技术领域
[0001] 本
发明属于电化学发光检测领域，涉及一种电化学发光适配体传感器及检测氯霉素的方法。尤其涉及将适配体分子负载于
碳化
钛-
氧化锌
复合材料(Ti3C2-ZnO)修饰的玻碳
电极表面，即以Aptamer/Ti3C2-ZnO/GCE电极为传感元件，定量检测鱼塘
水中氯霉素的电化学发光分析方法。
背景技术
[0002] 氯霉素(Chloramphenicol，简称CAP)，又称左旋霉素，是白色或无色的针状或片状结晶。
[0003] 它属于抑菌型广谱抗生素药物，可抵抗由不同类型的
微生物引起的感染。由于其高效而且价格低廉，自我国上世纪80年代，氯霉素开始在
水产养殖业中得到广泛的应用，可直接用于
治疗和防止鱼类多种
疾病，也可添加在
饲料中促进动物生长发育。但因苯环上带有硝基，其
半衰期较长，如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，对人类有较强的毒性，可严重危害人体造血系统，导致再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、血小板减少等疾病。目前食品中的CAP已受到各种组织的严格监管，欧盟将所有动物源性食品中CAP的最低要求性能限值(MRPL)设置为0.3μg/L。我国农业农村部在2002年第235号公告中也明文规定将氯霉素及其盐、酯类列入禁止使用药物，并在所有动物性食品的靶组织中不得检出。
[0004] 目前，已经被报道的测定氯霉素的方法主要有：气相色谱-质谱法(GC-MS)，高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)，光电化学分析法(PEC)，化学发光免疫分析法(CLIA)和酶联
免疫吸附测定法(ELISA)等。但大多数仪器分析方法在昂贵设备产生的成本方面都有局限性，仪器操作专业度高，前处理过程复杂耗时，难以推广到市场中进行现场检测。而免疫分析方法均是基于
抗原-
抗体特异性识别反应建立起来的，其原料抗体生产成本高、免疫活性易受离子强度、pH等环境因素影响。核酸适配体作为一种新型识别元件，合成简单快速、成本低、选择性好、性质稳定且易于修饰标记，是一种优良的抗体替代识别元件。因此，开发一种简单快速、选择性好的检测氯霉素的方法是必要且极其重要的。
[0005] 电化学发光(ECL)也称为电致化学发光，是一种将
电能转化为光能的分析技术，无需引入外部
光源，在
光电倍增管等光学仪器的辅助下采集发光强度图谱，并建立其与待测物关系从而实现微量分析的一种方法。它是化学发光和电化学方法的结合，具有操作简便、灵敏度高、背景低和检测时间短等优点。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于针对氯霉素检测
现有技术的不足，提供一种电化学发光适配体传感器及检测氯霉素的方法。本发明将二维层状碳化钛、
硝酸锌和甘
氨酸在氩气气氛下
热处理得到Ti3C2-ZnO纳米复合材料，并将其修饰到玻碳电极表面，使得电化学发光的灵敏度和
稳定性显著提高，再通过静电吸附作用负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器(简称Aptamer/Ti3C2-ZnO/GCE传感器)，可特异性识别目标分子氯霉素，提高了对氯霉素的选择性。
[0007] 一种电化学发光适配体传感器，所述电化学发光适配体传感器是由含有ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G
碱基序列的适配体负载于Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰的玻碳电极表面而成。
[0008] 进一步的，电化学发光适配体传感器由如下方法制得：
[0009] (1)将碳化钛、硝酸锌和甘氨酸在氩气气氛下热处理得到Ti3C2-ZnO纳米复合材料，然后将Ti3C2-ZnO纳米复合材料分散于水中，得分散液；
[0010] (2)将玻碳电极
抛光，依次用硝
酸溶液、
乙醇溶液和超纯水超声清洗，室温下吹干，获得前处理后的玻碳电极待用；用移液枪移取步骤(1)制得的分散液滴涂在前处理后的玻碳电极表面，自然晾干，得到所述Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰的玻碳电极，再通过静电吸附作用将所述适配体负载在Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰的玻碳电极表面，自然晾干，制得所述电化学发光适配体传感器。
[0011] 进一步的，步骤(1)所得分散液中Ti3C2-ZnO纳米复合材料的浓度为2mg/mL。更进一步的，所述步骤(2)中分散液的移取量为6μL；将适配体负载在Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰的玻碳电极表面的方法为：首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和
