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活体检测 水杨酸的微型比率型 传感器及其构建方法与应用

阅读：825发布：2024-02-28

专利汇可以提供活体检测水杨酸的微型比率型传感器及其构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及微电极生物技术领域，具体涉及一种活体检测水杨酸的微型比率型传感器及其构建方法与应用。通常的电化学传感器是只有一种物质的单信号输出，本发明提供一种双信号输出的SA微型比率型传感器，从而更好的应用于植物的活体研究。本发明电极采用硫堇 /GO/MWNT的纳米簇进行修饰，将硫堇作为内置的校正信号，连同SA的信号一起构成双信号输出，从而构建比率型传感器，显著提高SA传感器的稳定性和重现性，从而实现植物活体SA检测时的准确性及可靠性。，下面是活体检测水杨酸的微型比率型传感器及其构建方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种可用于检测水杨酸的铂微丝电极的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
1)将铂微丝在浓硝酸中煮沸一定时间，然后分别在丙酮和双蒸水中超声洗涤；再将该铂微丝在含KCl的铁氰化钾溶液中进行循环伏安扫描直到得到理想的循环伏安图；
2)将氧化石墨烯与经酸化处理的多壁碳纳米管按一定质量比溶于适量超纯水中，然后向该溶液中再加入一定质量的硫堇，超声处理，制成硫堇/GO/MWNT的纳米簇；再离心纯化并用超纯水洗净，将沉淀重悬于适量超纯水中，制得硫堇/GO/MWNT的分散液；备用；
3)将步骤1)处理所得铂微丝置于步骤2)所得硫堇/GO/MWNT的分散液中，旋转浸渍，室温干燥后，再浸入nafion溶液中一定时间，取出，干燥；重复上述过程多次，按需要制成nafion/硫堇/GO/MWNT修饰的铂微丝电极，即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述铂微丝直径为10-250μm，优选直径为100μm。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述含KCl的铁氰化钾溶液的浓度为2-10mM，优选为5mM；和/或，
步骤1)所述循环伏安扫描所用电压为-0.2V至0.7V。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述GO与经酸化处理的MWNT的质量比为5:1-1:3，优选为1:2；和/或，
步骤2)中，每1mL超纯水中硫堇的添加量为0.5-3mg，优选为2mg；和/或，步骤3)所述nafion溶液的浓度为2-10％，优选为2％。
5.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将铂微丝在浓硝酸中煮沸一定时间，然后分别在丙酮和双蒸水中超声洗涤；再将该铂微丝在浓度为5mM的含KCl的铁氰化钾溶液中进行-0.2至0.7V循环伏安扫描直到得到理想的循环伏安图；
2)将氧化石墨烯与经酸化处理的多壁碳纳米管按质量比为5:1-1:3溶于1mL超纯水中，然后向该溶液中再加入0.5-3mg的硫堇，超声处理，制成硫堇/GO/MWNT的纳米簇；再离心纯化并用超纯水洗净，将沉淀重悬于1mL超纯水中，制得硫堇/GO/MWNT的分散液；备用；
3)将步骤1)处理所得铂微丝置于步骤2)所得硫堇/GO/MWNT的分散液中，旋转浸渍，室温干燥后，再浸入浓度为2-10％的nafion溶液中一定时间，取出，干燥；重复上述过程多次，按需要制成nafion/硫堇/GO/MWNT修饰的铂微丝电极，即可。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备的可用于检测水杨酸的铂微丝电极。
7.一种微型比率型传感器，其特征在于，包括密封在玻璃毛细管中相互连接的权利要求6所述可用于检测水杨酸的铂微丝电极和铜丝；所述玻璃毛细管一端露出一定长度的铜丝做导线，另一端露出一定长度所述铂微丝电极做工作电极；所述玻璃毛细管的两端用绝缘材料密封。
8.权利要求6所述可用于检测水杨酸的铂微丝电极或权利要求7所述微型比率型传感器在在线活体检测植物水杨酸方面的应用。
9.一种在线活体检测植物水杨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以权利要求6所述可用于检测水杨酸的铂微丝电极做工作电极或以权利要求7所述微型比率型传感器的可用于检测水杨酸的铂微丝电极做工作电极，Ag/AgCl丝做参比电极，铂丝做对电极，通过电化学工作站的电化学方法测试一系列含不同浓度SA的PBS标准溶液，以SA的氧化电流与硫堇氧化电流的比值对应SA的浓度建立标准曲线；
2)将步骤1)所述工作电极、Ag/AgCl丝参比电极及铂丝对电极分别插入待测植物组织；
通过电化学方法进行检测，根据上述标准曲线获得待测植物中SA的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，待测植物包括农作物、花卉、蔬菜、林木；
和/或，检测部位包括植物体的根、茎、果实。

