专利汇可以提供呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 呼吸道 常见病原体多重RT‑PCR联合 基因芯片 检测 试剂 盒 ,该试剂盒使用多重特异性保守简并引物组合和探针组合检测22种呼吸道常见病原体中的一种或多种,同时设有内源对照以及阳性对照和阴性对照。本发明所涉及的检测试剂盒提高了对高突变病原体目标序列的 覆盖 率,避免了多重引物和探针之间非特异性交叉反应的问题,可实现单个反应体系同时检测多达20种以上的呼吸道常见病原体,为呼吸道常见病原体检测提供一种简单灵敏,快速通量大,可多指标并行检测的检测工具。,下面是呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒,该试剂盒用于同时检测以下病原体:流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人类偏肺病毒、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU-1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌和肺炎链球菌;
试剂盒内设有呼吸道病原体的引物组合和探针组合,同时设有人GAPDH基因內源对照以及阳性对照和阴性对照;
其特征在于引物组合为由如下多重特异性保守简并引物组成,其中简并位点的核苷酸表示为R=A/G,Y=C/T,M=A/C,K=G/T,S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T,各对引物的碱基序列5’-3’如下:
流感病毒A型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GCTTTYACNGADGARGGAGCAA,
反向引物:Cy5-5’-AYSYCAAYTGCATTTTTGACATCCT;
流感病毒B型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GCCAATTCGAGCAGCTGAAACTG,
反向引物:Cy5-5’-TCCGTRACYAGTCTAATTGTCTCYCTC;
副流感病毒1型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:TCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGYAGAT,
反向引物:Cy5-5’-AGAAAYTRCCGGKTTTARATCAGGATACAT;
副流感病毒2型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:ACAATGTAATRCTTGGAGATTGYCTYGAT,
反向引物:Cy5-5’-GCTTTTSCGATTGATTCCATCACTTAGG;
副流感病毒3型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:TGGCATAATGTGYTATCAAGACCAGG,
反向引物:Cy5-5’-TCYARTATRACAGATGAYACAATGCTYCCT;
副流感病毒4型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:WGCTCTTAGRATCATTGAAGTTGATGCA,
反向引物:Cy5-5’-GCWARGCTRATAGGCAAATCYCTGG;
人类偏肺病毒,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:YGARGTMAATGCRACTGTRGCA,
反向引物:Cy5-5’-GCYGARCTYACAAAYTTTGAYACCA;
鼻病毒A型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GCCGGAGGABTCAARGYGAG,
反向引物:Cy5-5’-TAGACCTGGCAGATGAGGCT;
鼻病毒B型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:CYCCACTAGTYTGGTCGATGAGGCT,
反向引物:Cy5-5’-NTCACAAYCAAGCACATGCRRGTCTT;
鼻病毒C型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:CACYGGYGACRGTGRYGTAGC,
反向引物:Cy5-5’-CCATCCCRYAATTRCTCRTTACGAC;
博卡病毒,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:ACTGCTACTGAGATTGCAGCTC,
反向引物:Cy5-5’-GCAGTATCCGTTTTCGTGAAGTGTA;
腺病毒,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:AGACACCTACTTCAGTMTKGGGAA,
反向引物:Cy5-5’-GGCACRAAGCGCAGCRTCAG;
冠状病毒229E,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:AACGTTTCAGAACTAGAAAGGGCA,
反向引物:Cy5-5’-TGTAGGYTCAGTTTTAGCACCATCAA;
冠状病毒HKU-1,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:CCTGGTACGATTYTGCCTCAAGG,
反向引物:Cy5-5’-ACGAKTATTGGGTCCACGTGAT;
冠状病毒NL63,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GCCAAAGGTTTTCCACAGYTTGC,
反向引物:Cy5-5’-CTGCTCAATGAACTTAGGAAGGTTCTT;
冠状病毒OC43,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:CATTGTCGATCGGGACCCAA,
反向引物:Cy5-5’-TRCTGGATGTGCGCGAAGTA;
呼吸道合胞病毒A型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GCAAATAYACCATCCAACGGAGC,
反向引物:Cy5-5’-YCCAGTGAATTTRTGATTRGCATCTTCTG;
呼吸道合胞病毒B型,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GGGCAAATACAAARATGGCTCTTAGC,
反向引物:Cy5-5’-TGYTTTTGYACATCATAATTGGGAGTGTC;
肺炎支原体,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GGCCCATACTCCTACGGGAG,
反向引物:Cy5-5’-GCGACTGCTGGCACATAGTT;
肺炎衣原体,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:TGTAAAGCACTTTCGCCTGGGAA,
反向引物:Cy5-5’-CACCCTCCGTATTACCGCAGCT;
嗜肺军团杆菌,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGA,
反向引物:Cy5-5’-CTTTCATTTGYTGYTCGGTTAAAGCCA;
