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有机着色细颗粒、诊断药 试剂盒及体外诊断方法

阅读：353发布：2020-05-08

专利汇可以提供有机着色细颗粒、诊断药试剂盒及体外诊断方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供具有良好的本底和检查结果的再现性、具有充分的检出灵敏度的免疫色谱诊断试剂盒中使用的有机着色细颗粒。本发明的有机着色细颗粒的特征在于，平均粒径为100～650nm，显色强度为1.0～10.0，长径(L)/短径(D)所示的球形度为1.0～2.5，并且，在粒径400nm～12000nm的范围内检测总个数100000个颗粒时，粒径700nm以上的粗大颗粒的存在率为5％以下。，下面是有机着色细颗粒、诊断药试剂盒及体外诊断方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种有机着色细颗粒，其特征在于，平均粒径为100～650nm，显色强度为1.0～10.0，长径(L)/短径(D)所示的球形度为1.0～2.5，并且，在粒径400nm～12000nm的范围内检测总个数100000个颗粒时，粒径700nm以上的粗大颗粒的存在率为5％以下。
2.根据权利要求1所述的有机着色细颗粒，其中，所述有机着色细颗粒的重量的10～90重量％为着色成分。
3.根据权利要求2所述的有机着色细颗粒，其中，所述着色成分为反应性染料。
4.根据权利要求3所述的有机着色细颗粒，其中，所述反应性染料具有嘧啶结构或三嗪结构。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的有机着色细颗粒，其中，所述有机着色细颗粒的亲水度为1.0～30.0。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的有机着色细颗粒，其通过物理吸附而结合有配体。
7.根据权利要求6所述的有机着色细颗粒，其中，所述配体被酪蛋白涂覆。
8.一种诊断药试剂盒，其含有权利要求1～7中任一项所述的有机着色细颗粒。
9.根据权利要求8所述的诊断药试剂盒，其为免疫色谱试剂盒。
10.一种体外诊断方法，其包括使用权利要求1～7中任一项所述的有机着色细颗粒的工序。
11.根据权利要求10所述的体外诊断方法，其为免疫色谱方法。

说明书全文

有机着色细颗粒、诊断药试剂盒及体外诊断方法

技术领域

[0001] 本发明涉及源自有机高分子的有机着色细颗粒、以及使用其的诊断药试剂盒及体外诊断方法。

背景技术

[0002] 近年开发了短时间内进行病毒、细菌等病原体感染的有无、妊娠的有无、癌标记物的有无、食品中的特定原材料、残留农药等有害物质的有无等各种检查的简易检查试剂、诊断药、诊断试剂盒。它们利用基于各检查对象物质和与检查对象物质特异性反应的物质的特异反应。特别是使用基于抗原和抗体的抗原抗体反应的免疫学测定法，开发了免疫色谱测定法、比浊免疫测定法、酶免疫测定法、化学发光测定法、放射免疫测定法、利用表面等离子体共振的测定法等很多测定方法。而且，这些测定法被用于医院、诊疗所等中的疾病等的检查、食品公司等中的食物检查等。其中，免疫色谱测定法由于无需特別的设备、仪器、知识，操作也简便，廉价，能够迅速诊断等特征而被实施于非常多的检查。近年，妊娠检查药等在通常药店出售，即使是通常消费者也可以测定，进而不仅是检查有无检查对象物质的定性检查，而且测定量的定量检查等也能够实现。

[0003] 作为免疫色谱测定法的测定原理，存在被称为三明治法的方法、被称为竞争法的方法。另外，作为测定形式，存在被称为渗滤(flow through)型、侧向流动(lateral flow)型的方法。作为检样中的检查对象物质，可以检出各种物质，但作为典型例，存在通过三明治法检出抗原的测定，依次实施以下那样的操作。但是不限于这种操作。

[0004] (1)将与作为检查对象物质的抗原特异性结合的抗体固定化于硝基纤维素膜等色谱介质的规定部位、在色谱介质的任意位置形成被称为测试线(test line)(以下也称为“TL”)的反应部位。

[0005] (2)制造在酶、显色颗粒、荧光显色颗粒、磁性颗粒等标记物质上负载有与检查对象物质特异性结合的配体(例如抗体)而成的检出试剂，将所述检出试剂涂布于结合垫(conjugate pad)等并干燥，形成含有检出试剂的部分，与前述色谱介质组合而形成免疫色谱诊断试剂盒。在此所称的配体指的是与检查对象物质特异性结合的物质，可列举出抗体、抗原、有机分子、蛋白质作为例子。

[0006] (3)将含有抗原的检样其本身、或将其用任意液体稀释而成的溶液滴加到前述免疫色谱诊断试剂盒的规定位置、例如样品垫，使抗原和检出试剂在色谱介质上展开。

[0007] 通过这些操作，在反应部位，被固定化于色谱介质上的抗体可借由抗原而捕捉标记物质，检出标记物质的信号，由此进行利用免疫色谱诊断试剂盒进行的诊断。通常的诊断为仅检查抗原的有无的定性诊断，但是近年通过用肉眼或机械检出该信号的强度，也可以进行定量诊断。

[0008] 在此，作为在标记物质上负载抗体的方法，大致存在两种。一种为通过化学结合而负载的方法，另一种为物理上吸附、负载于标记物质表面的方法。已知通过化学结合使其负载的方法存在可以有效地使抗体取向的可能性。但是一般而言，基于抗体不同而存在难以化学结合的情况，另外，从处理操作的简便性的观点考虑，为了对应于广泛的检查对象，以物理的方式吸附抗体的颗粒更受到欢迎。其中，作为以物理的方式可以吸附抗体的颗粒，以下的专利文献1中报告了胶体金，以下的专利文献2中报告了着色胶乳。

[0009] 作为免疫色谱测定法中所要求的需要之一，存在分析灵敏度的改善。这意味着即使是更少的检查对象物质也可以检出。通过分析灵敏度改善，能够迅速诊断，因此分析灵敏度成为重要的因素。本申请发明人等在以下的专利文献3中报告了，作为以物理的方式能够吸附抗体的显色颗粒，使用颜色浓、粒径大的纤维素颗粒，由此能够改善分析灵敏度。

[0010] 另一方面，作为其它需要，存在免疫色谱展开后的硝基纤维素膜的本底的改善。在此，“本底”指的是，由于显色颗粒堵塞硝基纤维素膜的细孔或者非特异吸附而导致硝基纤维素膜着色的现象。若本底差则硝基纤维素膜与TL的对比度变差，难以发现TL的显色了的线，在医疗现场难以判定。进而若本底差则难以判断阴性的TL(即，没有显色)。这些现象有可能引起误诊。专利文献3中未言及任何有关这种本底的问题。

[0011] 现有技术文献

[0012] 专利文献

[0013] 专利文献1：日本专利第4514233号公报

[0014] 专利文献2：日本特开2004-184295号公报

[0015] 专利文献3：国际公开第2011/062157号

发明内容

[0016] 发明要解决的问题

[0017] 鉴于上述现有技术，本发明的目的在于，提供具有良好的本底和检查结果的再现性、具有充分的检出灵敏度的免疫色谱诊断试剂盒用的有机着色细颗粒。

[0018] 用于解决问题的方案

[0019] 本发明人等为了解决上述问题而深入研究、反复实验，结果意外地发现，若为有机着色颗粒的球形度和粒径700nm以上的粗大颗粒量经缜密控制的有机着色细颗粒，则可以在作为色谱介质的硝基纤维素膜上展开而不会堵塞，其结果，使用了上述有机着色细颗粒作为显色颗粒的免疫色谱的检出灵敏度高、检查结果的再现性优异，从而完成了本发明。

[0020] 即，本发明如下所述。

[0021] [1]一种有机着色细颗粒，其特征在于，平均粒径为100～650nm，显色强度为1.0～10.0，长径(L)/短径(D)所示的球形度为1.0～2.5，并且，在粒径400nm～12000nm的范围内检测总个数100000个颗粒时，粒径700nm以上的粗大颗粒的存在率为5％以下。