乙二胺四乙酸的Tris-HCl缓冲溶液加入所述适配体，配制适配体浓度为0.5～10μmol/L的适配体溶液，然后移取6μL的所述适配体溶液并将其滴涂在所述的Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰的玻碳电极表面。
[0012] 进一步的，所述适配体溶液中适配体的浓度为2.5μmol/L。
[0013] 一种基于电化学发光适配体传感器检测氯霉素的方法，所述方法为：
[0014] 以如上所述的电化学发光适配体传感器作为
工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为
对电极组成三电极体系，样品中的氯霉素被定量捕捉到传感器的表面，通过产生的发光
信号用于检测。
[0015] 进一步的，具体步骤为：
[0016] 步骤1，含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制：
[0017] 用pH为7.4的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制含0.1mol/L K2S2O8的PBS缓冲溶液；
[0018] 步骤2，不同浓度的氯霉素标准溶液的配制：配制氯霉素溶液，然后将氯霉素溶液加入步骤1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的氯霉素标准溶液，氯霉素标准溶液的浓度范围为0.1ng/mL～100ng/mL；
[0019] 步骤3，标准曲线的绘制：将所述电化学发光适配体传感器置于步骤2配制的不同浓度的氯霉素标准溶液中浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合氯霉素，然后取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以步骤1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液为
电解液，在-2.0～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合氯霉素前后的发光强度差值与氯霉素标准溶液中的氯霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
[0020] 步骤4，样品中氯霉素的检测：所述样品先过滤再用步骤1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液调节pH，然后放入电化学发光适配体传感器浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合氯霉素，然后取出后淋洗，作为工作电极，再采用步骤3方法检测发光强度，再根据线性回归方程计算出样品中氯霉素的浓度。
[0021] 进一步的，步骤3中所述的浸泡时间为20min。
[0022] 相比于现有技术，本发明的有益效果有：
[0023] 本发明设计了一种基于二维层状材料Ti3C2负载
半导体发光体ZnO的电化学发光适配体传感器，结合了适配体和电化学发光传感器的优势，通过氯霉素对该体系ECL信号强度的增强的机理，成功实现对氯霉素的灵敏检测，该传感平台可特异性识别检测物氯霉素，具有高选择性。本发明的检测范围为0.1ng/mL～100ng/mL，最低
检测限为0.019ng/mL。本发明检测氯霉素的操作简单、选择性好、检测成本低、灵敏度高。本发明对推广适配体传感器在环境及
食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。
附图说明
[0024] 图1为
实施例1中所构建的电化学发光适配体传感器在与不同浓度的氯霉素结合后的ECL响应图，其中氯霉素的浓度从左到右依次为：(a)0；(b)0.1ng/mL；(c)0.5ng/mL；(d)1.0ng/mL；(e)5.0ng/mL；(f)10.0ng/mL；(g)50.0ng/mL；(h)100.0ng/mL；
[0025] 图2为实施例1加入氯霉素前后发光强度的差值与氯霉素浓度对数值的标准曲线；
[0026] 图3是实施例1中制备的Ti3C2-ZnO纳米复合材料的扫描电镜图。
具体实施方式
[0027] 以下实施例中，作为起始原料的Ti3C2的粒径为0.2～10um，层数为1～10层。含有ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTAG碱基序列的适配体购自生工