说明书全文

活体检测 水杨酸的微型比率型 传感器及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微电极生物技术领域，具体涉及一种活体检测水杨酸的微型比率型传感器及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 水杨酸(SA)是一种重要的植物激素，在植物的种子萌发、开花、气孔关闭、膜的渗透性及对刺激的防御反应等多种生理过程中发挥重要作用。传统的检测植物中SA的方法包括高压液相色谱法、气相色谱-质谱法、酶联免疫吸附、荧光光谱法等。在这些方法中，SA主要通过采集植物样本进行离体检测。样本的采集通常会对植物造成较大的损伤甚至引起死亡，并且离体检测通常反映的是一种静态及累积的效果，不能反映植物激素在环境变化时的即时信息。因此急需发展植物样本中SA的活体检测方法。

[0003] 电化学传感器具有高的灵敏度及选择性、成本较低、操作简单、易于集成及便携等特点，因此尤其适合活体检测应用。但电化学传感器在修饰过程中不可避免会受到环境及人为因素的影响，重现性较差，严重制约其实际应用。而活体研究中的生物样本更加复杂，更需要提高电化学传感器的重现性及可靠性。

发明内容

[0004] 通常的电化学传感器是只有一种物质的单信号输出，本发明的目的在于提供一种双信号输出的SA微型比率型传感器，从而更好的应用于植物的活体研究。

[0005] 本发明的方案如下：

[0006] 一种可用于检测水杨酸的铂微丝电极的制备方法，包括如下步骤：

[0007] 1)将铂微丝在浓硝酸中煮沸一定时间(一般约3-10分钟)，然后分别在丙酮和双蒸水中超声洗涤；再将该铂微丝在含KCl的铁氰化钾溶液中进行循环伏安扫描直到得到理想的循环伏安图；

[0008] 2)将氧化石墨烯(GO)与经酸化处理的多壁碳纳米管(MWNT)按一定质量比溶于适量超纯水中，然后向该溶液中再加入一定质量的硫堇，超声处理(一般2-4h)，制成硫堇/GO/MWNT的纳米簇；再离心纯化并用超纯水洗净，将沉淀重悬于适量超纯水中，制得硫堇/GO/MWNT的分散液；备用；

[0009] 3)将步骤1)处理所得铂微丝置于步骤2)所得硫堇/GO/MWNT的分散液中，旋转浸渍(一般5min左右)，室温干燥后，再浸入nafion溶液中一定时间(一般5min左右)，取出，干燥；重复上述过程(即旋转浸渍、干燥，再进入nafion溶液中一定时间、取出干燥)多次(一般2-5次)，按需要制成nafion/硫堇/GO/MWNT修饰的铂微丝电极，即为可用于检测水杨酸的铂微丝电极。

[0010] 进一步地，步骤1)所述铂微丝直径为10-250μm，优选直径为100μm。

[0011] 进一步地，步骤1)所述含KCl的铁氰化钾溶液的浓度为2-10mM，优选为5mM。

[0012] 进一步地，步骤1)所述循环伏安扫描所用电压为-0.2至0.7V。

[0013] 进一步地，步骤2)所述GO与经酸化处理的MWNT的质量比为5:1-1:3，优选为1:2。

[0014] 进一步地，步骤2)中，每1mL超纯水中硫堇的添加量为0.5-3mg，优选为2mg。

[0015] 进一步地，步骤3)所述nafion溶液的浓度为2-10％(质量分数)，优选为2％。

[0016] 具体地，上述可用于检测水杨酸的铂微丝电极，其制备方法包括如下步骤：

[0017] 1)将铂微丝在浓硝酸中煮沸一定时间(约3-10分钟)，然后分别在丙酮和双蒸水中超声洗涤；再将该铂微丝在浓度为5mM的含KCl的铁氰化钾溶液中进行-0.2至0.7V循环伏安扫描直到得到理想的循环伏安图；

