一种赖氨酸脱羧酶的固化方法及其应用
阅读：715发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种赖氨酸脱羧酶的固化方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及L-赖 氨 酸脱羧酶的 固化 方法，还涉及将该方法应用于1,5-戊二胺的制备。本发明的赖氨酸脱羧酶的固化方法，当含有L-赖氨酸脱羧酶的液体经盐析纯化后，无需经过脱盐而对酶进行固定。本发明解决了目前 硫酸 铵沉淀后，要进行脱盐处理以及L-赖氨酸脱羧酶的活性降低的技术问题。，下面是一种赖氨酸脱羧酶的固化方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种赖氨酸脱羧酶的固化方法，其特征在于，将含有赖氨酸脱羧酶的液体进行盐析纯化后，不经过脱盐，进行固定。
2.如权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，所述盐析纯化包括以下步骤：
将所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与含有缓冲体系的无机盐溶液混合，获得沉淀；所述含有缓冲体系的无机盐溶液的pH值为4.5～6，优选为5.0～6.0，更优选为5.0；所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与所述含有缓冲体系的无机盐溶液混合后，所述无机盐的浓度控制在无机盐饱和度的15％～50％，优选为30％～35％，更优选为34％～36％；
优选地，所述无机盐为硫酸铵。
3.如权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，所述盐析纯化中，所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与所述含有缓冲体系的无机盐溶液混合后的温度为0～37℃，优选为
20～35℃。
4.如权利要求1-3中任一项所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，所述含有赖氨酸脱羧酶的液体中赖氨酸脱羧酶的蛋白浓度为1-3mg/ml。
5.如权利要求1-4中任一项所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，
所述含有赖氨酸脱羧酶的液体是来源于微生物、植物或动物细胞的发酵细胞裂解液，所述赖氨酸脱羧酶在胞内表达；或者，
所述含有赖氨酸脱羧酶的液体是细胞发酵液、细胞发酵液的浓缩液或稀释液、细胞发酵液过滤除去细胞的无细胞液体，所述赖氨酸脱羧酶由宿主细胞分泌表达。
6.如权利要求5所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌。
7.如权利要求1-6任一项所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，所述固定包括以下步骤：将环氧基修饰的高分子载体与赖氨酸脱羧酶于缓冲溶液中反应，从而对赖氨酸脱羧酶进行固定。
8.根据权利要求7所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，所述环氧基修饰的高分子载体选自：
将含羟基的高分子物质与环氧基化试剂，经环氧基化反应，得环氧基修饰的高分子载体；优选地，所述含羟基的高分子物质选自：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、含羟基的聚酯的水解产物、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆中的一种或多种；
或
将含苯胺基的高分子物质和/或含胺基的高分子物质，与环氧基化试剂，经环氧基反应，得环氧基修饰的高分子载体；优选地，所述含胺基的高分子物质选自：聚丙烯腈的水解产物、含胺基的聚酯的水解产物、聚酰胺的水解产物中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，
所述含苯胺基的高分子物质选自：
将含羟基的高分子物质，与含苯胺基的醚化剂，经醚化反应，得到含苯胺基的高分子物质；或者，
含胺基的高分子物质选自：
将含羟基的高分子物质，与含胺基的醚化剂，经醚化反应，得到含胺基的高分子物质，或
所述含胺基的高分子物质选自：聚丙烯腈的水解产物、含胺基的聚酯的水解产物、聚酰胺的水解产物中的一种或多种。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，
