一种红花注射液、制备方法及含量测定方法
阅读：720发布：2023-12-28
专利汇可以提供一种红花注射液、制备方法及含量测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种红花注射液其中对羟基苯 甲酸 含量低于100μg/ml，还公开了制备方法及含量测定方法，该发明通过制备方法和含量测定方法控制对羟基 苯甲酸 的含量，减少成品的不良反应及 副作用 。，下面是一种红花注射液、制备方法及含量测定方法专利的具体信息内容。
1.一种红花注射液，其特征在于，红花注射液中所含对羟基苯甲酸含量低于40
μg/m1，是通过下述方法制备得到的：
步骤（1），取红花药材，用温水煎煮2-5次，合并煎煮液，冷藏过夜，用滤膜滤过，滤液浓缩加70%-95%乙醇醇沉，使含醇量为60-80%，滤过，回收乙醇得浸膏；
步骤（2），所述的浸膏加水，冷藏，静置，滤过，用阳离子交换树脂除钾得洗脱液；
步骤（3），所述的洗脱液2次活性炭吸附调pH，第一次用0.1-0.5%活性炭，常温搅拌，将炭滤过，用10-30%碱水溶液调pH值7.5-8.0，热处理，冷藏；第二次加入活性炭0.1-0.5%，搅匀，过滤，用超滤膜超滤，用10-30%碱水溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水，滤过，充氮灌封，灭菌，即得。
2.如权利要求1所述的一种红花注射液，其特征在于，红花注射液中所含对羟基苯甲酸含量低于10μg/m1。
3.如权利要求1所述的红花注射液，其特征在于，所述步骤（1）中80-90℃水热浸三次，每次30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，用微孔滤膜滤过，滤液浓缩至50-60℃相对密度为
1.1-1.3，加90%-95%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3。
4.如权利要求3所述的红花注射液，其特征在于，所述的微孔滤膜过滤一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤。
5.如权利要求1所述的红花注射液，其特征在于，步骤（2）中为浸膏加8-12倍量水，冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，得洗脱液。
6.如权利要求1所述的红花注射液，其特征在于，步骤（3）为，所述的洗脱液加入0.1-
0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用20%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-
100min，冷藏24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-
10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
7.一种红花注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取红花药材，加纯化水80-90℃热浸三次，第一次30-60min，第二次30-60min，第三次
30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，滤过，一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤，滤液浓缩至50-60℃相对密度为1.1-1.3，加90%-95%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3，加10倍量水，冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，滤液浓缩至50-60℃600-800ml，加入0.1-0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用20%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-100min，冷藏24-
72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
8.如权利要求1所述的红花注射液中对羟基苯甲酸含量测定方法，包括如下步骤：
步骤1、对照品溶液制备：取对羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，用50%甲醇制成每1ml中含30µg的溶液，即得；
步骤2、测定法：分别精密吸取对照品溶液与本品各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得；
所述高效液相色谱条件如下：