[0022] [2]根据前述[1]所述的有机着色细颗粒，其中，前述有机着色细颗粒的重量的10～90重量％为着色成分。

[0023] [3]根据前述[2]所述的有机着色细颗粒，其中，前述着色成分为反应性染料。

[0024] [4]根据前述[3]所述的有机着色细颗粒，其中，前述反应性染料具有嘧啶结构或三嗪结构。

[0025] [5]根据前述[1]～[4]中任一项所述的有机着色细颗粒，其中，前述有机着色细颗粒的亲水度为1.0～30.0。

[0026] [6]根据前述[1]～[5]中任一项所述的有机着色细颗粒，其通过物理吸附而结合有配体。

[0027] [7]根据前述[6]所述的有机着色细颗粒，其中，前述配体被酪蛋白涂覆。

[0028] [8]一种诊断药试剂盒，其含有前述[1]～[7]中任一项所述的有机着色细颗粒。

[0029] [9]根据前述[8]所述的诊断药试剂盒，其为免疫色谱试剂盒。

[0030] [10]一种体外诊断方法，其包括使用前述[1]～[7]中任一项所述的有机着色细颗粒的工序。

[0031] [11]根据前述[10]所述的体外诊断方法，其为免疫色谱方法。

[0032] 发明的效果

[0033] 使用本发明的有机着色细颗粒作为显色颗粒的免疫色谱，具有良好的本底和检查结果的再现性、具有充分的检出灵敏度。

[0034] 本发明为发现通过缜密控制有机着色细颗粒的球形度和粒径700nm以上的粗大颗粒，维持高的检出灵敏度的同时，本底良好，检查结果的再现性优异，基于此而完成的发明。

[0035] 专利文献3中公开了通过使用粒径大、颜色浓的有机着色细颗粒作为免疫色谱的显色颗粒，检出灵敏度改善。但是，上述细颗粒由于球形度低、球形变形，因此在硝基纤维素膜上展开时会卡在细孔中，因此有可能导致本底变差。

[0036] 另一方面，本申请发明人等发现，作为免疫色谱用的显色颗粒展开时，粒径为700nm以上的粗大颗粒为本底变差的主要原因，将粒径为700nm以上的颗粒视作粗大颗粒。
专利文献3中，对于700nm以上的粗大颗粒没有任何谈及，若仅管理该文献中示出的参数(例如CV值)，则本底变差。作为改善本底的方法，也存在在展开液中加入表面活性剂、氨基酸等添加剂的手法，但是利用这些手法时灵敏度也有可能降低。

[0037] 本发明人等认为，若能够将颗粒的形状更接近于球形，并且减少容易堵塞硝基纤维素膜的细孔的粗大颗粒，则也许能够没有着色地在硝基纤维素膜上展开、也就是说本底变得良好。在上述假说下进行研究实验，结果发现，对于精密地控制聚合度、使用具有嘧啶结构或三嗪结构的反应性染料染色了的颗粒而言，颗粒的形状更接近于球形，并且可以减少粒径700nm以上的粗大颗粒。若使用这种有机着色细颗粒作为免疫色谱的显色颗粒，则不仅可维持以往的高检出灵敏度、而且得到良好的本底，结果与TL的对比度也变得良好，也容易判断显色的有无，进而再现性也改善。另外，通过精密地控制颗粒表面的亲疏水性，与减少粗大颗粒相对应的检出灵敏度改善，检查的再现性也大幅改善。附图说明

[0038] 图1为作为本发明的一实施方式的侧向流动式的免疫色谱诊断试剂盒的截面图。

[0039] 图2为亲水度的求出方法的说明图。

[0040] 图3为实施例1中得到的着色纤维素细颗粒的电子显微镜图像。

具体实施方式

[0041] 以下对于本发明的实施方式进行详细说明。

[0042] 本实施方式的有机着色细颗粒的特征在于，平均粒径为100～650nm，显色强度为1.0～10.0，长径(L)/短径(D)所示的球形度为1.0～2.5，并且，在粒径400nm～12000nm的范围内检测总个数100000个颗粒时，粒径700nm以上的粗大颗粒的存在率为5％以下。

[0043] 本实施方式中的“有机着色颗粒”指的是对于水、缓冲液等为不溶性、且负载有色素、染料等的颗粒状物质。对于构成颗粒的原材料没有特别限定，作为这种有机着色细颗粒，可列举出例如将聚苯乙烯胶乳等苯乙烯系胶乳、丙烯酸类胶乳等着色而成的着色胶乳颗粒、将包含由硅原子和氧原子形成的三维结构体的二氧化硅着色而成的着色二氧化硅颗粒、将纤维素着色而成的着色纤维素颗粒等将着色成分直接颗粒化而成的显色颗粒等。另外，前述有机着色细颗粒也可以为荧光发光性颗粒。从粒径的调整、颜色浓度的调整、颜色种类的调整、颗粒表面状态的调整等颗粒特征调整的容易程度的观点考虑，优选为着色纤维素颗粒。纤维素由于具有大量羟基，亲水性高、分散稳定性优异，可以大量含有着色成分。

[0044] 对于“有机着色颗粒的制造方法”没有特别限定。可列举出：首先将有机颗粒成形，再使其负载色素、染料等着色成分的方法；将颗粒成形，并使其负载金属胶体、颜料等更小的显色颗粒的方法；在颗粒成形时也一起加入色素、染料、颜料、金属胶体等着色成分而进行成形的方法等。其中，从粒径的调整、颜色浓度的调整、颜色种类的调整、颗粒表面状态的调整等颗粒特征调整的容易程度的观点考虑，优选为首先将颗粒成形，再使其负载色素、染料等着色成分的方法。另外，作为所负载的着色成分，从负载的容易程度的观点考虑，优选为染料。

[0045] 作为着色成分，使用染料的情况下，优选为反应性染料。使用直接染料、含金染料、酸性染料、碱性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、萘酚染料、荧光染料等染料的情况下，得不到高的显色强度，即使可以较强地着色，也有可能脱色等。但是使用反应性染料的情况下，也可以组合直接染料、含金染料、酸性染料、碱性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、萘酚染料、荧光染料等染料。

[0046] 反应性染料优选具有嘧啶结构或三嗪结构。在此可知，嘧啶结构或三嗪结构会将颗粒疏水化，对于后述的亲水度造成较大影响。作为反应性染料，若具有嘧啶结构或三嗪结构则没有特别限制，可以合适地使用Sumifix系列、SumifixHF系列、SumifixSupra系列(以上为注册商标、住友化学株式会社制)、Levafix系列(注册商标、DyStarLtd.制)等。这些反应性染料即使在使用高浓度的氢氧化钠的情况下，也可以合适地染色。对于没有将嘧啶结构或三嗪结构作为反应部位的反应性染料而言，若使用高浓度的氢氧化钠则在与纤维素的羟基反应之前，反应部位会失活，达不到所希望的显色强度、亲水度。本实施方式中，通过使用高浓度的氢氧化钠和以嘧啶结构或三嗪结构作为反应部位的反应性染料对有机颗粒进行染色，将颗粒整体均匀染色，粒径变得均匀，并且达成后述的亲水度。

[0047] 在首先将纤维素颗粒成形并在其后使其负载着色成分的情况下，对于“纤维素颗粒的成形方法”没有特别限定。可列举出：用球磨机、高压均化器将天然的纤维素进行物理上的微細化的方法；用酸、碱等进行化学上的处理而微细化的方法；将纤维素暂时溶解于其良溶剂而成形为颗粒状的方法等。另外，也可以将经过衍生物化的纤维素溶解而成形为颗粒状，将经过衍生物化的取代基恢复为羟基而制造纤维素颗粒。进而也可以组合这些成形方法。另外，对于“纤维素的种类”也没有特别限定，可以使用再生纤维素、纯化纤维素、天然纤维素、前述经过衍生物化的纤维素、经过衍生物化的取代基恢复为羟基的纤维素等。其中，从粒径的调整、颗粒形状的调整等观点考虑，优选为暂时溶解于良溶剂而成形为颗粒状的方法，作为纤维素的种类，优选为再生纤维素。

[0048] 在将纤维素暂时溶解于其良溶剂而成形为颗粒状的情况下，对于“溶解纤维素的良溶剂的种类”也没有特别限定，可以使用铜氨溶液、粘胶溶液、N-甲基吗啉、各种离子性液体等可以溶解纤维素的各种良溶剂。其中，从粒径的调整、颗粒形状的调整等观点考虑，优选为铜氨溶液。另外，对于将所溶解的纤维素成形为颗粒的方法也没有特别限定，本实施方式中，选择利用相分离的方法。