所述赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述环氧基修饰的高分子载体为1500-4000U，优选
2000-3500U，更优选2500-3000U；和/或，
所述缓冲溶液的pH值优选5-11；和/或，
所述缓冲溶液的离子浓度优选0.01～2.0mol/L，优选1～2mol/L，更优选1.2～1.8mol/L；和/或，
所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应温度为0～30℃；和/或，
所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间为15～100小时。
11.根据权利要求7-10任一项所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法，其中，
所述含苯胺基的醚化剂选自对β-硫酸酯乙砜基苯胺；和/或，
所述含胺基的醚化剂选自硅烷化试剂；和/或，
所述环氧基化试剂选自：环氧氯丙烷和/或环氧树脂；优选地，所述环氧树脂选自液态环氧树脂。
12.一种制备1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
按权利要求1～11任一项所述的氨酸脱羧酶的固化方法将所述赖氨酸脱羧酶固化，然后与L-赖氨酸或其盐反应；
优选地，所述赖氨酸盐选自赖氨酸盐酸盐、赖氨酸硫酸盐、赖氨酸碳酸盐、赖氨酸磷酸盐、赖氨酸己二酸盐、赖氨酸癸二酸盐中的一种或其组合；
优选地，与赖氨酸或赖氨酸盐反应时的温度为10-50℃。
一种赖氨酸脱羧酶的固化方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及酶的固化方法，特别涉及赖氨酸脱羧酶的固化方法，尤其是涉及将含有赖氨酸脱羧酶的液体盐析纯化后不经过脱盐而进行固定的方法，还涉及将该方法应用于1,5-戊二胺的制备。
背景技术
[0002] 赖氨酸脱羧酶广泛存在于微生物，动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺和CO2。而1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。
[0003] 大肠杆菌中的诱导型赖氨酸脱羧酶(LdcI/CadA，SwissProt#P0A9H3)受到较低pH环境的诱导，以对抗酸性压力。而赖氨酸脱羧酶CadA表达及活性的发挥，将培养基中的L-赖氨酸脱羧生成CO2和1,5-戊二胺，1,5-戊二胺会通过CadB转运蛋白运到细胞外，这个反应的发挥会使得培养条件pH的逐渐升高(Meng and Bennett,1992；Snider et al.,2006)；赖氨酸脱羧酶CadA蛋白是由10个亚基(每个亚基大小约为80kDa)组成双层，五瓣型的复合体(Kanjee,et al.,2011)。在较低pH条件下(5.0)，显微镜下观察其会呈现多个十聚体叠在一起的状态，而随着pH逐渐升高(6.5左右)，这种多聚体会逐渐减少，相应的单独的十聚体会逐渐增多，另外二聚体也会增加；至pH8.0左右时，大部分是以二聚体存在；对应的L-赖氨酸转化活性会随pH逐渐升高，活性逐渐降低(Kanjee,et al.,2011)。在生产中，使用游离的赖氨酸脱羧酶进行催化反应，随着1,5-戊二胺的生成不可避免的导致pH逐渐升高，赖氨酸脱羧酶活性发生降低，使用效率大幅度降低。除了游离酶的不稳定性之外，使用游离的赖氨酸脱羧酶进行催化也会对酶反应液中戊二胺提取带来相当大的困难。因此必须通过一定的手段解决这些问题。
[0004] 为了提高酶的使用效率，可以将酶制备成固定化酶，固定化酶对于酸碱环境的稳定性大大提高，并且还具有容易和底物或产物分离以及能够重复使用、反应易于控制等的优点。WO2016/123745 A1、国际公布日2016年8月11日公开的PCT申请公开了一种固定化细胞及其制备方法，该方法通过制备含有赖氨酸脱羧酶的固定化细胞/酶，可以实现提高发酵液中的赖氨酸脱羧酶的重复使用效率，也是对赖氨酸脱羧酶的一种富集，提高L-赖氨酸转化的效率。
[0005] 考虑到发酵液中的杂蛋白可能对制备的固定化酶的酶活回收率会产生一定的影响。中国专利授权公告号CN100398646C、授权公告日2008年7月2日的中国发明专利公开了一种新型亲和载体的制备方法，该方法通过一种亲和载体制备固定化酶，在对蛋白进行亲和纯化的同时实现蛋白的固定化，但利用这种亲和载体需要利用基因工程的手段在目的蛋白的N端或C端增加一段肽段，往往会对蛋白尤其是酶的活性造成一定的影响，对工业生产来说不利。因此，本技术领域需要一种在制备固定化酶时，提高酶活回收率的方法。
