技术领域
[0001] 本
发明涉及一株产脂肪酶菌株及其在酶法合成维生素A棕榈酸酯中的应用，属于工业
微生物领域技术。
背景技术
[0002] 维生素A棕榈酸酯是目前最常用的用途最为广泛的维生素A系列产品之一，维生素A棕榈酸酯不但能帮助维持正常视觉功能，还能参与各种代谢活动维持生物
机体健康。一般作为添加剂应用于食品、
化妆品、医药等行业。目前合成维生素A棕榈酸酯主要有化学法和酶法。化学方法合成维生素A棕榈酸酯存在环境污染、设备
腐蚀等问题，而酶法则污染少，
时空产率高，成本低。因此维生素A棕榈酸酯酶法合成技术的研究日趋活跃。
[0003] 枯草芽孢杆菌脂肪酶主要有LipA和LipB，大量研究表明，LipA可以
水解长链
脂肪酸。Lip A没有
盖子结构，并且分子量较小，因此被认为是最小的α/β折叠水解酶之一。通过结构对比发现，Lip A 的结构与来源于南极假丝
酵母（Candida antarctica）的脂肪酶B很相似，而目前酶法合成维生素A棕榈酸酯的方法大多采用诺维信435（Candida antarctica lipase B）固定化酶，但该酶价格昂贵，工业化生产应用成本太高。麻虾酱主要是由产自海洋的麻线虾加盐自然
发酵一月左右制得，富含
蛋白质、甲壳素及脂肪，是我国及东南亚地区的常用调味料。麻虾酱微
生物多样性和构成非常复杂，适合用作产脂肪酶菌株的筛选。目前未有从麻虾酱中筛选产脂肪酶菌株并利用该菌株开发有机相全细胞转化法生产维生素A棕榈酸酯的报道。
发明内容
[0004] 本发明的第一目的在于提供一株产脂肪酶菌株。
[0005] 为了实现本发明的上述技术目的，本发明采用的技术方案是：一株产脂肪酶菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2018262，保藏日期为2018年5月10日。
[0006] 上述菌株由常熟理工学院发酵工程中心从自然发酵的麻虾酱中分离获得。
[0007] 本发明的枯草芽孢杆菌CS1802的理化性质如下：形态学：在筛选培养基上生长1d，能形成明显的菌落。菌落形状不规则或有皱褶，
革兰氏阳性菌，杆状。
[0008] 培养特征：最适生长
温度30℃左右，好
氧；最适生长pH 7左右。
[0009] 本发明的另一目的在于提供上述菌株在酶法合成维生素A棕榈酸酯中的应用。
[0010] 本发明提供了一种利用全细胞转化法产维生素A棕榈酸酯的应用方式，具体包括如下步骤：（1）将菌株CS1802接种至
牛肉膏蛋白胨液体培养基中振荡培养；
（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中振荡发酵；发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液，即发酵好的菌液。
[0011] （3）将发酵好的菌液离心，将菌体接入有机相体系中发酵生产维生素A棕榈酸酯。
[0012] 进一步的，振荡培养和发酵培养的温度为30℃。
[0013] 进一步的，发酵培养基成分为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4
0.5g/L，
橄榄油乳化液12mL/L。所述橄榄油乳化液配制方法为：橄榄油乳化剂PVA与橄榄油以体积比3：1混合，利用
超声波乳化。
[0014] 进一步的，所述有机相体系为将维生素A和棕榈酸按照1：1的
质量比溶于
有机溶剂；所述维生素A和棕榈酸浓度为10 25g/L；优选15g/L。所述
有机溶剂优选采用正己烷。~
[0015] 进一步的，将菌体接入有机相体系中发酵0.5 2h；优选1h。~
[0016] 本发明提供了一株可用于酶法合成维生素A棕榈酸酯的枯草芽孢杆菌；该菌株来源于传统的自然发酵食品，在食品行业具有广阔的应用前景；该菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上生长良好，容易培养和保存，通过全细胞转化法，在15g/L维生素A和棕榈酸底物浓度的条件下，维生素A棕榈酸酯产量为15.35mg/mL，转化率为76.75%。
附图说明
[0017] 图1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802经革兰氏
染色后的显微形态。
[0018] 图2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802的系统进化树。
[0019] 图3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802全细胞法产维生素A棕榈酸酯的转化菌体添加量。
[0020] 图4为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802全细胞法产维生素A棕榈酸酯的转化时间。
[0021] 图5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802全细胞法产维生素A棕榈酸酯的底物浓度。
[0022] 本发明涉及的
生物材料，其分类命名为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2018262，保藏日期为2018年5月10日。
具体实施方式
[0023]
实施例1本实施例说明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802的筛选纯化及鉴定方法。
[0024] 筛选样品为连
云港市海娃食品有限公司的麻虾酱，称取25g虾酱与225mL生理盐水-1 -2 -3 -4 -1制备菌悬液，同时将其浓度分别稀释至10 、10 、10 和10 倍。将菌悬液原液、10 倍稀释、
10-2倍稀释、10-3倍稀释和10-4倍稀释的菌液涂布于初筛培养基上，30℃生长1 2d后挑取生~
长良好的单一菌落在初筛培养基上划线分离。挑取初筛培养基上生产的周围有明显透明圈的单一菌落接种到复筛培养基中，30℃，200r/min摇床培养1 2d。
~
[0025] 初筛培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，三丁酸甘油酯2mL/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容至1000mL。
[0026] 复筛培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，橄榄油乳化液12mL/L，蒸馏水定容至1000mL。橄榄油乳化液配制方法为：将橄榄油乳化剂PVA与橄榄油以体积比3：1混合，利用
超声波乳化。
[0027] 从初筛培养基平板上挑取一环菌与
载玻片上水珠混合并过火。通过结晶紫初染，碘液酶染，
乙醇脱色，番红复染后在
