV1和HMCV3两者充当葡萄糖感测测定中的AF594供体的淬灭剂。该系统中需要基准，例如，重琥珀酰化AF700-葡聚糖。

[0109] 琥珀酰化HMCV1-葡聚糖

[0110] 携带HMCV1淬灭剂染料且进一步用低过量琥珀酸酐处理的葡聚糖。HMCV1充当葡萄糖感测测定中的AF594供体的淬灭剂。低琥珀酰化程度防止葡聚糖快速获得亲脂性结构。该系统中需要基准，例如，重琥珀酰化AF700-葡聚糖。

[0111] 实施例2：采用蓝移基准荧光团的实验

[0112] 在葡萄糖响应测定中，该测定传统上由两种或三种缀合物建立。使用红移基准的选项1(三种配体)：AF594-rMBL、HMCV1-100Dex(d)、AF700-100Dex(a)succ；非结合Dex(a)succ上的AF700充当基准。使用红移基准的选项2(两种配体)：AF594-rMBL、HMCV1-AF647-100Dex(d)；结合Dex(d)上的AF647将充当基准，因为直接激发所产生的荧光比源自FRET的荧光强得多。将该系统改变为蓝移基准将成为：AF647-rMBL和HMCV1-AF594-100Dex(d)，从而使得稳定性更好且光学传感器的校准频率更低。

[0113] 已建立了该测定，但遗憾的是HMCV1-AF594-100Dex(d)(6.0/6.3)的AF594-DOL太大了(SITS6017)。这导致测试期间REF和ASY通道两者的完全饱和。制定了新测定，但未进行测试(位点关闭)。选项1：AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-100Dex(d)succ(17.1/X5)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)；(10:40:1)和(10:40:0.5)。选项2：AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-70Dex(d)succ(13.8/X5)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)(10:40:1)和(10:80:1)。选项3：AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-HMCV3-100Dex(d)succ(14.2)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)(10:40:1)和(10:40:0.1)；AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-HMCV3-100Dex(d)succ(18.6)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)(10:40:1)和(10:40:0.1)。

[0114] 结论

[0115] 对本发明的典型实施方案的描述到此结束。已经出于说明和描述的目的呈现了本发明的一个或多个实施方案的前述描述。其并非旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。鉴于上述教导内容，许多修改和变型是可能的。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种焦耳级三波长可调谐单频脉冲激光器	2020-05-08	298
一种超快激光产生装置	2020-05-08	299
细胞特异性光敏效应的实时筛查与测量系统及方法	2020-05-08	959
多功能水质分析仪表及其分析方法	2020-05-08	433
具有LED测试点的LED晶圆及转移方法	2020-05-08	238
一种饭煲	2020-05-11	448
一种波长调制情况下的二极管激光器动态波长测量装置及方法	2020-05-11	684
腔内泵浦中红外脉冲激光器	2020-05-08	281
一种紫外可见分光光度计	2020-05-08	235
一种同时测量光纤环偏振耦合分布和绕环光纤拍长的方法	2020-05-11	423

在光学葡萄糖测定中使用蓝移基准染料

在光学葡萄糖测定中使用蓝移基准染料

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：