[0018] 2)将氧化石墨烯(GO)与经酸化处理的多壁碳纳米管(MWNT)按质量比为5:1-1:3溶于1mL溶液超纯水中，然后向该溶液中再加入0.5-3mg的硫堇，超声处理(一般2-4h)，制成硫堇/GO/MWNT的纳米簇；再离心纯化并用超纯水洗净，将沉淀重悬于1mL超纯水中，制得硫堇/GO/MWNT的分散液；备用；

[0019] 3)将步骤1)处理所得铂微丝置于步骤2)所得硫堇/GO/MWNT的分散液中，旋转浸渍(一般5min左右)，室温干燥后，再浸入浓度2-10％的nafion溶液中一定时间(一般5min左右)，取出，干燥；重复上述过程(即旋转浸渍、干燥，再进入nafion溶液中一定时间、取出干燥)多次(一般2-5次)，按需要制成nafion/硫堇/GO/MWNT修饰的铂微丝电极，即为可用于检测水杨酸的铂微丝电极。

[0020] 本发明还包括上述方法制备的可用于检测水杨酸的铂微丝电极。

[0021] 进一步地，所述氧化石墨烯(GO)可由改良的Hummers法制得；所述多壁碳纳米管(MWNT)可市售购得，可采用本领域常规方法进行酸化处理。

[0022] 硫堇是一种小分子氧化还原探针，硫堇与其他修饰材料共同修饰到电极表面，其氧化还原电信号可以探测电极表面的修饰情况；硫堇的氧化峰在-0.2V左右，SA的氧化峰在1.0V左右，硫堇的氧化峰不会对SA的氧化造成干扰，从而可以作为内置的校正。然后通过SA的氧化电流与硫堇氧化电流的比值反应SA的浓度，大大提高了检测的稳定性。

[0023] 本发明还提供一种微型比率型传感器，包括密封在玻璃毛细管中相互连接的上述可用于检测水杨酸的铂微丝电极和铜丝；所述玻璃毛细管一端露出一定长度的铜丝做导线，另一端露出一定长度(约1-3mm)所述铂微丝电极做工作电极；所述玻璃毛细管的两端用绝缘材料密封。

[0024] 本发明所述微型比率型传感器既可以事先制备上述可用于检测水杨酸的铂微丝电极，再按需要组装成微型比率型传感器；也可以将铂微丝按需要组装后，再将铂微丝的一端按上述方法进行改性处理。

[0025] 本发明还包括上述可用于检测水杨酸的铂微丝电极或上述微型比率型传感器在在线活体检测植物水杨酸等方面的应用。

[0026] 本发明还提供一种在线活体检测植物水杨酸的方法，包括如下步骤：

[0027] 1)用上述可用于检测水杨酸的铂微丝电极做工作电极，Ag/AgCl丝做参比电极，铂丝做对电极，通过电化学工作站的相关电化学方法(如循环伏安法、脉冲伏安法、方波伏安法等)测试一系列含不同浓度SA的PBS标准溶液，以SA的氧化电流与硫堇氧化电流的比值对应SA的浓度建立标准曲线；

[0028] 2)将上述工作电极、Ag/AgCl丝参比电极及铂丝对电极分别插入待测植物组织；通过相关电化学方法(如循环伏安法、脉冲伏安法、方波伏安法等)进行检测，根据上述标准曲线获得待测植物中SA的含量。

[0029] 进一步地，待测植物包括农作物、花卉、蔬菜、林木等。

[0030] 进一步地，检测部位包括植物体的根、茎、果实等组织。

[0031] 本发明所用原料均可市售购得。

[0032] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

[0033] 本发明的关键点：

[0034] (1)本发明是原位活体检测植物体中SA的方法；

[0035] (2)电极采用硫堇/GO/MWNT的纳米簇进行修饰，将硫堇作为内置的校正信号，连同SA的信号一起构成双信号输出，从而构建比率型传感器，显著提高电化学传感器的稳定性和重现性；