色谱柱： C18色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，流动相：甲醇-0.02～0.05%酸水溶液5:
90～100；检测波长为254nm；柱温为20～30℃；流速为1.0～2.0ml/min。
9.如权利要求8所述的含量测定方法，其特征在于：步骤2中所述高效液相色谱条件为，流动相：甲醇-0.02%三氟乙酸水溶液5:95；柱温为25℃；流速为1.5ml/min。
一种红花注射液、制备方法及含量测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种红花注射液及其制备方法和测定方法。
背景技术
[0002] 红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥管状花，是红花属唯一的栽培种。红花注射液是由中药红花经提取而成的黄色至棕红色的灭菌水溶液，具有活血化瘀、消肿止痛之功效，临床上主要用于治疗各种血瘀引起的闭塞性脑血管病、冠心病、脉管炎等疾病。随着临床上的广泛应用，其不良反应报道也日趋增多，有些不良反应还较为严重，所以完善和提高红花注射液的质量标准十分重要。
[0003] 对羟基苯甲酸为红花药材中一天然化学成分，该成分分子量小，结构简单，是一些次生代谢产物的合成底物。红花药材中含有一些对羟基苯甲酸残基基团的化学成分，例如：对羟基苯甲酰香豆酸酐、对羟基桂皮酸、其它多酚类物质等。红花注射液生产过程中，先后会经历多次加热，这些加热过程会造成部分对热不稳定的成分分解，同时对羟基苯甲酸从这些化学成分（酚类物质）中降解出来。
[0004] 对羟基苯甲酸，又称尼泊金酸，用于有机合成和制造染料, 作防腐剂、杀菌剂，有毒，有刺激性。分子式为C7H6O3，分子量 138.13，密度1.443g/cm3，熔点 213-214℃，沸点 199 oC。结构式如下所示：
[0005]
[0006] 因此，现有技术中的红花注射剂中都含有对羟基苯甲酸，含量没有得到控制，其药品安全性无法保证。再有现有技术中尚未报道红花注射液中对羟基苯甲酸的含量方法。
发明内容
[0007] 本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种红花注射液，该红花注射液中含有极其少量的对羟基苯甲酸，不良反应减少。
[0008] 本发明另一目的在于提供了所述红花注射液的制备方法。
[0009] 本发明又一目的在于提供了所述红花注射液中对羟基苯甲酸的测定方法。
[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0011] 本发明一种红花注射液，所含对羟基苯甲酸含量低于100μg/ml。
[0012] 优选红花注射液中所含有对羟基苯甲酸含量低于40μg/m1。
[0013] 优选红花注射液中所含有对羟基苯甲酸含量低于10μg/m1。
[0014] 上述所述的红花注射液，是通过下述制备方法获得的：
[0015] （1）取红花药材，水煎煮，煎煮液滤过，滤液浓缩后乙醇醇沉，滤过，回收乙醇得浸膏；
[0016] （2）所述浸膏水沉，滤过，滤液过树脂柱得洗脱液；
[0018] 优选步骤（1）中所述的红花药材，用热水煎煮2-5次，合并煎煮液，冷藏过夜，用滤膜滤过，滤液浓缩加70%-95%乙醇醇沉，使含醇量为60-80%。最佳为用80-90℃水热浸三次，每次30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，用微孔滤膜滤过，（优选一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤）滤液浓缩至50-60℃相对密度为1.1-1.3，加90%-95%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3。
[0019] 上述步骤（1）药材提取采用80-90℃热浸，在保证提取出有效成分的同时，最可能少的提取出对羟基苯甲酸。煎煮液冷藏过夜，过滤采用微滤。降低煎煮液中杂质含量，使浓缩液体积降低，有利于除去水溶性不好的多酚类物质（多酚类物质在后期受热，很可能有部分降解为对羟基苯甲酸）；
[0020] 上述步骤（2）中所述树脂柱为离子交换树脂，包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，优选为阳离子交换树脂。
[0021] 进一步优选步骤（2）为浸膏加8-12倍量水（优选10倍量），冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，得洗脱液。
[0022] 最佳为上述洗脱液进一步浓缩至600-800ml（50-60℃）得浓缩液。
[0023] 本发明步骤（3）优选洗脱液或浓缩液用活性炭吸附2次，第一次用0.1-0.5%活性炭，常温搅拌，将炭滤过，用10-30%碱水溶液调pH值7.5-8.0，热处理，冷藏；第二次加入活性炭0.1-0.5%，搅匀，过滤，用超滤膜超滤，用10-30%碱水溶液调pH值7.5-8.0。