[0006] 硫酸铵沉淀是一种简单、常见的，具有能够保证蛋白质的生物活性，相比利用标签的亲和层析成本低，操作简单的，去除杂蛋白，提纯目的蛋白质方法，因而受到了广泛的应用。但是使用硫酸铵对赖氨酸脱羧酶进行沉淀时存在着两个问题：
[0007] 1、硫酸铵沉淀蛋白时，选择的pH通常在中性(7.0～8.0)，因为大部分蛋白的等电点都在这个范围内，蛋白在pH接近等电点时最容易聚集沉淀；而之前提到，环境的pH会影响赖氨酸脱羧酶的聚合形式，因此不能单纯的选择中性pH条件对赖氨酸脱羧酶进行沉淀；
[0008] 2、硫酸铵沉淀时，现有的方法为了维持酶活性，必须选择低温条件对酶进行沉淀；硫酸铵沉淀后，因为考虑到硫酸铵的存在会对酶或蛋白的活性产生一定的影响，对后续生产使用带来不利的效果，通常将沉淀中的硫酸铵除掉(脱盐)，如通过透析(或超滤)或者结合疏水层析的方法脱盐。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种赖氨酸脱羧酶的固化方法，以解决目前硫酸铵沉淀后，将所述赖氨酸脱羧酶固定前要进行脱盐处理以及由此带来的所述赖氨酸脱羧酶的活性降低的技术问题。
[0010] 本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的目的。
[0011] 根据本发明的一个方面，本发明提供一种赖氨酸脱羧酶的固化方法，该方法将含有赖氨酸脱羧酶的液体盐析纯化后，不经过脱盐，对赖氨酸脱羧酶进行固定。
[0012] 本发明的固化方法中的“盐析纯化”是指，用硫酸铵对赖氨酸脱羧酶进行沉淀的纯化方法。“脱盐”是指，将盐析纯化中产生的硫酸铵除掉。“固定”是指，将赖氨酸脱羧酶制备成固定化酶。
[0013] 根据一些实施方式，本发明的固化方法中的所述盐析纯化包括以下步骤：
[0014] 将所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与含有缓冲体系的无机盐溶液混合，获得沉淀；所述含有缓冲体系的无机盐溶液的pH值为4.5～6，优选为5.0～6.0，更优选为5.0；所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与所述含有缓冲体系的无机盐溶液混合后，所述无机盐的浓度控制在无机盐饱和度的15％～50％，优选为30％～35％，更优选为34％～36％。
[0015] 根据一些实施方式，上述盐析纯化中将所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与所述含有缓冲体系的无机盐溶液混合后的温度为0～37℃，优选为20～35℃。
[0016] 根据一些实施方式，上述盐析纯化中所述的无机盐为硫酸铵。
[0017] 根据一些实施方式，所述含有赖氨酸脱羧酶的液体是来源于微生物、植物或动物细胞的发酵细胞裂解液，所述赖氨酸脱羧酶在胞内表达；或者，所述含有赖氨酸脱羧酶的液体是细胞发酵液、细胞发酵液的浓缩液或稀释液、细胞发酵液过滤除去细胞的无细胞液体，所述赖氨酸脱羧酶由宿主细胞分泌表达。
[0018] 根据一些实施方式，所述含有赖氨酸脱羧酶的液体中赖氨酸脱羧酶的蛋白浓度为1-3mg/ml。
[0019] 根据一些实施方式，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌。
[0022] 根据一些实施方式，所述固定包括以下步骤：
[0023] (1)将含羟基的高分子物质与环氧基化试剂，经环氧基化反应，得环氧基修饰的高分子载体；优选地，所述含羟基的高分子物质包括：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、含羟基的聚酯的水解产物、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆中的一种或多种；
[0024] (2)将所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶，在缓冲溶液中反应；
[0025] 或者，所述固定包括以下步骤：
[0026] (1)将含苯胺基的高分子物质和/或含胺基的高分子物质，与环氧基化试剂，经环氧基反应，得环氧基修饰的高分子载体；
[0027] (2)将所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶，在缓冲溶液中反应；
[0028] 或者，所述固定包括以下步骤：