生物工程(上海)股份有限公司，将该适配体负载在Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰的玻碳电极表面的方法为：首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris-HCl缓冲溶液中加入所述适配体，配制适配体浓度为2.5μmol/L的适配体溶液，然后移取6μL的所述适配体溶液并将其滴涂在所述的Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰的玻碳电极表面。具体的：(1)采购的适配体开盖前先涡旋振荡5～10min，再以5000rpm离心20min；(2)慢慢打开管盖，依照管上的标注，加入适量含有0.2mol/L KCl、0.1mol/L NaCl、5.0mmol/L MgCl2和1.0mmol/L乙二胺四乙酸的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液的储备溶液；(3)充分振荡均匀，稀释到2.5μmol/L的浓度，放于4℃
冰箱冷藏待用。
[0028] 以下实施例中不同浓度的氯霉素标准溶液的配制方法为：配制氯霉素溶液，然后将氯霉素溶液加入含有0.1mol/L K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的氯霉素标准溶液，本实施例中氯霉素标准溶液中氯霉素的浓度分别为0；0.1ng/mL；0.5ng/mL；1.0ng/mL；5.0ng/mL；10.0ng/mL；50.0ng/mL；100.0ng/mL[0029] 实施例1：
[0030] (一)组装Aptamer/Ti3C2-ZnO/GCE传感器
[0031] (1)Ti3C2-ZnO复合材料的制备：
[0032] 以Ti3C2为起始原料，Zn(NO3)2为锌源，甘氨酸(Gly)为氮源，采用热处理法合成Ti3C2-ZnO纳米复合材料(在材料中引入氮进行表面改性可大大
增强材料的电化学
反应性和
电子电导率，实验结果表明加入Gly比不加的电化学发光性能好得多)。在10mL离心管中加入5mL Ti3C2溶液(2.5mg/mL)、60mg Zn(NO3)2·6H2O、30mg Gly混合并超声分散均匀1h，获得前驱体溶液，然后将所得的前驱体溶液转移到氧化
铝坩埚中，并在氩气气氛下于管式炉中以5℃/min的速率升温至350℃，并保持2h，然后冷却至室温后直接从坩埚中取出样品，即得到Ti3C2-ZnO纳米复合材料(其中，Ti3C2在复合材料中的
质量百分含量为12％)。取20mg Ti3C2-ZnO纳米复合材料分散于10mL水中，获得分散液待用；
[0033] (2)Aptamer/Ti3C2-ZnO/GCE传感器的制备
[0034] 首先将玻碳电极用抛光粉(Al2O3)在麂皮上打磨成镜面后，依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗，室温下吹干获得预处理后的玻碳电极。用移液枪移取步骤(1)制得的6μL 2mg/mL的分散液，滴涂到预处理后的玻碳电极表面，得到Ti3C2-ZnO/GCE修饰电极，自然晾干待用；在Ti3C2-ZnO/GCE修饰电极表面再滴涂6μL配制好的适配体溶液，自然晾干6h，得到Aptamer/Ti3C2-ZnO/GCE传感器，作为电化学发光测试的传感元件。
[0035] (二)基于Aptamer/Ti3C2-ZnO/GCE传感器检测氯霉素的方法
[0036] (1)标准曲线的绘制
[0037] 将(一)中的Aptamer/Ti3C2-ZnO/GCE传感器作为传感元件，将其置于不同浓度的氯霉素标准溶液中浸泡20min，取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.1mol/L K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为电解液测定发光强度，在-2.0～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合氯霉素前后的发光强度差值与氯霉素标准溶液中的氯霉素浓度对数值的线性关系，得到的相应的线性回归方程为；△ECL＝1039.4266+482.81881lgC(ng/mL)，检测范围为0.1ng/mL～100ng/mL，检测限为0.019ng/mL。
[0038] (2)样品的检测
[0039] 取某鱼塘水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤
膜过滤收集滤液，加入含有0.1mol/L K2S2O8的0.1mol/L的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所得溶液用于电化学发光分析，按步骤(1)所得的线性回归方程计算出待检测样品中氯霉素的浓度，其结果列于表1中。
[0040] 本实施例以二维层状材料Ti3C2为基底材料，合成Ti3C2-ZnO纳米复合材料，形貌如图3，片上分散均匀的点，材料新颖，
导电性良好，稳定性好，传感器选择性好，稳定性好。
[0041] 对比实施例1：
[0042] (1)Aptamer/Ti3C2/GCE传感器的制备