[0025] 最佳步骤（3）为，所述洗脱液或浓缩液加入0.1-0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用20%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-100min，冷藏24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
[0026] 上述步骤（3）中，工艺中采用两次活性炭吸附：第一次吸附的目的——吸附前期浓缩过程中产生的对羟基苯甲酸；第二次吸附的目的——吸附热处理产生的对羟基苯甲酸。
[0027] 最佳本发明的红花注射液，是通过下述方法制备得到的：
[0028] 取红花药材500g，加纯化水80-90℃热浸三次，第一次30-60min，第二次30-60min，第三次30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，滤过，一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤，滤液浓缩至50-60℃相对密度为1.1-1.3，加90%-95%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3，加10倍量水，冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，滤液浓缩至50-60℃600-800ml，加入0.1-0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用20%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-100min，冷藏
24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
[0029] 本发明还提供上述红花注射液的制备方法，步骤如下：
[0030] （1）取红花药材，水煎煮，煎煮液滤过，滤液浓缩后乙醇醇沉，滤过，回收乙醇得浸膏；
[0031] （2）所述浸膏水沉，滤过，滤液过树脂柱得滤液;
[0032] (3)步骤（2）中所述的滤液活性炭吸附调节pH值后，加入注射用水，滤过，充氮灌封，灭菌，即得。
[0033] 优选步骤（1）中所述的红花药材，用热水煎煮2-5次，合并煎煮液，冷藏过夜，用滤膜滤过，滤液浓缩加70%-95乙醇醇沉，使含醇量为60-80%。最佳为用80-90℃水热浸三次，每次30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，用微孔滤膜滤过，（优选一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤）滤液浓缩至50-60℃相对密度为1.1-1.3，加90%-95%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3。
[0034] 上述步骤（2）中所述树脂柱为离子交换树脂，包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，优选为阳离子交换树脂。
[0035] 进一步优选步骤（2）为浸膏加8-12倍量水（优选10倍量），冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，得洗脱液。
[0036] 最佳为上述洗脱液进一步浓缩至600-800ml（50-60℃）得浓缩液。
[0037] 上述步骤（3）中所述的活性炭吸附为2次吸附，优选滤液或浓缩液第一次用0.1-0.5%活性炭，常温搅拌，将炭滤过，用10-30%碱水溶液调pH值7.5-8.0，热处理，冷藏；第二次加入活性炭0.1-0.5%，搅匀，过滤，用超滤膜超滤，用10-30%碱水溶液调pH值7.5-8.0。
[0038] 上述步骤（3）中所述的碱水溶液包括但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾等，优选为氢氧化钠溶液。
[0039] 进一步优选步骤（3）为，所述的洗脱液或浓缩液加入0.1-0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用20%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-100min，冷藏24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
[0040] 最佳本发明的红花注射液的制备方法包括如下步骤：
