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一种用于动静脉及脏器出血的止血微球及其制备方法

阅读：1发布：2020-07-13

专利汇可以提供一种用于动静脉及脏器出血的止血微球及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于动静脉及脏器出血的止血微球及其制备方法，该制备方法如下：（1）将可溶性丝素蛋白溶于无机盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为1%~7%的丝素蛋白溶液备用；将海藻酸钠溶于另一种无机盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为0.5%~5%的海藻酸钠溶液备用；（2）将步骤（1）得到的丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液混合后得到水相；将司班80和吐温80加入到液体石蜡中，然后水浴加热搅拌均匀，作为油相；（3）将步骤（2）得到的水相加入到油相中搅拌均匀，然后加入交联剂反应一段时间后得到微球溶液；（4）将步骤（3）得到的微球溶液经溶剂多次洗脱、过滤，干燥后即得到止血微球。该止血微球止血效果快、生物相容性优良，并能在体内降解。，下面是一种用于动静脉及脏器出血的止血微球及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将可溶性丝素蛋白溶于无机二价金属盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为1% 7%~
的丝素蛋白溶液备用；将海藻酸钠溶于无机盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为0.5% 5%~
的海藻酸钠溶液备用；
（2）将步骤（1）得到的丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液混合后得到水相；将司班80和吐温
80加入到液体石蜡中，然后水浴加热搅拌均匀，作为油相；
（3）将步骤（2）得到的水相加入到油相中搅拌均匀，然后加入交联剂反应一段时间后得到微球溶液；
（4）将步骤（3）得到的微球溶液经溶剂多次洗脱、过滤，干燥后即得到止血微球。
2.根据权利要求1所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）中二价金属为钙、钡、铅、锌、铜或锶中的一种；用于溶解海藻酸钠的无机盐溶液为钠盐溶液或钾盐溶液，其质量分数为0.05% 3%。
~
3.根据权利要求1所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中水相中丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1 7:0.5 5。
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4.根据权利要求3所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1 4:2 5。
~ ~
5.根据权利要求4所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比1:2。
6.根据权利要求1所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）中吐温80与司班80体积比为0.1 5:1 5，吐温80和司班80的体积和为油相体~ ~
积的1% 7%。
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7.根据权利要求1所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，步骤（3）中水相和油相的体积比为：1 3:4 6。
~ ~
8.根据权利要求1所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述交联剂为甲醛、戊二醛或京尼平中的一种；交联反应时间为0.5 6h。
~
9.根据权利要求1所述的一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，其特征在于，步骤（4）中洗脱时，依次采用洗脱溶剂醚类化合物、醇类化合物和纯化水进行洗脱，并重复多次。
10.一种用于动静脉及脏器出血的止血微球，其特征在于，根据权利要求1 9任一所述~
的制备方法制备得到。

说明书全文

一种用于动静脉及脏器出血的止血微球及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种用于动静脉及脏器出血的止血微球及其制备方法。

背景技术

[0002] 创伤出血在日常生活中难以避免，轻微的创伤不足以致命，若在短时间内失血量超过全身血液的30%就会危及生命。(Macleod, J. B., Lynn, M., Mckenney, M. G., Cohn, S. M., & Murtha, M. (2003). Early coagulopathy predicts mortality in trauma. The Journal of Trauma: Injury, Infection, and Critical Care, 55(1), 39-44.)在战争、自然灾害、交通事故等突发事件中失血过多是导致死亡的重要原因。据统计全世界平均每3秒就有一人受伤，每70秒就有一人死于交通事故。在重大交通事故中，死亡的主要原因是由于胸腹部创伤而引起的内脏破裂大出血，导致失血性休克而死亡。(B.B. Hsu, S.R. Hagerman, K. Jamieson, S.A. Castleberry, W. Wang, E. Holler, J.Y. Ljubimova, P.T. Hammond, Multifunctional self-assembled films for rapid hemostat and sustained anti-infective delivery, ACS Biomater Sci. Eng. 1 (3) (2015) 148–156.) 事实上，出现不可控性脏器出血时，若能在30min内有效止住，40%以上的伤亡是可以避免的。目前对于动静脉出血常见的止血方法有电凝法、压迫法、手术缝扎等，但是这些方法需要特定的操作环境和设备及人员，对于意外受伤出血的患者来说无法满足这些条件。