[0049] 有机着色细颗粒的“平均粒径”指的是，利用动态光散射法测定时的体积平均中值粒径，体积平均中值粒径处于100～650nm的范围内。若平均粒径处于该范围内则颗粒的表面积大，因此用作免疫色谱诊断试剂盒的情况下，TL更浓，即分析灵敏度升高。若平均粒径过小则表面积变小，存在分析灵敏度降低或者产生颗粒聚集的情况。因此，平均粒径优选为150nm以上、更优选200nm以上。若粒径过大则堵塞硝基纤维素等色谱介质的孔，由此本来检查后应该变白的部分着色，存在对于检查结果的判断造成不良影响或者检测限变差的情况。因此，平均粒径优选为600nm以下、更优选550nm以下。需要说明的是，在此所述的平均粒径到底为平均值，粒径分布的一部分可以处于上述范围之外。

[0050] 作为粒径的评价使用体积平均的理由如下：免疫色谱诊断试剂盒中，太大的颗粒堵塞硝基纤维素等色谱介质，而即使仅少量存在体积平均大的颗粒，也反映这种影响。作为粒径的评价方法，除了体积平均以外，还存在数平均、面积平均等各种评价方法，若评价方法不同则当然粒径的值也不同。

[0051] 对于本实施方式的有机着色细颗粒的平均粒径的CV值没有特别规定。但是，用作诊断药的情况下，优选为30％以下。若平均粒径的CV值超过30％则对于作为诊断药的诊断的正确性造成不良影响，因此更优选为25％以下、进一步优选20％以下。通常若平均粒径的CV值小则诊断的正确性改善，但是若CV值过小则制造的工夫、成本增大，因此若考虑到成本和正确性的平衡则优选为1％以上。

[0052] “显色强度”指的是，定义颗粒的颜色浓度的值。显色强度的测定方法如以下所述。

[0053] 制造已知浓度的有机着色细颗粒的纯水分散液，作为光路长10mm，以400～800nm的范围进行使用了积分球的可见吸光度测定，测定所得到的吸光度曲线的峰值(ABS)，将所得到的值除以有机着色细颗粒的重量百分率，换算为每0.01重量％显色颗粒的吸光度的值，将其定义为显色强度。例如所制造的有机着色细颗粒的浓度为0.0045％、吸光度曲线的峰值为1.0的情况下，其显色强度为(1×0.01)÷0.0045＝2.2。

[0054] 作为颗粒的颜色浓度的测定进行使用了积分球的可见吸光度测定的理由如下：可以最正确地测定分散于液体的状态的颗粒的颜色浓度。作为测定颗粒的颜色浓度的方法，也存在用比色计等测定将颗粒干燥而得到的固体的方法，但是利用这种方法时，不能正确地测定颗粒的颜色浓度。例如金属胶体等根据粒径而色调、最大波长不同，经过干燥的聚集状态不能正确地反映分散于液体的状态的颜色浓度。另外，即使以相同的颗粒浓度分散于液体中，若产生聚集则颜色浓度变淡。进而进行可见吸光度测定时使用积分球的理由如下：去除由于颗粒自身的散射所导致的影响。通常的可见吸光度测定为测定透射光的方法，不仅反映对于入射光通过着色成分实现的吸收，也反映由于颗粒自身的散射所造成的影响。
例如对于免疫色谱通常使用的胶体金而言，粒径为40nm～60nm，有时也偶尔使用100nm的粒径，但粒径都较小，因此几乎没有散射光的影响。与此相对，聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径大，散射光的影响明显大。由于上述那样的理由，为了在粒径、颗粒原材料不同的情况下更正确地反映颗粒自身的颜色浓度，本实施方式中，采用使用了积分球的可见吸光度测定。

[0055] 本实施方式的有机着色细颗粒的“显色强度”为1.0～10.0。该值越大，则颗粒的颜色浓度越浓、在用作免疫色谱诊断试剂盒的情况下分析灵敏度越高。值当然越大则越良好，可以采用：利用颜色浓的染料、增加染色次数、借由作为间隔物的某些化合物连接、增加颗粒的非晶区域而使染料容易进入、颗粒形成多孔性而使染料容易渗入等方法。但是若考虑到经济性则上限优选为7.0以下、更优选5.0以下。另外，值越小，则在用作免疫色谱诊断试剂盒的情况下分析灵敏度越降低，因此下限优选为1.5以上、更优选2.0以上。

[0056] 本实施方式的有机着色细颗粒的“球形度”指的是颗粒的长径(L)/短径(D)所示的值，长径(L)和短径(D)的长度接近的形状为接近于球的结构体。本实施方式的有机着色细颗粒的“球形度”(即，L÷D所示的L/D比)为1.0～2.5。若球形度处于该范围外则显色颗粒的形状失真，因此通过硝基纤维素膜的细孔时，颗粒会卡住，因此本底变差。其结果，与TL的对比度变差，因此有可能导致误诊。另外，当然检查的再现性也变差。球形度更优选为1.0～2.2、进一步优选1.0～2.0、最优选1.0～1.5。作为测定方法，拍摄颗粒的电子显微镜图像，测定100个颗粒的长径(L)和短径(D)，算出该100个的平均值。

[0057] 本实施方式的有机着色细颗粒在粒径400nm～12000nm的范围内检测总个数100000个颗粒时，粒径700nm以上的粗大颗粒的存在率为5％以下。

[0058] 在此，“粗大颗粒”指的是，具有一定分布的颗粒中、粒径700nm以上的颗粒。本申请发明人等对于免疫色谱诊断试剂盒中的显色颗粒进行深入研究，结果发现，该粒径700nm以上的粗大颗粒为使硝基纤维素膜的本底变差的主要原因之一。作为理由，简而言之，粒径700nm以上的颗粒堵塞硝基纤维素膜的细孔，因此使本底变差。若该粗大颗粒的存在率超过
5％则本底显著变差，其结果与TL的对比度变差，因此有可能导致误诊。从在免疫色谱诊断试剂盒上展开的观点考虑，粗大颗粒的存在率优选为4.5％以下、更优选4.0％以下。

[0059] 在此，粗大颗粒的比率和平均粒径的％CV乍一看相关，但是判明没有联系。专利文献3中，虽然言及％CV，但是其为通过动态光散射式观测颗粒的布郎运动的样子作为散射光强度的波动并算出得到的值。也就是说，计测的是粒径分布的平均值。另一方面，此次的粗大颗粒的比率利用库尔特计数器式测定。其测定颗粒通过细孔时产生的电极之间的电阻的变化、即利用库尔特计数器式时，可以直接地算出实际的颗粒的尺寸。本申请发明人等通过这种库尔特计数器式进行评价，结果发现，即使是乍一看分布窄(％CV小)的颗粒，也会根据颗粒不同而有可能粗大颗粒的比率超过5％。利用专利文献3中使用的动态光散射式的装置时，对于分布的偏差不能正确地测定，因此本实施方式中，使用基于库尔特计数器式的装置测定这种粗大颗粒。

[0060] “有机着色细颗粒的着色成分的比率”指的是，有机着色细颗粒的总重量中的着色成分的比率。例如由0.2g的纤维素和0.8g的着色成分构成有机着色细颗粒1.0g的情况下，该着色成分的比率为80重量％。有机着色细颗粒的着色成分的比率优选为10～90重量％。若处于该范围内则用作免疫色谱诊断试剂盒的情况下，分析灵敏度高。另外，作为显色颗粒，使用用染料将纤维素染色而成的颗粒的情况下，通过使纤维素保持该范围的染料，可以对于纤维素赋予适当的疏水性，可以通过吸附来保持抗体等与被检出物特异性结合的物质。当然不仅能够通过吸附来保持，而且还能够向着色纤维素颗粒导入羧基、氨基等，通过共价键来保持与被检出物特异性结合的物质。着色成分的比率少的情况下，不能具有充分的显色强度，用作免疫色谱诊断试剂盒的情况下，分析灵敏度降低。另外，作为有机着色细颗粒，使用用染料将纤维素染色而成的颗粒的情况下，通过增加着色成分的比率而与被检出物特异性结合的物质也有可能增加。从这种观点考虑，有机着色细颗粒的着色成分的比率的下限优选为20重量％以上、更优选30重量％以上。即使着色成分的比率超过90重量％也没有特别问题，但是若从经济方面考虑则优选为85重量％以下、更优选80重量％以下。

[0061] 作为“有机着色细颗粒的着色成分的比率的算出方法”，可以由着色前后的重量变化而算出。另外，难以由重量变化算出的情况下，可以进行将着色成分由颗粒分离的操作、将着色成分或颗粒分离来算出。例如将纤维素颗粒用反应性染料染色的情况下，用酸、碱等将纤维素和染料的共价键断裂，通过离心分离将纤维素颗粒回收，由此可以算出。另外，也可以通过使用纤维素酶仅将纤维素分解来算出。