[0041] 取红花药材，加纯化水80-90℃热浸三次，第一次30-60min，第二次30-60min，第三次30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，滤过，一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤，滤液浓缩至50-60℃相对密度为1.1-1.3，加90%-95%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3，加10倍量水，冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，滤液浓缩至50-60℃600-800ml，加入0.1-0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用20%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-100min，冷藏24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
[0042] 本发明还提供了上述红花注射液中对羟基苯甲酸含量测定方法，包括如下步骤：
[0043] 步骤1、对照品溶液制备：取对羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，用50%甲醇制成每1ml中含30µg的溶液，即得；
[0044] 步骤2、测定法：分别精密吸取对照品溶液与本品各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；所述高效液相色谱条件如下：
[0045] 色谱柱： C18色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，流动相：甲醇-0.02~0.05%酸水溶液5:90 100；检测波长为254nm；柱温为20 30℃；流速为1.0 2.0ml/min。~ ~ ~
[0046] 上述步骤2中优选所述高效液相色谱条件为：流动相：甲醇-0.02%三氟乙酸水溶液5:95；柱温为25℃；流速为1.5ml/min。
[0048] 有益效果
[0049] 通过下述试验例来阐述本发明的有益效果
[0050] 试验例1.本发明的红花注射液中对羟基苯甲酸含量的半数致死量的测定[0051] 目的 通过小鼠尾静脉注射不同浓度对羟基苯甲酸红花注射液，检测红花注射液中对羟基苯甲酸的半数致死量。
[0052] 方法 将对羟基苯甲酸标准品，用实施例1制备的红花注射液稀释配制成等比浓度梯度的红花注射液对羟基苯甲酸溶液，以所配制的溶液小鼠尾静脉注射0.5ml，观察小鼠的死亡率，并观察7天后小鼠脏器的变化。
[0053] 结果小鼠尾静脉注射对羟基苯甲酸红花注射液溶液，半数致死量为34.6mg/kg，95%可信限范围为31.2-38.6mg/kg。解剖死亡和7天后存活小鼠，观察皮下、心、肝、脾、肺、肾和胃肠道等器官，阴性和阳性小鼠无明显眼观异常变化。
[0054] 结论对羟基苯甲酸具有中等毒性。需要控制红花注射液中对羟基苯甲酸的含量。
[0055] 1材料与方法
[0056] 1.1 药品与试剂
[0057] 红花注射液：按照本发明实施例1的方法制备，黄红色透明液体，20ml/支，批号：Z-130512，四川雅安三九药业有限公司生产；
[0058] 对羟基苯甲酸对照品，纯度98%以上，批号：批号：20110508，上海源叶生物科技。
[0059] 1.2 动物与试验仪器
[0060] 试验动物：昆明种小鼠，体质量17-20g，♂♀各半，由雅安三九药业有限公司质量管理部动物检测中心提供。自由采食和饮水。试验前小鼠饲养7 d , 观察其健康状况, 选择健康、营养状况良好的小鼠进行试验。
[0062] 2 方法
[0063] 2.1 预试实验
[0064] 预试验前对小白鼠进行7 d 的喂养观察，观察期内小白鼠自由采食、饮水，每日空腹称重，淘汰自然死亡小白鼠。预试验期内将小白鼠随机分成4 组，每组8 只，雌雄各半, 各组尾静脉给药，确定正式试验的剂量范围。
[0065] 化合物剂量等比级数1 : 0.5。分别为: 预试1 组、预试2 组、预试3组、预试4 组, 各化合物剂量见表1。
[0066] 2.2 正式试验
[0067] 按Bliss法设计，在含Dm-Dn的剂量（含Dm和Dn）范围内设6个剂量组（N），根据如下公式，计算剂量比值（K）为0.76。
[0068] 取70 只健康小鼠，适应性饲养7d 后，按体质量、性别分层随机法分为7 组, 每组10 只，雌雄各半，各组分别为：给药1组、给药2组、给药3组、给药4组、给药5组、给药6组和阴性对照组，化合物成分剂量等比级数为1 : 0.76。
[0069] 阴性对照组给予等体积的红花注射液。禁食（不禁水）12 h 后, 各组均按25ml/kg 一次性尾静脉注射, 给药后记录动物的即时反应并连续观察7d ，记录动物毒性出现时间及恢复时间、死亡情况(死亡动物及时尸检)，并在第8 天将所有存活小白鼠解剖，观察腹腔内液体状况和实质性器官的病理变化。