[0003] 目前，应用于市面上的止血材料主要有纱布类、沸石类、纤维蛋白胶制品和一些高分子材料等。虽然现有的止血材料种类繁多，但都有一些不同程度的缺点，例如纱布、绷带等制品，虽然价格便宜容易获得，但止血效果较差，易与伤口粘连，换药时易对机体造成二次损伤，并且无法对一些深、窄、弯曲等不规则形状伤口的内脏出血进行止血；沸石类止血效果较好，美国Z-MEDICA公司在2002年推出的Quick-Clot多孔沸石止血粉，由于其极高的比表面积，具有良好的吸附性，对动静脉都具有良好的止血效果，但它最大的缺点是作用于伤口后会放出大量的热，最高温度可达到100℃以上，对机体组织造成严重的热损伤；纤维蛋白制品是从牛血浆中提取的一种生物制品，它对于一些不方便包扎的不规则伤口比较适用，但其来源的存在限制，同时纤维蛋白类制品可能导致伤口化脓感染，具有潜在的免疫原性，且伤口愈合时间较长，需要在37℃下使用，生产成本较高，对动脉止血效果差。另一些常见的高分子止血材料如壳聚糖，它是自然界天然产物中唯一一种带正电的碱性多糖，具有一定的抑菌效果，能抑制成纤维细胞的生长，减少瘢痕组织的生成，对于一些表面的轻度创伤止血效果良好，但对于一些严重的创伤出血止血效果不明显；还有一些高分子聚合物如聚乙烯醇，止血效果较好，但不能在体内降解，需要二次手术将其取出，为患者的身体和经济造成一定的负担。

[0004] 因此开发出一种能战时急救与平时创伤救治相结合，止血效果快、生物相容性优良，并能在体内降解的生物医用止血材料，是许多研究者追求的目标。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的就在于提供一种止血效果快、生物相容性优良，并能在体内降解的用于动静脉及脏器出血的止血微球及其制备方法。

[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将可溶性丝素蛋白溶于无机二价金属盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为1% 7%~
的丝素蛋白溶液备用；将海藻酸钠溶于无机盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为0.5% 5%~
的海藻酸钠溶液备用；
（2）将步骤（1）得到的丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液混合后得到水相；将司班80和吐温
80分别作为乳化剂加入到液体石蜡中，然后水浴加热搅拌均匀，作为油相；
（3）将步骤（2）得到的水相加入到油相中搅拌均匀，然后加入交联剂反应一段时间后得到微球溶液；
（4）将步骤（3）得到的微球溶液经溶剂多次洗脱、过滤，干燥后即得到止血微球。

[0007] 进一步地，步骤（1）二价金属为钙、钡、铅、锌、铜或锶中的一种；用于溶解海藻酸钠的无机盐溶液为钠盐溶液或钾盐溶液，其质量分数为0.05% 3%。~

[0008] 进一步地，步骤（2）中水相中丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1 7:0.5~ ~5。

[0009] 进一步地，丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1 4:2 5。~ ~

[0010] 进一步地，丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比1:2。

[0011] 进一步地，步骤（2）中吐温80与司班80的体积比为0.1 5:1 5，吐温80和司班80的~ ~体积和为油相体积的1% 7%。
~

[0012] 进一步地，步骤（3）中水相和油相的体积比为：1 3:4 6~ ~
进一步地，步骤（3）中所述交联剂为甲醛、戊二醛或京尼平中的一种，优选戊二醛，其质量分数为15% 25%；交联反应时间为0.5 6h。
~ ~

[0013] 进一步地，步骤（4）中洗脱时，依次采用洗脱溶剂醚类化合物、醇类化合物和纯化水进行洗脱，并重复多次。优选石油醚/异丙醇和纯化水进行洗脱。

[0014] 根据前面所述的制备方法制备得到一种用于动静脉及脏器出血的止血微球。

[0015] 本发明将具有良好成球性、溶胀性和生物安全性的海藻酸钠与具有促凝血、可降解的天然丝素蛋白，利用乳化交联法在二价金属离子和交联剂的作用下使海藻酸钠发生凝胶反应形成微球，丝素蛋白与醛基通过缩醛反应在氢键和离子键的作用下与海藻酸钠微球结合生成具有良好生物安全性、吸水性和溶胀性的可用于动静脉及脏器快速止血的微球。本发明得到的止血微球形态良好、表面均匀粗糙，在遇血后可以使血小板和红细胞快速聚集在粗糙的微球表面，并快速吸收血液中的水分而溶胀，使局部血小板、凝血因子和红细胞的再次浓度升高，促进凝血。溶胀后的微球可释放一定的二价金属离子达到快速止血的效果。