[0062] “有机着色细颗粒的源自纤维素的成分的算出方法”可以由前述有机着色细颗粒的着色成分的比率而计算。即，可以通过“有机着色细颗粒的源自纤维素的成分的比率”＝100％-(有机着色细颗粒的着色成分的比率)的计算式计算。有机着色细颗粒的源自纤维素的成分的比率优选为90～10重量％。若处于该范围内则可以维持纤维素颗粒的分散稳定性。另外，由于前述着色成分的比率中记载的理由，作为有机着色细颗粒的源自纤维素的成分的下限，更优选为15重量％以上、特别优选20重量％以上，上限更优选为80重量％以下、特别优选70重量％以下。

[0063] 作为表示本实施方式的有机着色细颗粒的疏水性亲水性的程度的指标，本实施方式中测定“亲水度”。本说明书中，“亲水度”指的是，表示细颗粒表面的润湿容易程度、即与水的亲和性的指标。

[0064] 本实施方式的有机着色细颗粒的亲水度优选处于1.0～30.0的范围内。若亲水度处于该范围内则颗粒表面为疏水性，因此蛋白质、抗体等对有机着色细颗粒表面的吸附量增加。纤维素为亲水性，通常难以吸附蛋白质、抗体，因此为了吸附蛋白质、抗体，需要对颗粒的表面进行疏水化。反过来说，通过以该指标控制疏水化的程度，对于吸附量也可以同样地控制。也就是说，免疫色谱诊断试剂盒中，可以制作再现性优异的有机着色细颗粒。专利文献3中，对于该指标没有任何管理，有可能示出再现性欠缺的数据。若亲水度为30.0以上则细颗粒表面形成亲水性，因此在细颗粒表面，蛋白质、抗体等的吸附受到抑制，成为灵敏度降低或者再现性欠缺的结果。另外，若不足1.0则疏水性过强，吸附于硝基纤维素膜而使本底变差。从以上观点考虑，亲水度的上限更优选为27.0、进一步更优选25.0。另一方面，亲水度的下限更优选为1.5、进一步更优选2.0。

[0065] 在细颗粒着色中使用的反应性染料含有F元素的情况下，在本实施方式的有机着色细颗粒表面残留F元素。本实施方式的有机着色细颗粒中，通过利用X射线光电子能谱分析法(XPS)的测定所算出的颗粒表面的F元素的相对元素浓度优选为0.1atomic％以上。若F元素的相对元素浓度处于该范围内则有机着色细颗粒表面吸附蛋白质、抗体时，令人惊讶的是灵敏度和再现性改善。本实施方式的有机着色细颗粒表面的F元素的相对元素浓度的下限优选为0.2atomic％以上、进一步优选0.3atomic％以上。

[0066] 含有本实施方式的有机着色细颗粒作为要素的“免疫色谱诊断试剂盒”指的是，利用抗原抗体反应而简便地检出各种检样中的检查对象物质的有无的试剂盒。作为该诊断试剂盒的种类，存在侧向流动式、渗滤式。若使用显色颗粒(有机着色细颗粒)、样品垫则没有特别限定，但是优选为侧向流动式。另外，侧向流动式之中，存在浸渍(dipstick)类型和卡盒(cassette)类型，但是对于这些类型没有特别限定。对于诊断试剂盒的结构没有特别限定，若为该领域中通常使用的结构则可以为任意一种。含有抗体致敏显色颗粒的结合垫(b)和样品垫(a)以外的构件的种类，若为该领域中使用的构件则没有特别限定，可列举出例如图1所示的(e)色谱介质、(f)吸收垫和(g)衬纸。另外，根据需要可以将这些构件省略一部分。作为结构的例子，可列举出专利文献1的图1中记载那样的结构。本说明书中附的图1仅为示例，对本实施方式没有任何限定。

[0067] 如图1中(a)所示，“样品垫”指的是，免疫色谱中最初接收作为测定对象的检样的部分。作为通常的样品垫，可列举出纤维素滤纸、纸、玻璃纤维、玻璃纤维(glass fiber)、丙烯酸类纤维、尼龙纤维、各种织物等。

[0068] 为了控制样品垫的亲水/拒水性、吸水倍率，若处于不会对于上述物性造成不良影响、不会对于抗原抗体反应、抗体的稳定性造成影响的范围内则可以在由再生纤维素系纤维形成的无纺布含有各种药剂、粉体或者将纤维素的一部分衍生物化。作为所浸渗的药剂的一例，可列举出表面活性剂、蛋白质、抗体、树脂、水溶性高分子、抗菌剂、防腐剂、抗氧化剂等。另外，作为纤维素的衍生物化的一例，可列举出羧基甲基化、羧基乙基化、伯氨基化、仲氨基化、叔氨基化、季氨基化、氧基化等。

[0069] 样品垫可以根据需要进行前处理。例如可以进行预先含有缓冲液、表面活性剂、蛋白质、捕捉检样试样中的夹杂物的试剂、防腐剂、抗菌剂、抗氧化剂、吸湿剂等的处理。另外，对于样品垫的形状没有特别限定，例如作为样品垫的尺寸，若考虑到由检样液的相结合性、诊断时间则长度(液体流动的长度)优选为10～25mm左右，宽度(相对于液体流动的垂直方向)若大于结合垫的宽度则没有问题。若宽度过窄则检查液有可能由样品垫的端部回渗。

[0070] “结合垫”指的是，包含含有显色颗粒(有机着色细颗粒)的复合物的垫，例如含有跟与检查对象物质结合的抗体结合了的显色颗粒者。作为结合垫的原材料，没有特别限定，可以使用通常的玻璃纤维或树脂纤维等。作为树脂纤维，可以合适地使用聚乙烯等聚烯烃系、聚酯系、聚酰胺系、丙烯酸类等树脂纤维、以及这些树脂纤维的复合纤维，但是不限定于它们。若从作业环境考虑则优选为树脂纤维制。树脂纤维制之中，若从显色颗粒的释放的容易程度的观点考虑，则更优选为某种程度的疏水性的原材料。疏水性过高的情况下，可以用表面活性剂等进行前处理来使用。更优选用表面活性剂对于聚乙烯纤维制的结合垫进行前处理而得到的结合垫。

[0071] 使用本实施方式的免疫色谱诊断试剂盒的“诊断方法”指的是，使用免疫色谱诊断试剂盒进行的各种诊断。对于诊断对象没有特别限定，可以用于人用、动物用、食品用、植物用、其它环境检查等各种诊断对象的检查。通常的诊断步骤中，由检查对象采集检样试样，根据需要对其进行抽提、过滤等前处理，滴加到样品垫，由检查开始等待规定时间，根据有无检查对象物质而不同的显色来判断诊断结果。当然不限于这种步骤，也可以用于相同的步骤、原理的诊断。优选的是，通过将检样试样预先过滤，可以去除多余的异物、夹杂物，由此可以期待诊断的进一步迅速化、诊断精度改善。

[0072] 本实施方式中，除了将检样直接滴加于样品垫的方法以外，还可以滴加稀释处理物，所述稀释处理物是用预先调整到规定组成的检样处理液对检样稀释处理到任意倍率而成的。作为使用检样处理液的目的，可列举出：用于容易与检样中的抗原等反应的成分；将检样中的夹杂物分解的成分；捕捉检样中的夹杂物的成分；抑制非特异性反应的成分；容易流动显色颗粒的成分；使显色颗粒适当聚集、改善被测试线捕捉时的可见性的成分等的添加。作为一例，可以添加缓冲液、表面活性剂、蛋白质、无机盐、水溶性高分子、还原剂、螯合剂等。特别是使用本申请发明那样的显色颗粒的情况下，优选添加非离子性表面活性剂、各种水溶性氨基酸、蛋白质、无机盐、水溶性高分子等。具体的成分的种类、添加量根据检查对象、所使用的抗体的种类不同而不同，作为非离子性表面活性剂的一例，可列举出：聚(氧化亚乙基)烷基醚、聚(氧化亚乙基)辛基苯基醚、聚(氧化亚乙基)壬基苯基醚等。作为水溶性氨基酸的一例，可列举出天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、谷酰胺、谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸等。作为蛋白质的一例，可列举出酪蛋白、脱脂乳、酪蛋白分解物、牛血清白蛋白、鱼明胶等。作为无机盐，优选为产生钠、钾、锂等碱金属离子的化合物。作为水溶性高分子，优选为聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素、其它纤维素衍生物等。另外，这些成分不仅可以预先加入到检样处理液，还可以预先加入到样品垫、结合垫、色谱介质(硝基纤维素膜)等。