[0070] 2.3 病理组织学检查
[0072] 3 结果 见表1和表2：
[0073] 表1 预实验的剂量及小鼠急性病死率
[0074]
[0075] 表2 急性毒性正式试验的给药剂量与小鼠病死率
[0076]
[0077] 4 讨论
[0078] 以上实验结果显示，多数动物给药后即时呈现药理反，以给药剂量不同, 动物异常体征反应时间有所差异。其中34.6mg/ kg 剂量注射后小鼠死亡时表现肌肉颤动呼吸困难而死，未死亡小鼠表现全身肌肉强制性间隙震颤呼吸窘迫，之后趋于正常。给药后第1 天, 所有未死小鼠采食、饮水、自主活动和粪便都恢复正常。连续观察7d , 所有小鼠被毛有光泽, 采食、活动均正常。试验结束时, 给药组和对照组小鼠解剖后肉眼观察皮下、心、肝、脾、肺、肾和胃肠道等器官无明显眼观异常变化。解剖观察死亡小鼠的脑、心、肝、脾、肺和肾脏与对照组相比，均无明显变化。经计算，红花注射液中对羟基苯甲酸尾静脉给药半数致死量（LD50）为34.6mg/kg，95%可信限范围为31.2-38.6mg/kg。
[0079] 试验例2 生产过程中对羟基苯甲酸含量控制方法
[0080] 1、原料的控制：红花药材中对羟基苯甲酸含量标准
[0081] 【含量测定】照高效液相色谱法（中国药典2010版一部 附录VID）测定[0082] 色谱条件与系统适用性试验 固定相采用Grace VisionHT C18 HL 5µm （4.6mm×250mm，5µm）；以甲醇－0.02%三氟乙酸(5:95) 为流动相；流速1.5 ml/min；检测波长254 nm；柱温25℃；以对羟基苯甲酸峰计，理论板数不低于10000。
[0083] 对照品溶液的制备取对羟基苯甲酸适量，以甲醇－0.02%三氟乙酸(5:95)为溶剂，配成含量为20μg/ml浓度的溶液，即得。
[0084] 供试品溶液的制备 精密称取红花粉末2g置于150ml具塞三角瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，称重，超声处理（540W，60kHZ）60min，取出，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
[0085] 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0086] 本品以干燥品计，每克药粉含对羟基苯甲酸（C7H6O3）应不高于40μg。
[0087] 工艺的控制（红花注射剂按照实施例方法制备，含量测定按照试验例3的方法）。
[0088] 药材提取采用80-90℃热浸，在保证提取出有效成分的同时，最可能少的提取出对羟基苯甲酸。见表3
[0089] 表3 不同提取方式下对羟基苯甲酸含量的对比
[0090] （1）
[0091] （2）煎煮液冷藏过夜，过滤采用微滤。降低煎煮液中杂质含量，使浓缩液体积降低，有利于除去水溶性不好的多酚类物质（多酚类物质在后期受热，很可能有部分降解为对羟基苯甲酸）见表4、表5：
[0092] 表4 煎煮液不同的处理方式醇沉液总酚含量的对比
[0093]
[0094] 表5 不同总酚含量的醇沉液热处理液中对羟基苯甲酸含量的对比
[0095] （3）
[0096] （4）工艺中采用两次活性炭吸附：第一次吸附的目的——吸附前期浓缩过程中产生的对羟基苯甲酸；第二次吸附的目的——吸附热处理产生的对羟基苯甲酸，见表6：
[0097] 表6 两次活性炭吸附前后对羟基苯甲酸的含量对比
[0098]
[0099] 综上：
[0100] （1）在投料药材中控制对羟基苯甲酸的含量从源头上控制了该化学成分的含量；
[0101] （2）煎煮采用温浸的方式，对羟基苯甲酸的提取率相对煮沸提取少；
[0102] （3）煎煮液冷藏过滤再浓缩，使醇沉液中的总酚含量降低，大幅切断了对羟基苯甲酸的反应来源；
[0103] （4）采用两次吸附工艺，能把加热所产生的对羟基苯甲酸逐步除去，使对羟基苯甲酸含量降至最低。
[0104] 试验例3 对羟基苯甲酸含量测定方法的筛选
[0105] 以下通过方法学研究和测定条件的筛选，说明本发明的研究过程及其有益效果。
[0106] １仪器与试药
[0107] Agilent 1100高效液相色谱仪；对羟基苯甲酸对照品（上海源叶生物科技，批号：20110508）；红花注射液（按照实施1方法制备）；甲醇为色谱纯；水为注射用水；其他试剂均为分析纯。
[0108] 2实验方法和结果
[0109] 2.1最佳色谱条件的建立
[0110] 本方法采用的色谱柱：Grace VisionHT C18 HL 5µm （4.6mm×250mm，5µm）。
[0111] 2.1.1 检测波长的选择
[0112] 对羟基苯甲酸在254nm处具有最大吸收，故选择254 nm为最佳检测波长。
[0113] 2.1.2 流动相的选择
[0114] 在流速1.0ml/min，温度25℃条件下分别采用三氟乙酸-甲醇、冰醋酸-甲醇、磷酸-甲醇、三氟乙酸-乙腈体系进行试验，试验结果如表7：