[0016] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明采用具有生物安全性高、可降解、透气透水性、无毒无刺激性，能促进凝血的天然丝素蛋白与一种天然高分子多糖海藻酸钠相结合，利用海藻酸钠G单元上的钠离子易与二价金属阳离子(Ca2+，Ba2+，Sr2+，Zn2+，Pb2+等)发生离子交换，在温和的生理条件下可以发生胶凝反应，形成具有三维网状结构的凝胶，能用于生物大分子的传递等特点，制备出用于动静脉及脏器出血的快速止血微球。

[0017] 2、本发明的止血微球综合了海藻酸钠和丝素蛋白的优点，它们都具有良好的生物安全性，不仅没有细胞毒性反而促进细胞的生长，增加了促进伤口愈合的效果。其中海藻酸钠与无机金属离子容易快速形成凝胶微球，具有良好的吸水性和溶胀性，遇血可以快速吸水，使局部血小板和红细胞的浓度升高，促进凝血，而溶胀后的微球体积增大可以封闭出血点从而达到止血的效果；而丝素蛋白具有良好的透气、透水性、生物相容性、能促进血细胞粘附，具有促凝血的作用。因此两者协同互相具有增效作用，是得本发明的微球具有快速止血的效果。

[0018] 3、本发明得到的止血微球，粒径较小，表面粗糙，接触血液后，比表明光滑的微球能更好的吸附红细胞和血小板，同时相比于其他类型的制剂，微球能够增大接触面积，能够作用于一些形状不规则、不可按压的伤口，增加了微球的应用前景，同时由于本微球具有良好的生物安全性和可降解性，有效避免了换药对机体造成二次损伤。

[0019] 4、本发明制备的新型止血材料，相比于其他同类型止血材料，各原料易于获取且价格便宜，制备工艺简单迅速，易于操作、控制及大规模工业化生产，具有广阔的应用前景。附图说明

[0020] 图1-实施例1制备得到的止血微球的宏观形貌图。

[0021] 图2-实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2制备得到的止血微球的表面电镜图。

[0022] 图3-实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2制备得到的止血微球的体外红细胞聚集情况图。

[0023] 图4-实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2制备得到的止血微球体外细胞毒性测试结果图图5-实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2制备得到的止血微球体外红凝血时间图
图6-实施例1制备得到的止血微球的体内止血图。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

[0025] 一种用于动静脉及脏器出血的止血微球的制备方法，具体包括以下步骤：（1）将可溶性丝素蛋白溶于无机二价金属盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为1% 7%~
的丝素蛋白溶液备用；将海藻酸钠溶于无机盐溶液中，得到质量体积百分比浓度为0.5% 5%~
的海藻酸钠溶液备用；
（2）将步骤（1）得到的丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液混合后得到水相；将司班80和吐温
80作为乳化剂加入到液体石蜡中，最后水浴加热搅拌形成稳定均匀的溶液，并作为整个反应体系的油相；
（3）将步骤（2）得到的水相加入到油相中搅拌均匀，然后加入交联剂反应一段时间后得到微球溶液；
（4）将步骤（3）得到的微球溶液经溶剂多次洗脱、过滤，干燥后即得到止血微球。

[0026] 其中，步骤（1）中二价金属为钙、钡、铅、锌、铜或锶中的一种，特别优选氯化钙溶液，用于溶解丝素蛋白，氯化钙溶液的质量分数为2 8%；用于溶解海藻酸钠的无机盐溶液为~钠盐溶液，其质量分数为0.05% 3%。
~

[0027] 其中，步骤（2）中水相中丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1 7:0.5 5。~ ~