显微镜下镜检，该菌为革兰氏阳性菌(图1)。
[0028] 该菌株的理化性质如下：形态学：在筛选培养基上生长1d，能形成明显的菌落。菌落形状不规则或有皱褶，革兰氏阳性菌，杆状。
[0029] 生理生化特征：7% NaCl生长，
柠檬酸盐利用，
氧化酶，
接触酶，V-P测定及
淀粉水解均为阳性；能利用
蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、
棉籽糖、
葡萄糖、麦芽糖、N-乙酰
氨基葡萄糖和胶体甲壳素等
碳源。
[0030] 培养特征：最适生长温度30℃左右，好氧；最适生长pH 7左右。
[0031] 对上述菌株的16SrDNA部分的序列的测定及BLAST比对，后用MEGA 5.1构建N-J系统进化树分析，其16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示，系统进化树如图2所示，由此鉴定为枯草芽孢杆菌，经微生物保藏程序的鉴定和保藏，将其分类命名定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CS1802，其保藏编号为CCTCC NO：M2018262。
[0032] 实施例2本实施例具体说明菌株CS1802在利用橄榄油发酵产脂肪酶中的应用。
[0033] （1）将菌株CS1802接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，振荡培养18 24h；~
（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，接种量为2%，30℃，振荡培养14 24h。发~
酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液，测定其脂肪酶酶活为214.3 U/L。
[0034] 发酵培养基成分和前述复筛培养基相同。
[0035] 脂肪酶酶活测定方法为：将发酵液3000 r离心10 min，取上清液为待测样品 往预先包被脂肪酶
抗体的包被微孔中，依次加入待测样品、辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，经过37℃温育1h并彻底洗涤。用底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色，在HRP催化下转
化成蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色。用酶标仪在450nm
波长下测定OD值，通过标准曲线计算样品活性。标准品为纯脂肪酶配制的0、1.5、3、6、12、24U/L酶溶液。酶活定义为：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解底物产生1μmol脂肪酸的酶量为一个酶活性单位U。脂肪酶ELISA检测
试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司。
[0036] 实施例3本实施例具体说明菌株CS1802全细胞转化产维生素A棕榈酸酯的应用。
[0037] （1）将菌株CS1802接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，振荡培养18 24h；~
（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，接种量为2%，30℃，振荡培养14 24h。发~
酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液。
[0038] （3）将发酵好的菌液3000r/min 离心5min，将菌体按5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L接入有机相体系（维生素A：棕榈酸=10g：10g溶于1L正己烷）中发酵2h后测定维生素A棕榈酸酯的含量，并计算转化率。由图3可知，当菌体添加量为25g/L时转化效率最高为55.7%，维生素A棕榈酸酯含量为11.14mg/L。
[0039] 发酵培养基成分和前述复筛培养基相同。
[0040] 维生素A棕榈酸酯测定方法为：高效液相法，采用外标法定量。色谱条件为：色谱柱：Alltech C1（8 250x4.6mm，4.5μm）；流动相：100%甲醇；检测器：岛津10A紫外检测器；检测波长：327nm；流速：1mL/min。
[0041] 转化率计算公式为：转化率= 。
[0042] 实施例4本实施例具体说明菌株CS1802全细胞转化产维生素A棕榈酸酯的应用。
[0043] （1）将菌株CS1802接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，振荡培养18 24h；~
（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，接种量为2%，30℃，振荡培养14 24h。发~
酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液。
[0044] （3）将发酵好的菌液3000r/min 离心5min，将菌体按25g/L接入有机相体系（维生素A：棕榈酸=10g：10g溶于1L正己烷）中发酵0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h后测定维生素A棕榈酸酯的含量，并计算转化率。由图4可知，当菌体添加量为25g/L，转化1h后转化效率最高为73.6%，维生素A棕榈酸酯含量为14.72mg/L。
[0045] 实施例5本实施例具体说明菌株CS1802全细胞转化产维生素A棕榈酸酯的应用。
[0046] （1）将菌株CS1802接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，振荡培养18 24h；~
（2）将步骤（1）所培养菌株接入发酵培养基中，接种量为2%，30℃，振荡培养14 24h。发~
酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液。
[0047] （3）将发酵好的菌液3000r/min 离心5min，将菌体按25g/L接入不同底物浓度有机相体系，即维生素A和棕榈酸浓度为5g:5g、10g:10g、15g:15g、20g:20g和25g:25g分别溶于1L正己烷中发酵1h后测定维生素A棕榈酸酯的含量，并计算转化率。由图5可知，当菌体添加量为25g/L，有机相体系为维生素A:棕榈酸=15g:15g溶于1L培养基中转化1h后转化效率最高为76.75%，维生素A棕榈酸酯含量为15.35mg/L。