[0115] 表7、不同流动相体系实验结果
[0116]流动相 对称因子 塔板数 峰纯度
0.05％三氟乙酸：甲醇（95：5） 0.58 16751 681.897
0.05％冰醋酸酸：甲醇（95：5） 0.46 9846 936.006
0.05％磷酸：甲醇（95：5） 0.44 4300 965.492
0.02％三氟乙酸：甲醇（95：5） 0.76 17574 995.152
0.02％三氟乙酸：甲醇（92：8） 0.53 16572 672.100
0.02％三氟乙酸：乙腈（95：5） 0.69 11672 997.169
0.05％三氟乙酸：甲醇（95：5） 0.58 16751 681.897
0.05％冰醋酸酸：甲醇（95：5） 0.46 9846 936.006
0.05％磷酸：甲醇（95：5） 0.44 4300 965.492
0.02％三氟乙酸：甲醇（95：5） 0.76 17574 995.152
0.02％三氟乙酸：甲醇（92：8） 0.53 16572 672.100
0.02％三氟乙酸：乙腈（95：5） 0.69 11672 997.169
[0117] 由表1可看出，三氟乙酸-甲醇和三氟乙酸-乙腈体系优于其他体系，综合考虑对称因子、塔板数和峰纯度，最佳流动相体系为0.02％三氟乙酸：甲醇（95：5）。
[0118] 2.1.3 柱温的选择
[0119] 柱温改变影响使峰的分离度和峰形，在0.02％三氟乙酸：甲醇（95：5），流速1.0ml/min条件下考察了在柱温为25℃、30℃、35℃时峰的分离度，实验结果表明随着柱温升高，对羟基苯甲酸峰对称性变差且峰纯度降低，故以25℃为最佳分析柱温，试验结果见表8：
[0120] 表8 不同温度的实验结果
[0121]温度 对称因子 峰纯度
25 0.7 994.848
30 0.69 981.796
35 0.64 990.174
25 0.7 994.848
30 0.69 981.796
35 0.64 990.174
[0122] 2.1.4 流速
[0123] 在流动相为0.02％三氟乙酸：甲醇（95：5），温度25℃条件下，对不同流速进行试验，实验结果如表3。可以看出，流速为1.5 ml/min时，峰对称性有轻微降低，但峰纯度提高，且流速增大，样品保留时间减小，缩短了分析时间，故1.5 ml/min为最佳流速，试验结果见表9：
[0124] 表9.不同流速的实验结果
[0125]流速（ml/min） 对称因子 塔板数 峰纯度
1.0 0.76 17574 995.152
1.5 0.74 15210 998.794
1.0 0.76 17574 995.152
1.5 0.74 15210 998.794
[0126] 2.1.5 最佳色谱条件
[0127] 由以上实验确定最佳的色谱条件为：色谱柱，Grace VisionHT C18 HL 5µm （4.6mm×250mm，5µm）；流动相，甲醇－0.02%三氟乙酸(5:95)；流速1.5 ml/min；检测波长254 nm；柱温25℃；进样量10µl。对羟基苯甲酸理论塔板数达14000。
[0128] 2.2 溶液制备
[0129] 2.2.1 对照品溶液的制备
[0130] 精密称取对照品16.09 mg，置100 ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.1609 mg/ml的对羟基苯甲酸对照品贮备液。依据样品含量，取贮备液加50%甲醇稀释至所需浓度，作为对照品溶液；
[0131] 2.2.2供试品溶液的制备
[0132] 取红花注射液，作为供试品溶液；
[0133] 2.3 线性关系考察
[0134] 精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液0.5、1、2、4、6、8、10 ml，分别置10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，按“2.1.5”项下色谱条件进样，记录色谱图，以对照品峰面积为纵坐标Y，对照品溶液的浓度X（µg/ml）为横坐标，进行线性回归，得回归方程：y=39.905x + 11.057。结果表明在8.045-160.9 µg/ml范围内，对照品峰面积与检测浓度呈良好的线性关系（见图1）。试验结果见表10：
[0135] 表10.线性关系考察实验结果
[0136]对照编号 浓度（µg/ml） 峰面积
1 8.045 323.82532
2 16.09 649.59802
3 32.18 1295.66736
4 64.36 2593.79321
5 96.54 3856.67212
6 128.72 5171.43115
7 160.9 6411.82422
1 8.045 323.82532
2 16.09 649.59802
3 32.18 1295.66736
4 64.36 2593.79321
5 96.54 3856.67212
6 128.72 5171.43115