[0073] 对于可以利用免疫色谱诊断试剂盒诊断的对象没有特别限定，作为具体例，可列举出以下的例子：癌标记物、激素、感染症、自身免疫、血浆蛋白、TDM、凝血/纤溶、氨基酸、肽、蛋白、基因、细胞等。更具体而言，CEA、AFP、铁蛋白(ferritin)、β2微球蛋白、PSA、CA19-9、CA125、BFP、弹性蛋白酶1、胃蛋白酶原1·2、便潜血、尿β2微球蛋白、PIVKA-2、尿BTA、胰岛素、E3、HCG、HPL、LH、HCV抗原、HBs抗原、HBs抗体、HBc抗体、HBe抗原、HBe抗体、HTLV-1抗体、HIV抗体、HIV抗原、HIV病毒基因、弓形虫抗体、梅毒、ASO、甲型流感抗原、甲型流感抗体、乙型流感抗原、乙型流感抗体、轮状抗原、腺病毒抗原、轮状/腺病毒抗原、A群链球菌、B群链球菌、念珠菌抗原、CD菌、隐球菌抗原、霍乱弧菌、脑膜炎球菌抗原、粒细胞弹性蛋白酶、幽门螺杆菌抗体、O157抗体、O157抗原、钩端螺旋体抗体、曲霉抗原、MRSA、RF、总IgE、LE test(狼疮试验)、CRP、IgG,A,M、IgD、转铁蛋白、尿白蛋白、尿转铁蛋白、肌红蛋白、C3·C4、SAA、LP(a)、α1-AC、α1-M、触珠蛋白、微量转铁蛋白、APR评分、FDP、D二聚体、血纤维蛋白溶酶原、AT3、α
2PI、PIC、PAI-1、蛋白C、凝血因子X3、IV型胶原、透明质酸、GHbA1c、其它各种抗原、各种抗体、各种病毒、各种细菌、各种氨基酸、各种肽、各种蛋白质、各种DNA、各种细胞、各种过敏原、各种农药残留、各种有害物。

[0074] 显色颗粒(有机着色细颗粒)需要负载抗体等与被检出物特异性结合的物质，对于该负载方法没有特别限定。例如可列举出：利用物理吸附进行的负载、利用共价键进行的负载、利用它们的组合进行的负载等。对于所负载的物质的种类、量也没有特别限定。作为所负载的物质的种类，抗体是最通常且优选的。另外，作为进行负载的方法，从容易程度的观点考虑，优选为利用物理吸附进行的负载，从稳定性、性能等观点考虑，优选为利用共价键进行的负载。

[0075] 对于免疫色谱诊断试剂盒中使用的色谱介质没有特别限定，可以使用通常使用的各种色谱介质。更具体而言，可列举出硝基纤维素膜。市售品的硝基纤维素膜根据被称为流动速率的移动固定距离所需的时间而进行分类，该流动速率越快的膜则孔径越大。本发明中，孔径大的膜由于检样移动快、显色颗粒也不易堵塞而优选。作为具体的流动速率，优选为比180sec/4cm快的膜。

[0076] 以下记载作为有机着色细颗粒的纤维素颗粒的制作方法、纤维素颗粒的着色方法、免疫色谱诊断试剂盒的制作方法等的一例，当然本发明不应该受它们任何的限定。

[0077] [纤维素颗粒的制作方法]

[0078] 将纤维素短绒溶解于纤维素的良溶剂。本发明中，作为良溶剂，使用利用公知方法制造的铜氨溶液。而且，作为凝固液，主要使用有机溶剂+水+氨混合系。将该凝固液搅拌的同时加入所预先制造好的铜氨纤维素溶液进行凝固。

[0079] 在此，要点在于，将铜氨纤维素溶液预先在空气存在下培养，调整铜氨纤维素溶液中的纤维素的平均聚合度。若没有调整纤维素的平均聚合度(DP)则粒径700nm以上的粗大颗粒的比率不会为5％以下。因此，本实施方式中，铜氨纤维素溶液中的纤维素的平均聚合度(DP)调整为50～400。若平均聚合度不足50则难以形成颗粒形状，不会形成目标的球形度。另一方面，若平均聚合度(DP)超过400则粗大颗粒量增多，在免疫色谱中使用时，产生展开不良、本底变差。其结果，与TL的对比度变差，因此有可能导致误诊。作为平均聚合度(DP)的下限，从颗粒形成的观点考虑优选为60以上、进一步优选70以上。从抑制粗大颗粒产生的观点考虑，作为上限，优选为350以下、更优选300以下。

[0080] 纤维素的平均聚合度指的是，用乌式粘度计测定将纤维素细颗粒溶解于氢氧化镉乙二胺(Cadoxen)而成的稀纤维素溶液的比粘度，由其特性粘度数[η]，利用参考文献：Eur.Polym.J.,1,1(1996)中记载的以下粘度式和换算式而算出的值。

[0081] 粘度式：[η]＝3.85×10-2×MW0.76

[0082] 换算式：DP＝MW/162

[0083] 凝固后，加入硫酸进行中和、再生，由此可以得到含有目标的纤维素颗粒的浆料。此时，浆料由于再生中使用的酸的残留而为酸性，还含有中和中产生的铵盐等杂质，因此需要对包含纤维素颗粒和介质的纤维素分散液进行纯化的操作。本实施方式中，作为该纯化操作，反复使用离心分离-倾析-利用分散介质液体进行的稀释处理。所得到的纤维素颗粒分散液中的纤维素颗粒在纯化操作的过程中也有可能聚集，因此此时可以进行利用剪切等的分散处理。本实施方式中，作为施加剪切的手段，使用高压均化器。

[0084] [纤维素颗粒的着色方法]

[0085] 在所得到的纤维素颗粒的浆料中加入高浓度的氢氧化钠水溶液后，加入具有嘧啶结构或三嗪结构的反应性染料，边用磁力搅拌器进行搅拌边在恒温槽升温到规定温度。经过规定时间后，可以得到含有目标的染色纤维素颗粒的浆料。通过经过该工序，可以将各颗粒分别均匀地染色，因此专利文献3中得到的颗粒具有不规则的轮廓或者表面形成锯齿状，但是本实施方式中得到的颗粒的不规则的轮廓、表面的锯齿状得到大幅改善，球形度变得格外良好。发现若通过利用前述反应性染料的染色方法进行染色则可以好像涂覆颗粒整体表面那样地染色。另外同时可知，利用该方法时，有可能由于各颗粒被均匀涂覆，粒径均匀地变大，即可以抑制粒径极大的颗粒的产生。另外可知在颗粒表面也残留F元素。与此相对，专利文献3中，使用碳酸钠而非高浓度的氢氧化钠进行染色，但是与氢氧化钠相比，碳酸钠由于纤维素的溶胀力弱，因此仅容易溶胀的颗粒的最表面溶胀而与反应性染料反应，因此从颗粒整体看，没有产生均匀的反应。另外，专利文献3中，暂时染色之后，用氢氧化钠清洗，因此可见一部分染料的离去反应，更加失去表面的均匀性。如此，专利文献3中，先前所述的染料的表面涂覆不均匀，得不到可以令人满意的球形度，另外亲水性的纤维素也在表面露出，因此不能降低亲水度。进而可知若使用碳酸钠进行染色则有可能由于从不均匀且表面积大、即粒径大的颗粒染色，粗大颗粒的量也增加。另外，由于屡次用碱清洗，因此导致颗粒表面的F元素也离去。因此，本申请发明人等采用使用可以从颗粒的芯直至表面为止将各颗粒整体均匀地染色的高浓度的氢氧化钠的染色方法。其结果，可以将颗粒用染料均匀地染色，颗粒的球形度格外改善，使亲水度降低，可以减少粗大颗粒。

[0086] 进而通过使用反应性高、作为耐碱性染料的具有嘧啶结构或三嗪结构的反应性染料在高浓度的氢氧化钠存在下染色，可以将颗粒均匀染色，可以大幅降低亲水度。

[0087] 接着利用离心分离进行纯化，得到染色纤维素颗粒分散液。所得到的染色纤维素颗粒分散液中的纤维素颗粒在纯化操作过程中也有可能聚集，因此此时可以进行利用剪切等的分散处理。本实施方式中，作为施加剪切的手段，使用高压均化器。然后测定所得到的着色纤维素颗粒的各种物性。

[0088] [免疫色谱诊断试剂盒的制作方法]