[0043] 在10mL离心管中加入5mL Ti3C2溶液(2.5mg/mL)、30mg Gly混合并超声分散均匀1h，获得前驱体溶液，然后将所得的前驱体溶液转移到氧化铝坩埚中，并在氩气气氛下于管式炉中以5℃/min的速率升温至350℃，并保持2h，然后冷却至室温后直接从坩埚中取出样品，再将样品均匀分散在水中，制得2mg/mL的Ti3C2分散液。
[0044] 用移液枪移取6μL 2mg/mL的Ti3C2水分散液，滴涂到预处理过的玻碳电极(预处理方法同实施例1)表面，得到Ti3C2/GCE化学修饰电极，自然晾干待用；在Ti3C2/GCE化学修饰电极表面再滴涂6μL 2.5μmol/L氯霉素适配体，自然晾干6h，得到Aptamer/Ti3C2/GCE传感器，作为电化学发光测试的传感元件。
[0045] (2)标准曲线的绘制
[0046] 将步骤(1)制得的Aptamer/Ti3C2/GCE传感器作为传感元件，将其置于不同浓度的氯霉素标准溶液中浸泡20min，取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.1mol/L K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为电解液测定发光强度，在-2.0～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合氯霉素前后的发光强度差值与氯霉素标准溶液中的氯霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
[0047] (3)样品的检测
[0048] 取某鱼塘水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.1mol/L K2S2O8的0.1mol/L的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所得溶液用于电化学发光分析，按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中氯霉素的浓度，其结果列于表1中。
[0049] 对比实施例2：
[0050] (1)Aptamer/ZnO/GCE传感器的制备
[0051] 在10mL离心管中加入60mg Zn(NO3)·6H2O、30mg Gly混合并超声分散均匀1h，获得前驱体溶液，然后将所得的前驱体溶液转移到氧化铝坩埚中，并在氩气气氛下于管式炉中以5℃/min的速率升温至350℃，并保持2h，然后冷却至室温后直接从坩埚中取出样品，再将样品均匀分散在水中，制得2mg/mL ZnO分散液。
[0052] 用移液枪移取6μL 2mg/mL的ZnO分散液，滴涂到预处理过的玻碳电极(预处理方法同实施例1)表面，得到Ti3C2/GCE化学修饰电极，自然晾干待用；在Ti3C2/GCE化学修饰电极表面再滴涂6μL 2.5μmol/L氯霉素适配体，自然晾干6h，得到Aptamer/ZnO/GCE传感器，作为电化学发光测试的传感元件。
[0053] (2)标准曲线的绘制
[0054] 将步骤(1)制得的Aptamer/ZnO/GCE传感器作为传感元件，将其置于不同浓度的氯霉素标准溶液中浸泡20min，取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.1mol/L K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为电解液测定发光强度，在-2.0～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合氯霉素前后的发光强度差值与氯霉素标准溶液中的氯霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
[0055] (3)样品的检测
[0056] 取某鱼塘水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.1mol/L K2S2O8的0.1mol/L的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所得溶液用于电化学发光分析，按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中氯霉素的浓度，其结果列于表1中。
[0057] 表1某鱼塘水水样的测定结果
[0058]
[0059] 备注：a为三次测定的平均值
[0060] 如表1所示，样品平行测定3次，加标回收率在97％～101％之间，相对标准偏差小于5％，回收效果较好。上述实验结果说明，不用Ti3C2-ZnO纳米复合材料修饰而单独用Ti3C2或ZnO修饰玻碳电极后进一步组装传感元件无法检测出氯霉素，因此本发明的传感器是可用于检测鱼塘水水样中的氯霉素。
[0061] 以上实施例仅用于本发明说明使用，并非对本发明的限制，有关领域的技术人员可在不脱离本发明的范围内，还可以作出相应的各种变化，因此所有等同替换或等效变型的方式形成的技术方案均属于本发明的保护范围。。