7 160.9 6411.82422
[0137] 2.4 精密度实验
[0138] 取已知浓度的对照品溶液，按“2.1.5”项色谱条件下连续进样6次, 记录色谱图。测得对羟基苯甲酸峰面积的RSD为0.12%，表明仪器精密度良好，试验结果见表11：
[0139] 表11.精密度实验结果
[0140]
[0141] 2.5 重复性实验
[0142] 取同一批次供试品溶液6份，按“2.1.5”项色谱条件下进样，记录色谱图。测得对羟基苯甲酸峰面积的RSD为3.35%，表明该方法重复性良好，试验结果见表12：
[0143] 表12.重复性实验结果
[0144]
[0145] 2.6 稳定性试验
[0146] 取同一份供试品溶液, 在室温下放置, 分别于0, 2, 4,12, 27 h进样分析, 记录色谱图, 计算对羟基苯甲酸峰面积的RSD为0.85%, 表明供试品溶液在27小时内稳定，试验结果见表13：
[0147] 表13.稳定性实验结果
[0148]
[0149] 2.7 加样回收率实验
[0150] 取同一批次已知浓度的供试品溶液6份，分别加入已知浓度的对照品溶液适量，按“2.1.5”项色谱条件下进样分析，计算回收率，试验结果见表14：
[0151] 表14.加样回收实验结果
[0152]
[0153] 3 质量标准建立
[0154] 分别取不同批号的红花注射液, 按照 “2.1.5”项色谱条件下进样, 测得峰面积,计算样品中对羟基苯甲酸的含量, 结果见表15；从表中可定出红花注射液中对羟基苯甲酸的含量不得高于40μg/ml：
[0155] 表15.样品测定实验结果
[0156]
[0157] 4 结论
[0158] 经方法学考察，对羟基苯甲酸含量测定方法准确、重复性好，精密度高，可用于红花注射液中对羟基苯甲酸含量的测定；同时经对实验制样的含量测定，发现每1ml红花注射液中对羟基苯甲酸含量在小于30μg的范围，考虑一定安全边界，故认为将标准定为每1ml红花注射液中对羟基苯甲酸不得高于35μg。
[0159] 本发明一种红花注射液中对羟基苯甲酸的测定方法为外标法。采用本方法测定红花注射液中的有毒成分对羟基苯甲酸含量，具有易操作简便，对羟基苯甲酸分离效果好，峰纯度、精密度和重复性均较高等特点，符合检测要求。通过该方法测定了红花注射液对羟基苯甲酸含量，可用于红花注射液的质量控制标准。附图说明
[0160] 图1、对羟基苯甲酸浓度和峰面积线性关系图
[0161] 图2、对羟基苯甲酸对照溶液的高效液相色谱图
[0162] 图3、红花注射液（根据实施例1方法制备）的高效液相色谱图
[0163] 图4、红花注射液（根据实施例1方法制备）加样后的高效液相色谱图[0164] 图5、对羟基苯甲酸对照光谱图
[0165] 图6、红花注射液（根据实施例1方法制备）23.3min峰的光谱图
[0166] 图7、红花注射液（根据实施例1方法制备）加样后23.3min峰的光谱图[0167] 下述具体实施方式仅是更好的理解本发明，对本发明的保护范围没有限制作用。
具体实施方式
[0168] 实施例1（红花注射液的制备）
[0169] 取红花药材500g，加纯化水80-90℃热浸三次，第一次30-60min，第二次30-60min，第三次30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，滤过，一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤，滤液浓缩至50-60℃相对密度为1.1-1.3，加90%-95%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3，加10倍量水，冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，滤液浓缩至50-60℃600-800ml，加入0.1-0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用20%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-100min，冷藏
24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用20%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
[0170] 实施例2（红花注射液的制备）