[0089] 准备调整到了规定浓度的着色纤维素颗粒的分散液，加入缓冲液、抗体，边进行温度调整边搅拌一定时间，使抗体吸附于着色纤维素颗粒。搅拌一定时间后，进而加入封闭剂边进行温度调整边搅拌一定时间，由此进行着色纤维素颗粒的封闭。在此，所称的封闭指的是，将单纯颗粒、或负载有抗体、抗原的颗粒等涂覆的操作。作为封闭剂，可以根据检查对象物质、检样或稀释其的溶液的组成等使用各种封闭剂。酪蛋白对于着色纤维素颗粒的封闭而言特别优选。此时，酪蛋白涂覆负载有抗体的着色纤维素颗粒中的抗体和着色纤维素颗粒的表面。为了将抗体吸附和封闭后的着色纤维素颗粒清洗，进行离心分离，将含有多余的抗体和封闭剂的上清液与沉降了的颗粒分离，通过倾析而去除上清液。向沉降了的颗粒中加入缓冲液等液体，根据需要利用超声波等进行分散处理。通过这种利用离心分离的沉降、上清液去除、液体的添加这一系列的操作进行的清洗进行必要次数，制造含有规定浓度的进行了抗体吸附和封闭的颗粒的分散液。向该分散液中根据需要加入蛋白质、表面活性剂、蔗糖、海藻糖等糖，将所得到的溶液以一定量涂布于聚乙烯制的结合垫，并进行干燥，调整含有检出试剂的部分。另外在再生纤维素连续长纤维无纺布中根据需要涂布缓冲液、表面活性剂、蛋白质、捕捉检样试样中的夹杂物的试剂、防腐剂、抗菌剂、抗氧化剂、吸湿剂等，并进行干燥，制造样品垫。进而在规定位置制造固定化了抗体的硝基纤维素多孔膜制的色谱介质、用于吸收检样的纤维素滤纸制的吸收垫。将它们固定化于被称为背衬片的具有粘接部位的衬纸，裁断为规定尺寸，由此制作免疫色谱诊断试剂盒。

[0090] 实施例

[0091] 以下通过实施例对于发明进行具体说明，但是本发明不仅限于这些实施例。另外，只要没有特别记载，则全部操作均在温度23℃、相对湿度55％RH的环境下进行。实施例中，使用以下的测定、算出方法。

[0092] [纤维素细颗粒的平均聚合度的测定]

[0093] 纤维素的平均聚合度(DP)如前文所述指的是，用乌式粘度计测定将纤维素细颗粒溶解于氢氧化镉乙二胺而成的稀纤维素溶液的比粘度，由其特性粘度数[η]，利用参考文献：Eur.Polym.J.,1,1(1996)中记载的以下粘度式和换算式而算出的值。

[0094] [η]＝3.85×10-2×MW0.76

[0095] DP＝MW/162

[0096] [显色颗粒的平均粒径的测定]

[0097] 作为装置，使用日机装株式会社制的Nanotrac粒度分布测定装置UPA-EX150(动态光散射式)。作为测定样品，使用着色有机细颗粒(显色颗粒)0.01重量％、纯水99.99重量％的样品。作为测定条件，累积次数设为30次、每1次测定的测定时间设为30秒、使用体积平均的粒径分布、将其中值粒径作为平均粒径。另外，使用通过30次的累计得到的粒度分布的标准偏差和平均粒径而算出CV值。

[0098] [显色颗粒的显色强度的测定]

[0099] 作为装置，使用在日本分光株式会社制的紫外可见近红外分光光度计JASCOV-650(光学系统：单色器、却尔尼-特纳装置、双光束方式光源：氘灯(190～350nm)、卤素灯(330～900nm))上安装日本分光株式会社制的积分球单元ISV-722而成的装置。对于所测定的样品，使用蒸馏水作为分散介质，以成为显色颗粒0.01重量％、纯水99.99重量％这样浓度的方式，将任意浓度的显色颗粒的水分散液或干燥颗粒进行调整而得到的样品。将该经调整浓度的水分散液2.5mL加入到光路长10mm的石英皿(容量：3.5mL光路宽度：10mm)，将该石英皿安装于紫外可见近红外分光光度计的样品夹，然后实施测定。所得到的吸光度峰中、400～800nm可见光范围的最大值(ABS)作为显色强度。

[0100] [显色颗粒的着色成分的比率的算出]

[0101] 由进行了规定次数的着色操作后的显色颗粒的重量和着色前的颗粒的重量计算来算出。例如将1.0g的纤维素颗粒着色而得到2.5g的着色纤维素颗粒时的着色成分以2.5g-1.0g＝1.5g计算。此时的着色成分的比率为1.5g÷2.5g×100＝60.0重量％。

[0102] [显色颗粒的源自纤维素的成分的比率的算出]

[0103] 如前文所述，通过“显色颗粒的源自纤维素的成分的比率”＝100％-(显色颗粒的着色成分的比率)的计算式而计算。

[0104] [显色颗粒的球形度的测定]

[0105] 作为装置，使用日本电子株式会社制的扫描电子显微镜JSM-6700。将显色颗粒0.01重量％、纯水99.99重量％的样品滴加到云母板，经过10秒，由此使显色颗粒吸附于云母板上，用KimWipes吸取多余的液体进行干燥。用铂涂覆所得到的云母板，制造电子显微镜测定用的样品。以加速电压1.6kV、测定倍率5万倍进行观测，以颗粒图像为100个以上的方式拍摄必要张数的图像，测定各颗粒的长径(L)和短径(D)，算出颗粒100个的L/D的平均值。

[0106] [显色颗粒中的粗大颗粒的比率的算出]

[0107] 装置为BECHMANCOULTER公司制的Multisizer4(库尔特计数器式)，孔径(aperture)使用AP20进行测定。需要说明的是，电解液同样地使用BECHMANCOULTER公司制的ISOTONII-PC稀释液(氯化钠7.93g/L、氟化钠0.30g/L、商品编号：8546719)。作为测定样品，使用显色颗粒1.00重量％、纯水99.00重量％的样品。首先向200mL烧杯加入100mL的ISOTON II稀释液。向该烧杯进一步以ISOTONII-PC稀释液中的显色颗粒浓度为5％左右的方式加入显色颗粒。利用Multisizer4附属的搅拌器搅拌的同时进行测定。作为测定条件，在400nm～12000nm的范围内，检测颗粒的总个数为100000个的颗粒，由此时的粒径700nm以上的颗粒的个数(A)，利用以下式子算出粗大颗粒的存在率(X)。

[0108] 粗大颗粒的存在率(X)(％)＝{粒径700nm以上的颗粒的个数(A)/100000}×100[0109] 例如100000个中、粒径700nm以上的颗粒存在7000个的情况下，为7.0％。详细的操作条件如以下所示。

[0110] ·孔径电流值：800μA

[0111] ·校正系数Kd：29.764

[0112] ·增幅率：4

[0113] ·测定粒径范围：400nm～12000nm

[0114] ·测定颗粒个数：100000个

[0115] ·测定时的ISOTONII-PC稀释液中的显色颗粒浓度：5％

[0116] [显色颗粒的亲水度的测定]

[0117] 亲水度通过脉冲NMR法测定。脉冲NMR法为对于细颗粒分散液照射射频波而使水分子的质子激发后，测定直至恢复为基态为止的时间(弛豫时间)的分析手法。吸附于细颗粒表面的水分子由于运动性受限，因此弛豫时间短，体相(bulk)水分子(没有与细颗粒表面吸附的水分子)由于运动性限制少、可以自由运动，因此弛豫时间长。因此，通过脉冲NMR法得到的细颗粒分散液的弛豫时间根据吸附于细颗粒表面的水分子和体相水分子的比率而变化。即，细颗粒表面的亲水性越高则可以吸附更多的水分子，因此弛豫时间缩短。

[0118] 脉冲NMR的测定使用Bruker公司制的Minispecmq20装置。将浓度1％(wt/vol)的细颗粒分散液搅拌后，将0.5mL转移到外径10mm的玻璃制NMR管，设置于被设定为30℃的脉冲NMR装置，各种参数如以下所述设定进行测定。

[0119] ·观测核：1H

[0120] ·所测定的弛豫时间：横向弛豫时间T2(ms)

[0121] ·测定模式：CPMG法

[0122] ·累积次数：32次

[0123] ·循环延迟时间(RecycleDelay)：10(s)

[0124] ·90°-180°脉冲间隔(PulseSeparation)(τ)：2(ms)