[0036] (3)检测目标是植物激素水杨酸；

[0037] (4)检测目标材料是植物材料，包括农作物、花卉、蔬菜、林木等；

[0038] (5)检测部位可以是植物的根、茎、果实等组织；

[0039] (6)检测目标材料可以是植物生长的不同时期和不同环境。

[0040] 本发明的有益效果：

[0041] 本发明显著提高SA传感器的稳定性和重现性，从而实现植物活体SA检测时的准确性及可靠性。附图说明

[0042] 图1为本发明铂微丝电极修饰过程示意图。

[0043] 图2表示非比率型(A)传感器及比率型(B)传感器对同一浓度SA的30次检测结果的重现性比较。

具体实施方式

[0044] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

[0045] 实施例1构建微型比率型传感器

[0046] (1)将直径为100μm的铂微丝与铜丝连接，密封在玻璃管中，然后用绝缘胶和环氧树脂密封玻璃管，一端露出部分铜丝做导线，另一端露出约2mm铂微丝做电极。

[0047] 将铂微丝在浓硝酸中煮沸约3-10分钟，然后分别在丙酮和双蒸水中超声洗涤；再将该铂微丝在浓度为5mM的含KCl的铁氰化钾溶液中进行-0.2至0.7V循环伏安扫描直到得到理想的循环伏安图；

[0048] (2)将GO与经酸化处理的MWNT按质量比1:2溶于1mL超纯水中，然后将2mg硫堇加入上述1mL GO/MWNT的混合溶液中，超声4h。制备硫堇/GO/MWNT的纳米簇。离心纯化并超纯水冲洗多次，直至洗净，沉淀重悬于1mL超纯水中，制得硫堇/GO/MWNT的分散液；备用。

[0049] (3)将硫堇/GO/MWNT的分散液置于干净的玻璃板上，将步骤(1)处理的铂丝电极在该分散液中旋转浸渍5min，室温干燥后，再浸入浓度为2％的nafion溶液中5min，干燥。重复5次。制成nafion/硫堇/GO/MWNT修饰的铂微丝电极。

[0050] 对比例1构建非微型比率型传感器

[0051] 构建方法与实施例1微型比率型传感器构建方法的区别仅在于：GO/MWNT的混合溶液不添加硫堇，制备出不加硫堇的nafion/GO/MWNT修饰的铂微丝电极作为对照。

[0052] 实验例1

[0053] 分别收集4只实施例1构建的比率型传感器及对比例1构建的非比率型传感器对同一浓度SA的20次检测结果进行比较，统计结果见图2。非比率型传感器的相对标准偏差(RSD)为15.4％，而比率型传感器的RSD为5.2％，重现性显著高于非比率型传感器。图2中A表示非比率型传感器，B表示比率型传感器。

[0054] 实验例2在线活体检测植物水杨酸

[0055] 利用实施例1修饰后的铂丝微电极传感器活体检测盐胁迫处理向日葵幼苗中的SA。

[0056] 1)用实施例1修饰的微电极做工作电极，Ag/AgCl丝做参比电极，铂丝做对电极，通过循环伏安法测试SA标准溶液，比率型传感器以SA的氧化电流与硫堇氧化电流的比值对应SA的浓度建立标准曲线。

[0057] 对照处理以对比例1构建的非比率型传感器以SA的氧化电流对应SA的浓度建立标准曲线。

[0058] 2)以向日葵幼苗为待测对象，设置对照组(0mm NaCl)和处理组1(50mm NaCl)和处理组2(100mm NaCl)。

[0059] 将向日葵幼苗水培15天，进行不同浓度的盐胁迫处理，盐胁迫处10h后，用穿刺针在向日葵幼苗茎杆部打孔，然后分别将修饰后的比率型铂微丝电极、Ag/AgCl丝参比电极及铂丝对电极分别插入植物的茎部。通过循环伏安法进行检测，根据标准曲线求得植物样本中SA的含量。

[0060] 3)实验结果对比

[0061] 切取微电极检测部位的部分组织进行HPLC-MS检测，与传感器检测的即时结果进行对比，如表1所示。结果表明该微电极传感检测结果的变化趋势与HPLC-MS的趋势一致，但结果更为准确，并且反应了植物活体内的即时的SA浓度，结果更加可靠。

[0062] 表1：比率型SA传感器活体检测盐胁迫处理的

[0063] 向日葵幼苗的SA含量与HPLC-MS离体检测结果的对比

[0064]处理组传感器(ng/g) HPLC-MS(ng/g)
0mm 226.83±10.84 208.56±39.62
50mm 140.25±7.09 156.78±24.55
100mm 108.40±5.12 112.33±15.60

[0065] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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