[0171] 取红花药材500g，加纯化水80-90℃热浸三次，第一次30-60min，第二次30-60min，第三次30-60min，合并煎煮液，冷藏过夜，滤过，一级过滤10μm膜，二级过滤0.05μm膜过滤，滤液浓缩至50-60℃相对密度为1.1-1.3，加80%-90%乙醇，使含醇量达70%，冷藏，静止24-72小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至50-60℃相对密度1.1-1.3，加8倍量水，冷藏，静置16-24小时，滤过，阳离子交换树脂除钾，滤液浓缩至50-60℃600-800ml，加入0.1-0.5%活性炭，常温搅拌30min，将炭滤过，用10%NaOH溶液调pH值7.5-8.0，110℃热处理40-100min，冷藏24-72h；加入活性炭0.1-0.5%，50℃搅匀20-40min，过滤，用截留分子量5KD-10KD的超滤膜超滤，用10%氢氧化钠溶液调pH值7.5-8.0，加入注射用水成1000ml，滤过，充氮灌封，115℃灭菌，即得。
[0172] 实施例3（对羟基苯甲酸含量测定）
[0173] 照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ D）测定：
[0174] 步骤1、对照品溶液制备：取对羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，用50%甲醇制成每1ml中含30µg的溶液，即得；
[0175] 步骤2、测定法：分别精密吸取对照品溶液与本品各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0176] 高效液相色谱条件：
[0177] 色谱柱： Grace VisionHT C18 HL 5µm色谱柱（柱长为250mm，内径为4.6mm）；以甲醇-0.02%三氟乙酸水溶液（5:95）为流动相；检测波长为254nm；柱温为25℃；流速为1.5ml/min。理论板数按对羟基苯甲酸峰计算应不低于10000；
[0178] 本品每1ml含对羟基苯甲酸（C7H6O3），25µg。
[0179] 实施例4（对羟基苯甲酸含量测定）
[0180] 照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ D）测定：
[0181] 步骤1、对照品溶液制备：取对羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，用50%甲醇制成每1ml中含30µg的溶液，即得；
[0182] 步骤2、测定法：分别精密吸取对照品溶液与本品各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0183] 高效液相色谱条件：
[0184] 色谱柱： Grace VisionHT C18 HL 5µm色谱柱（柱长为250mm，内径为4.6mm）；以甲醇-0.02%三氟乙酸水溶液（5:90）为流动相；检测波长为254nm；柱温为20℃；流速为1.0ml/min。理论板数按对羟基苯甲酸峰计算应不低于10000；
[0185] 本品每1ml含对羟基苯甲酸（C7H6O3），26µg。
[0186] 实施例5（对羟基苯甲酸含量测定）
[0187] 照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ D）测定：
[0188] 步骤1、对照品溶液制备：取对羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，用50%甲醇制成每1ml中含30µg的溶液，即得；
[0189] 步骤2、测定法：分别精密吸取对照品溶液与本品各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0190] 高效液相色谱条件：
[0191] 色谱柱： Grace VisionHT C18 HL 5µm色谱柱（柱长为250mm，内径为4.6mm）；以甲醇-0.02%三氟乙酸水溶液（5:100）为流动相；检测波长为254nm；柱温为30℃；流速为2.0ml/min。理论板数按对羟基苯甲酸峰计算应不低于10000；
[0192] 本品每1ml含对羟基苯甲酸（C7H6O3），26µg。
[0193] 实施例6（对羟基苯甲酸含量测定）
[0194] 照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录Ⅵ D）测定：
[0195] 步骤1、对照品溶液制备：取对羟基苯甲酸对照品适量，精密称定，用50%甲醇制成每1ml中含30µg的溶液，即得；
[0196] 步骤2、测定法：分别精密吸取对照品溶液与本品各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0197] 高效液相色谱条件：
[0198] 色谱柱： Grace VisionHT C18 HL 5µm色谱柱（柱长为250mm，内径为4.6mm）；以甲醇-0.02%三氟乙酸水溶液（5:98）为流动相；检测波长为254nm；柱温为28℃；流速为1.8ml/min。理论板数按对羟基苯甲酸峰计算应不低于10000；
[0199] 本品每1ml含对羟基苯甲酸（C7H6O3），25µg。
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