[0125] ·总回波采集数(TotalNumberofAcquiredEchoes)：2000点。

[0126] 使用MicrosoftExcel的指数近似功能利用最小二乘法通过下述式(1)拟合所得到的磁化衰减曲线(表示磁化强度的经时变化的曲线)：

[0127] M(t)＝M0·exp(-t/T2)…式(1)

[0128] {式中，M(t)：某时间t时的信号强度、M0：信号强度的初期值、T2：弛豫时间。}。式(1)的T2为弛豫时间。

[0129] 为了由所测定的弛豫时间(T2)算出亲水度，准备纵轴绘制弛豫时间的变化比率(Rsp值)、横轴绘制细颗粒的总表面积值(TSA值)的图，利用最小二乘法制成近似直线，作为其斜率求出亲水度。

[0130] ·Rsp值的计算方法

[0131] Rsp值＝Rav÷Rb-1

[0132] {式中，Rav：平均弛豫时间常数(试样的弛豫时间倒数)、Rb：体相水分子的弛豫时间常数(空白水的弛豫时间倒数)。}。

[0133] ·TSA值(m2)的计算方法

[0134] TSA值＝SA×V×Ψp×ρ

[0135] {式中，SA：细颗粒的比表面积(m2/g)＝6÷(ρ×d)，在此，ρ：细颗粒密度(g/cm3)(在此，纤维素细颗粒密度：1.4g/cm3、胶乳颗粒密度：1.0g/cm3、胶体金颗粒密度：19.3g/cm3)、d：细颗粒直径(μm)、V：照射射频波的部分的NMR管体积(cm3)(≒试样量)、Ψp：细颗粒体积比(在此，细颗粒体积(i)＝细颗粒浓度(wt％)÷100÷细颗粒密度(ρ：同上)、水的体积(ii)＝(1-细颗粒体积(i))÷水的密度(0.997g/cm3)、Ψp(细颗粒体积比)＝细颗粒体积(i)÷水的体积(ii)}。

[0136] 例如，如图2所示，将A细颗粒(TSA值0.5、Rsp值10)和B细颗粒(TSA值1、Rsp值5)的数值绘制于图，通过最小二乘法制成各自的近似直线。A细颗粒的情况下为Y＝20x、B细颗粒的情况下为Y＝5x。近似直线的斜率(亲水度)大的情况，即A细颗粒的情况，判定为亲水度大。

[0137] [显色颗粒的颗粒表面的F元素的相对元素浓度的测定]

[0138] 显色颗粒的颗粒表面的F元素的相对元素浓度通过XPS测定。将显色颗粒载置于1.5mmΦ×0.2mmt的皿型试样台，通过以下条件实施XPS测定。XPS测定使用Thermo FisherESCALAB250通过以下条件实施。

[0139] 激励源：单色化A1Kα15kV×10mA

[0140] 分析尺寸：约1mm(形状为椭圆)

[0141] 光电子引进角：0°(分光器的轴与试样面垂直)

[0142] 引进区域

[0143] 全谱扫描(Surveyscan)：0～1100eV

[0144] 窄谱扫描(NarrowScan)：C1s、N1s、S2p、O1s、Na1s、F1s、Si2p、Cl2p[0145] 通能(PassEnergy)

[0146] SurveyScan：100eV

[0147] NarrowScan：20eV

[0148] 由通过本测定得到的C1s、N1s、S2p、O1s、Na1s、F1s、Si2p、Cl2p的面积强度、和各峰的相对灵敏度系数(C1s:1.00、N1s:1.68、S2p:1.98、O1s:2.72、Na1s:10.2、F1s:4.67、Si2p:0.93、Cl2p:2.285)，使用以下式子求出F元素的相对元素浓度([F])：

[0149] [F](atomic％)＝100×(IF1s/RSFF1s)/(ΣIj/RSFj)

[0150] {式中，IF1s:F1s的面积强度(eV·cps)、RSFF1s：F1s的相对灵敏度系数、Ij：C1s、N1s、S2p、O1s、Na1s、F1s、Si2p、Cl2p的面积强度(eV·cps)、RSFj：C1s、N1s、S2p、O1s、Na1s、F1s、Si2p、Cl2p的相对灵敏度系数。}

[0151] [免疫色谱诊断试剂盒的诊断时间和再现性的测定]

[0152] 将切割为5mm宽度的免疫色谱诊断试剂盒装入到塑料的壳体。对于所得到的装入壳体的诊断试剂盒，使用Hamamatsu Photonics K.K.制的免疫色谱读取器C10066-10测定。根据所使用的颗粒的颜色进行装置的设定。检查对象物质使用人绒毛膜促性腺激素(以下称为“hCG”)，将hCG利用含有1重量％的牛血清白蛋白(以下称为“BSA”)的66mM、PH7.4的磷酸盐缓冲液(以下称为“PBS”)稀释，制造hCG浓度为10mIU/ml的阳性检样。将该阳性检样120μl滴加到诊断试剂盒的样品滴加部，以后每20秒用免疫色谱读取器进行测定，进行TL的显色时间的测定。在此，设为每20秒的理由在于，测定1次需要近20秒。测定利用免疫色谱读取器得到的TL的显色强度(单位为mABS)为20mABS以上的时间。在此，设为20mABS的理由在于，虽然存在个体差异，但是若为20mABS以上则即使肉眼也可以确认TL的存在。该测定进行20次，所得到的值的平均值作为诊断时间、其标准偏差作为诊断时间标准偏差。表示再现性的指标％CV通过下述式算出：

[0153] ％CV＝{诊断时间标准偏差/诊断时间}×100。

[0154] [免疫色谱诊断试剂盒的灵敏度和再现性的测定]

[0155] 同样地将120μl的阳性检样滴加到诊断试剂盒的样品滴加部，经过15分钟后的TL的显色强度利用免疫色谱读取器测定。该测定进行20次，所得到的值的平均值作为TL强度、其标准偏差作为TL强度标准偏差。表现再现性的指标％CV利用下述式算出：

[0156] ％CV＝{TL强度标准偏差/TL强度}×100。

[0157] [免疫色谱诊断试剂盒的本底的判定]

[0158] 同样地将120μl的阳性检样滴加到诊断试剂盒的样品滴加部，经过15分钟后的TL的2mm上游侧的本底强度和2mm下游侧的本底强度利用免疫色谱读取器测定。其平均值作为本底强度。

[0159] [免疫色谱诊断试剂盒的假阳性的测定]

[0160] 调整含有1重量％BSA的66mM、pH7.4的PBS，制造阴性检样。将120μl的阴性检样滴加到诊断试剂盒的样品滴加部，经过15分钟后的TL的显色强度利用免疫色谱读取器测定。进行该测定5次，若所得到的值的平均值为5mABS以下则判断没有假阳性。在此，设为5mABS的理由在于，虽然存在个体差异，但是若为5mABS以下则肉眼不能确认TL的存在。

[0161] [免疫色谱诊断试剂盒的检测限的测定]

[0162] 制造将hCG浓度阶段性地稀释为3.20mIU/ml、1.60mIU/ml、0.80mIU/ml、0.40mIU/ml、0.20mIU/ml、0.10mIU/ml、0.05mIU/ml、0.025mIU/ml而成的阳性检样。与前述同样地，将120μl滴加到诊断试剂盒的样品滴加部，利用免疫色谱读取器测定经过15分钟后的TL的显色强度。该测定在各浓度下进行5次，所得到的值的平均值为测定阴性检样时的值+20mABS以上的情况下判定为阳性、测定阴性检样时的值+20mABS以下的情况看作检测限以下。得到该阳性判定的下限的hCG浓度作为检测限。

[0163] [实施例1]

[0164] 利用以往公知的方法，制造纤维素浓度0.37wt％、铜浓度0.13wt％、氨浓度1.00wt％的铜氨纤维素溶液。将所得到的铜氨纤维素溶液在空气存在下缓慢搅拌，用12小时调整聚合度。进而制造四氢呋喃浓度89.00wt％、水浓度11.00wt％的凝固液。使用磁力搅拌器将凝固液5000g缓慢搅拌的同时添加所制造的铜氨纤维素溶液500g。继续5秒左右搅拌后，加入10wt％的硫酸1000g进行中和、再生，得到含有纤维素细颗粒的浆料6500g。

[0165] 将所得到的浆料以10000rpm的速度离心分离10分钟。通过倾析而取出沉淀物，注入蒸馏水进行搅拌，再次离心分离。重复该操作数次直至pH为6.0～7.0为止，然后，利用高压均化器进行分散处理，得到纤维素细颗粒分散液150g。测定所得到的纤维素细颗粒的平均粒径，结果为261nm。需要说明的是，测定该细颗粒的聚合度，结果为110。