[0028] 优先地，丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比为1 4:2 5。~ ~

[0029] 进一步优选地，丝素蛋白溶液和海藻酸钠溶液的体积比1:2。

[0030] 其中，步骤（2）中吐温80与司班80的体积比为0.1 5:1 5，吐温80和司班80的体积~ ~和为油相体积的1% 7%。
~

[0031] 这样采用司班80和吐温80作为乳化剂调节液体石蜡的亲水亲油平衡值，使水相加入后能更好的成球。

[0032] 其中，步骤（3）中水相和油相的体积比为：1 3:4 6~ ~
其中，步骤（3）中所述交联剂为戊二醛，通过单因素实验筛选其质量分数为15% 25%，其~
用量为1 5mL；交联反应时间为0.5 6h。
~ ~

[0033] 其中，步骤（4）中洗脱时，依次采用洗脱溶剂石油醚、异丙醇和纯化水进行洗脱，并重复多次。

[0034] 这样可以使参与实验中的有机溶剂被充分洗脱干净，减少对有机溶剂特别是醛基等对机体的毒性。

[0035] 实施例1此实施例中止血微球的制备方法如下：
（1）将可溶性丝素蛋白溶于氯化钙溶液中，得到质量体积百分比浓度为2 %的丝素蛋白溶液备用；将海藻酸钠溶于氯化钠溶液中，得到质量体积百分比浓度为2%的海藻酸钠溶液备用；
（2）取步骤（1）得到的丝素蛋白溶液15mL和海藻酸钠溶液20mL混合后得到水相；将5mL司班80和5 mL吐温80加入到液体石蜡中，调节整个反应体系的亲水亲油平衡值，最后在25~
60℃水浴加热搅拌均匀，作为油相；
（3）将步骤（2）得到的水相加入到油相中搅拌均匀，然后加入5mL质量分数为 15%的戊二醛反应3 h后得到微球溶液；
（4）将步骤（3）得到的微球溶液依次采用洗脱溶剂石油醚、异丙醇和纯化水进行洗脱、过滤，并重复多次，干燥后即得到止血微球。其宏观形貌图如图1所示。

[0036] 实施例2此实施例制备方法同实施例1，仅是水相中丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为
1:0。

[0037] 对比实施例1此实施例制备方法同实施例1，仅是水相中丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为
2:1。

[0038] 对比实施例2此实施例制备方法同实施例1，仅是水相中丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为
4:1。

[0039] 对实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2得到的止血微球进行了如下实验，SF表示丝素蛋白溶液，SA表示海藻酸钠溶液，并且图中SA表示实施例1；SF表示实施例2；图中，SF/SA2表示对比实施例1，SF/SA4表示对比实施例2。

[0040] 1、通过显微镜和电镜观察实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2得到的止血微球的表面变形态结构，其表面电镜图如图2所示，由图可以看出，不同比列的丝素蛋白和海藻酸钠，得到微球表面形态和粗糙度都有所不同，其中实施例2得到止血微球的成球性差，对比实施例1得到的止血微球表面最为粗糙。

[0041] 2、分别称取10mg实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2得到的止血微球，然后分别量取1ml的新鲜兔血加入到对应的止血微球中，待形成凝血块后固定脱水，用生物电镜观察微球表面红细胞聚集情况，结果如图3所示，其中A图为实施例1得到的止血微球体外红细胞聚集图，B为实施例2得到的止血微球体外红细胞聚集图，C为对比实施例1得到的止血微球体外红细胞聚集图，D为对比实施例2得到的止血微球体外红细胞聚集图。从图中可以看出，由于对比实施例1得到的止血微球表面最为粗糙因此聚集的红细胞的数量最多，导致红细胞周围相互挤压存在形变，且周围有纤维蛋白原被激活形成丝状的纤维蛋白，促进凝血过程。

[0042] 3、将实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2得到的止血微球首先用紫外照射样品3h灭菌，然后将灭菌后的50mg的微球溶于10ml的完全培养基中，在恒温培养箱中孵育24小时（37℃），再用0.22μm的针式滤头过滤得到微球浸提液，并用完全培养基将浸提液稀释成为不同浓度（5mg/ml、3.75mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml）4℃保存备用。

[0043] 将100μl含有3×104个/ml的L-929细胞悬液加入到96孔板中作为实验组，外周每孔加入200μl的培养基作为对照组，放入培养箱中待细胞贴壁后再向实验组中每孔加入100μl的不同浓度的细胞悬液，重复5孔。培养24小时后每孔再加入100μl 5mg/ml的MTT溶液，37℃继续培养4小时，然后加入DMSO溶液，用酶标仪在450nm处测定吸光度值。用MTT法计算不同比例、不同浓度的微球对细胞的影响，测定细胞活力，计算出细胞毒性，结果如图4所示。