肺炎链球菌,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:GCTGGAAGAAAATCGCTGABAAGTG,
反向引物:Cy5-5’-GGTTTGAGGTAGTACCARCCTGTT;
內源对照GAPDH基因,反向引物5’端带Cy5标志:
正向引物:ATCTTCCAGGAGCGAGATCC,
反向引物:Cy5-5’-AGGGGGCAGAGATGATGAC;
并且,所述探针组合为顺序固定于基因芯片表面的如下所示核酸探针,包括呼吸道病原体特异性保守简并探针、GAPDH內源对照探针,阳性杂交点探针和阴性杂交点探针,其中简并位点的核苷酸表示为R=A/G,Y=C/T,M=A/C,K=G/T,S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T,各探针的5’端做氨基标志,各条探针的碱基序列
5’-3’如下:
流感病毒A型探针:
NH2-5’-GADGARGGAGCAATHGTDGGMGAAATYTCACCATTRCCTTCTYTTCCAGGACATACTDD;
流感病毒B型探针:
NH2-5’-CTGAAACTGCGRTGGGAGTCYTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAA;
副流感病毒1型探针:
NH2-5’-YAGATATAGGGAAGTCRTAYCAGGTTTTACAATTAGGTTAYATATCYTTAAATTCAGAT;
副流感病毒2型探针:
NH2-5’-CRRCATCTRAYCAGTATTTAKCAATGGGGATAATACAACAATCTGCTGCRGVRTTTCCA;
副流感病毒3型探针:
NH2-5’-CAAYGAATGTCCATGGGGACAYTCATGYCCRGATGGRTGYATAACRGGAGTRTATACHG;
副流感病毒4型探针:
NH2-5’-CCRCMRGATTATACATTAACYATTAAYCCAAGRTCTGGCTGGGATGAYATCAAGATCAG;
人类偏肺病毒探针:
NH2-5’-TYGAYGARTAYAGYAAAYTDGAHTTTGAYAARYTNACRGTYTGYGADGTWAAAACAGTT;
鼻病毒A型探针:
NH2-5’-DRRRGTGYGCAGGCAGCCACGCAGGCTRGAACACTGTYRCCAGTGGGGDDYTTCYAGCC;
鼻病毒B型探针:
NH2-5’-YYAGCCTGCGTGGCGGCCARCCCAGCDYHTGCTGGGACGCCHWTTYAHDGACATGGTGY;
鼻病毒C型探针:
NH2-5’-AAGRCHBKMRTGYGCTAVNHRTGABTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCYTAAMCC;
博卡病毒探针:
NH2-5’-ACRACTGTACTCTGACAGGATTTAAACAAAAATGGAATTTAGATAAAATTCCAAACYCA;
腺病毒探针:
NH2-5’-AARTTTAGRAACCCCACRGTGGCGCCYACCCACGATGTGACCACCGAYCGYAGCCAGCG;
冠状病毒229E探针:
NH2-5’-GRGTGGATTTGYCACCCAAGYTRYATTTTTATTATCTTGGCACAGGACCYCATAAAGMT;
冠状病毒HKU-1探针:
NH2-5’-CTATTATGTTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTTCTAATAGYCGRCCAGGTTCACGTTCTC;
冠状病毒NL63探针:
NH2-5’-ARTTGATTCCYAATCAGGCTGCDTTATTCTTTGATAGTGAGGTTAGCACTGAWGAAGTG;
冠状病毒OC43探针:
NH2-5’-TAGYGATGAGGCTATTYCGACTAGGTTTCCGCCTGGYACGGTACTCCCTCAGGGTTACT;
呼吸道合胞病毒A型探针:
NH2-5’-AYACTCCTAAYTAYGATGTRCAGAAACACATYAAYAAKYTATGTGGCATGTTATTAATC;
呼吸道合胞病毒B型探针:
NH2-5’-AGGATCAGCTGCTGTCATYCAGCAAATAYRCYATTCAACGTAGYACAGGAGATAATATT;
肺炎支原体探针:
NH2-5’-GCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAAC;
肺炎衣原体探针:
NH2-5’-TAATATCCAATYGATTTGAGCGTACCRGGTAAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGC;
嗜肺军团杆菌探针:
NH2-5’-TTGGGRAAGAAYTTTAARAATCAAGGCATWGATGTTARYCCGGAAGCAWTGGCTAAAGG;
肺炎链球菌探针:
NH2-5’-TACTATTTYRAYGWAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACHTG;
內源对照GAPDH基因探针:
NH2-5’-TCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTT;
阳性杂交点探针:
NH2-5’-CCCTCGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG;
阴性杂交点探针:
NH2-5’-GATCGTCGTTGGGCTTTAGATTTCTCTTATAGGCTCGGTCGGCGCCTCTCGCCCCGAGC。
2.根据权利要求1所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒,其特征在于该试剂盒包含引物组合、探针组合和基因芯片,基因芯片为表面固定有探针阵列的固相支持介质,探针阵列为权利要求1所述的呼吸道病原体特异性保守简并探针、GAPDH內源对照探针,阳性杂交点探针和阴性杂交点探针。
3.根据权利要求2所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒,其特征在于所述固相支持介质为玻璃片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求1或2所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒,其特征在于该试剂盒包含引物组合、探针组合、基因芯片、辅料,其中,所述辅料为一步法逆转录扩增试剂、超纯水和5’端带Cy5标志的阳性寡核苷酸单链DNA,5’端带Cy5标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基序列为Cy5-5'-CCATCTCCGCAGCAACATAACTCGCAACGTGTGGTGACAATCGCGCATTAACCCGAGGG-3’。
5.根据权利要求4所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含引物组合、基因芯片、辅料和配液,其中,所述配液为芯片点样液、芯片清洗液、杂交液、清洗液I和清洗液II。
6.根据权利要求5所述的呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒,其特征在于所述芯片点样液为50%DMSO;芯片清洗液为5xSSC,0.2%SDS;杂交液为5xSSC,
0.1%SDS;清洗液I为0.5xSSC,0.1%SDS;清洗液II为0.05xSSC。
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