[0166] 接着，进行如前文所述制造的纤维素细颗粒的染色。对于细颗粒浓度调整为1.00wt％的纤维素细颗粒分散体100g，加入硫酸钠30g、具有三嗪结构的反应性染料(DyStar Ltd.制LevafixRedCAGR.(注册商标))1.00g，进行搅拌的同时使用恒温槽升温至
60℃。升温到60℃后加入氢氧化钠10g，进行2小时染色。将所得到的粗着色细颗粒用去离子水清洗，通过离心分离来回收，然后再通过离心分离来回收这系列操作作为1次循环，实施同样的操作直至总计5次循环为止，得到着色纤维素细颗粒。该细颗粒的平均粒径为352nm、CV值为21％、显色强度为2.9ABS、着色成分的比率为49％、球形度为1.2、粗大颗粒为1.4％。
所得到的着色纤维素细颗粒的电子显微镜图像如图3所示。

[0167] [抗体致敏着色纤维素颗粒的制造]

[0168] 将用已知方法制造的1.0重量％的着色纤维素颗粒1(平均粒径352nm、显色强度2.9ABS、着色成分的比率49％、球形度为1.2、粗大颗粒的比率1.4％)60μl加入到15ml的离心管，进而加入Tris缓冲液(10mM、pH7.0)540μl、0.1％的抗hCG-α小鼠抗体(Fitzgerald公司制、10-C25C)60μl，利用涡流搅拌10秒。接着装入到调整于37℃的干燥机内静置120分钟。
接着加入含有1.0重量％的酪蛋白(和光纯药工业株式会社制、030-01505)的封闭液(100mM硼酸、pH8.5)7.2ml，进而在37℃的干燥机内静置60分钟。接着使用离心分离机(KUBOTA Corporation co.,ltd.制、6200)和离心分离转子(KUBOTA Corporation co.,ltd.制、AF-
5008C)，进行10000g的离心15分钟，使致敏颗粒沉降后去除上清液。接着加入硼酸缓冲液(50mM硼酸、pH10.0)7.2ml，用超声波分散机(SMT CO.,LTD.制、UH-50)处理10秒。接着进行
10000g的离心15分钟，使致敏颗粒沉降后去除上清液。另外，另行使用蔗糖(和光纯药工业株式会社制、196-00015)1.8g和1.0重量％的酪蛋白封闭液2.4g溶解于硼酸缓冲液(50mM硼酸、PH10.0)7.2ml而得到的缓冲液，将致敏颗粒的分散液的重量调整为1.58g，调整0.038重量％的抗体致敏着色纤维素颗粒分散液，用超声波分散机处理10秒。

[0169] [抗体致敏着色纤维素颗粒对结合垫的浸渗、干燥]

[0170] 将聚乙烯制结合垫(Pall公司制、6613)浸渍于大大过量的0.05重量％的Tween-20(注册商标、Sigma-Aldrich公司制、T2700)，去除多余的液体后在50℃下干燥60分钟。接着切割为高度10mm、长度300mm的形状。接着使用微量移液管均等涂布0.038重量％的抗体致敏着色纤维素颗粒分散液780μl，50℃下干燥60分钟。

[0171] [样品垫的前处理]

[0172] 将用已知方法调整的纤维素制样品垫(Millipore公司制、C083)浸渗于大大过量的含有2.0重量％的BSA(Sigma-Aldrich公司制、A7906)和2.0重量％的Tween-20的PBS缓冲液(66mM、PH7.4)，去除多余的液体后在50℃下干燥60分钟，将其切割为高度20mm、长度300mm的形状。

[0173] [涂布捕捉抗体的硝基纤维素膜的制造]

[0174] 将硝基纤维素膜(Millipore公司制、SHF0900425)切割为高度25mm、长度300mm的形状。使用液体涂布装置(Musashi engineering CO.,LTD制、300DS)，将含有0.1重量％抗hCG-β小鼠抗体(MedixBiochemica公司制、6601)的PBS溶液(66mM、pH7.4)以0.1μl/mm的比率涂布于高度7mm的部分。接着将含有0.1重量％的抗小鼠-兔抗体(Daco公司制、Z0259)的PBS溶液(66mM、pH7.4)以0.1μl/mm的比率涂布于高度12mm的部分，接着在37℃下干燥30分钟。

[0175] [免疫色谱诊断试剂盒的制造]

[0176] 在衬垫卡片(AdhesivesResearch公司制、AR9020)以图1所示的设计贴合所调整的涂布捕捉抗体的硝基纤维素膜、吸收垫(Millipore公司制、C083)、含有抗体致敏着色纤维素颗粒的结合垫、再生纤维素连续长纤维无纺布样品垫，接着利用裁断机切割为5mm的宽度，得到宽度5mm、高度60mm的免疫色谱诊断试剂盒。

[0177] [免疫色谱诊断试剂盒的性能评价]

[0178] 评价所得到的免疫色谱诊断试剂盒的性能。结果如以下的表1所示。

[0179] [实施例2～6]

[0180] 将纤维素细颗粒调整为以下的表1中记载的聚合度，除此之外利用与实施例1相同的方法制作显色颗粒，制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表1所示。

[0181] [实施例7～9]

[0182] 使用具有嘧啶结构的反应性染料(DyStar Ltd.制LevafixRubineCAGR.(实施例7、注册商标)、DyStar Ltd.制LevafixNavyBlueE-BNACAGR.(实施例8、注册商标)、DyStarLtd.制LevafixNavyCA GR.(实施例9、注册商标))将纤维素细颗粒染色，除此之外利用与实施例1相同的方法制作显色颗粒，制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表1所示。

[0183] [实施例10～13]

[0184] 调整纤维素细颗粒的制造条件制造以下的表1中记载的粒径的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表1所示。

[0185] [实施例14～18]

[0186] 调整显色颗粒的制造条件，制造以下的表1中记载的显色强度的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表1所示。

[0187] [实施例19～22]

[0188] 混合显色颗粒，制作以下的表1中记载的粗大颗粒比率的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表1所示。

[0189] [实施例23、24]

[0190] 混合显色颗粒，制作以下的表1中记载的CV值和粗大颗粒比率的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表1所示。

[0191] [比较例1、2]

[0192] 将纤维素细颗粒调整为以下的表2中记载的聚合度、进而调整凝固液的四氢呋喃的浓度，制作以下的表2中记载的球形度的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0193] [比较例3]

[0194] 将纤维素细颗粒调整为以下的表2中记载的聚合度，制作以下的表2中记载的球形度的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0195] [比较例4～6]

[0196] 染色时，利用与专利文献3相同的方法，并且边调整所使用的染料量来调整显色强度边进行染色，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0197] [比较例7]

[0198] 染色时，加入12g的碳酸钠来替代氢氧化钠进行染色，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0199] [比较例8、9]

[0200] 染色时，染料使用不具有嘧啶结构或三嗪结构的反应性染料(C.I.ReactiveOrange16(实施例8)、C.I.ReactiveBlue19(实施例9))，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0201] [比较例10、11]

[0202] 制作纤维素颗粒时，调整凝固液的四氢呋喃的浓度，制造以下的表2中记载的平均粒径的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0203] [比较例12]

[0204] 调整显色颗粒的制造条件制造以下的表2中记载的显色强度的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0205] [比较例13～15]

[0206] 将实施例20和比较例3的显色颗粒以规定比率混合、进行调整，制造以下的表2中记载的粗大颗粒量的显色颗粒，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0207] [比较例16、17]

[0208] 作为显色颗粒，使用胶体金(比较例16)、胶乳(比较例17)，除此之外利用与实施例1相同的方法制造免疫色谱诊断试剂盒，评价其性能。结果如以下的表2所示。

[0209] [表1]

[0210]

[0211] [表2]

[0212]

[0213] 产业上的可利用性

[0214] 使用了本发明的有机着色细颗粒的免疫色谱诊断试剂盒能够作为具有良好的本底和检查结果的再现性、具有充分的检出灵敏度的诊断药合适地利用。

[0215] 附图标记说明

[0216] (a)样品垫

[0217] (b)含有抗体致敏显色颗粒的结合垫

[0218] (c)检出部A(TL)

[0219] (d)检出部B(对照线)

[0220] (e)色谱介质

[0221] (f)吸收垫

[0222] (g)衬纸

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有机着色细颗粒、诊断药试剂盒及体外诊断方法

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