[0044] 从图中可以看出，不同浓度的微球浸提液对细胞均没有细胞毒性，反而都促进细胞的生长，并且随着微球浸提液的浓度升高细胞活力值越大促进细胞生长越明显，表明利用本发明制备的止血微球具有良好的生物安全性。

[0045] 4、取五个测试杯，每个测试杯中加入1mL的新鲜的枸橼酸抗凝兔血和40μL的高岭土溶液，再称取5mg实施例1、实施例2、对比实施例1和对比实施例2得到的止血微球分别加入到其中四个测试杯中作为实验组，另一个测试杯作为空白组，通过血栓弹力图仪检测微球体外凝血时间，结果如图5所示。

[0046] 从图中可以看出，与空白组相比，四组实验组的微球均能促进凝血，其中对比实施例1制备得到止血微球的凝血时间最短，能在2分钟内快速凝血。这与微球的吸水量和表面粗糙结构密切相关。

[0047] 5、采用对比实施例1得到的止血微球对大鼠的尾部出血及肝脏出血进行止血，其止血图如图6所示，其中图6的A图为大鼠尾损伤止血图，图6的图B为大鼠肝损伤止血图。由图A可以说明：大鼠尾出血量少，部分微球因吸血呈红色，由于微球表面粗糙，快速与血液凝集形成块状，封闭出血点从而达到快速止血的效果。图B的肝出血模型是由长×深（1cm×0.5cm）的损伤造成的，表明微球比其他产品更适合用于深、窄或不规则的伤口。有图B可以看出，微球作用于肝出血后可以快速止血，并且少量的微球就可以达到良好的止血效果。

[0048] 实施例3此实施例中止血微球的制备方法如下：
（1）将可溶性丝素蛋白溶于氯化钙中，得到质量体积百分比浓度为2%的丝素蛋白氯化钙溶液备用；将海藻酸钠溶于氯化钠溶液中，得到质量体积百分比浓度为2%的海藻酸钠溶液备用；
（2）取步骤（1）得到的丝素蛋白溶液5mL和海藻酸钠溶液20mL混合后得到水相；将3mL司班80和1mL吐温80加入到液体石蜡中，调节整个反应体系的亲水亲油平衡值，最后在25 60~
℃水浴加热搅拌均匀，作为油相；
（3）将步骤（2）得到的水相加入到油相中搅拌均匀，然后加入1 mL质量分数为25%的交联剂反应6h后得到微球溶液；
（4）将步骤（3）得到的微球溶液依次采用洗脱溶剂乙醚、异丙醇和纯化水进行洗脱、过滤，并重复多次，干燥后即得到止血微球。

[0049] 此实施例得到的止血微球表面结构较粗糙，粒径均一，具有较好的吸水性、溶胀性和良好的生物安全性，与对照组相比可以明显缩短体外凝血时间。

[0050] 实施例4此实施例中止血微球的制备方法如下：
（1）将可溶性丝素蛋白溶于氯化钙中，得到质量体积百分比浓度为2%的丝素蛋白溶液备用；将海藻酸钠溶于氯化钠溶液中，得到质量体积百分比浓度为2 %的海藻酸钠溶液备用；
（2）取步骤（1）得到的丝素蛋白溶液10mL和海藻酸钠溶液20mL混合后得到水相；将3mL司班80和1 mL吐温80加入到液体石蜡中，调节整个反应体系的亲水亲油平衡值，最后在25~
60℃水浴加热搅拌均匀，作为油相；
（3）将步骤（2）得到的水相加入到油相中搅拌均匀，然后加入1mL质量分数为25%的交联剂反应3h后得到微球溶液；
（4）将步骤（3）得到的微球溶液依次采用洗脱溶剂乙醚、异丙醇和纯化水进行洗脱、过滤，并重复多次，干燥后即得到止血微球。

[0051] 此实施例得到的止血微球表面结构粗糙具有均匀的孔隙，具有高吸水性和溶胀性，止血效果良好，其粗糙的表面结构利于粘附红细胞和血小板激活凝血过程，但不同于同类多孔结构的止血产品，它能更有效的阻止红细胞等进入微球内部而影响止血效果。最后需要说明的是，本发明的上述实施例仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

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