[0029] (1)将含羟基的高分子物质，与含苯胺基的醚化剂，经醚化反应，得到含苯胺基的高分子物质；优选的，所述含羟基的高分子物质包括：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、含羟基的聚酯的水解产物、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆中的一种或其组合；
[0030] (2)将含苯胺基的高分子物质，与环氧基化试剂，经环氧基化反应，得环氧基修饰的高分子载体；
[0031] (3)将所述环氧基修饰的高分子载体，与所述赖氨酸脱羧酶，在缓冲溶液中反应；
[0032] 或者，所述固定包括以下步骤：
[0033] (1)将含羟基的高分子物质，与含胺基的醚化剂，经醚化反应，得到含胺基的高分子物质；优选地，所述含羟基的高分子物质包括：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、含羟基的聚酯的水解产物、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆中的一种或其组合；
[0034] (2)将含胺基的高分子物质，与环氧基化试剂，经环氧基化反应，得环氧基修饰的高分子载体；
[0035] (3)将所述环氧基修饰的高分子载体，与所述赖氨酸脱羧酶，在缓冲溶液中反应；
[0036] 或者，所述固定包括以下步骤：
[0037] (1)将含胺基的高分子物质与环氧基化试剂，经环氧基化反应，得环氧基修饰的高分子载体；其中，所述含胺基的高分子物质包括：聚丙烯腈的水解产物、含胺基的聚酯的水解产物、聚酰胺的水解产物中的一种或多种；
[0038] (2)将所述环氧基修饰的高分子载体，与所述赖氨酸脱羧酶，在缓冲溶液中反应。
[0039] 根据一些实施方式，所述赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述环氧基修饰的高分子载体为1500-4000U，优选2000-3500U，更优选2500-3000U。
[0040] 根据一些实施方式，所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶，在缓冲溶液中反应，所述缓冲溶液的pH值优选5-11。进一步，所述缓冲溶液的离子浓度优选0.01～2.0mol/L，优选1～2mol/L，更优选1.2～1.8mol/L。又进一步，所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应温度为0～30℃。又进一步，所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间为15～100小时。
[0043] 本发明的第二方面在于提出了一种制备1,5-戊二胺的方法。本发明提供了一种制备1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
[0044] 按本发明所述的赖氨酸脱羧酶的固化方法将所述赖氨酸脱羧酶固化，然后与L-赖氨酸或其盐反应；
[0046] 优选地，赖氨酸脱羧酶固化后与赖氨酸或赖氨酸盐反应时的反应温度为10-50℃。
[0047] 本发明通过硫酸铵沉淀的方法对赖氨酸脱羧酶发酵液进行沉淀，无需低温条件就可以将杂蛋白与赖氨酸脱羧酶分离开来，从而实现对赖氨酸脱羧酶的富集，并且固定之前不需要进行进一步的脱盐处理，还能够维持酶活性。用这种方法由富集的赖氨酸脱羧酶制备的固定化酶相比未固定的酶而言，酶活回收率有一定的提高作用，因而对工业生产将会有重要的意义和帮助。附图说明
[0048] 图1是pH8.0条件下赖氨酸脱羧酶发酵裂解液蛋白在不同硫酸铵浓度的混合液中的沉淀情况。
[0049] 图2是不同pH条件下赖氨酸脱羧酶发酵裂解液蛋白在不同硫酸铵浓度的混合液中的沉淀情况-沉淀中蛋白的SDS-PAGE。
[0050] 图3是不同pH条件下赖氨酸脱羧酶发酵裂解液蛋白在不同硫酸铵浓度的混合液中的沉淀情况-上清中蛋白的SDS-PAGE。
[0051] 图4是pH5.0条件下赖氨酸脱羧酶发酵裂解液蛋白在不同硫酸铵浓度的混合液中的沉淀情况-上清中蛋白的SDS-PAGE。
[0052] 图5是pH5.0条件下赖氨酸脱羧酶发酵裂解液蛋白在不同硫酸铵浓度的混合液中的沉淀情况-沉淀中蛋白的SDS-PAGE。
[0053] 图6是硫酸铵浓度为饱和度的30％和35％的混合液沉淀的赖氨酸脱羧酶L-赖氨酸转化率测定。
[0054] 详细说明
[0055] 下面结合附图，详细说明本发明。
[0056] 本发明提供了一种赖氨酸脱羧酶的固化方法，将含有赖氨酸脱羧酶的液体盐析纯化后，不经过脱盐，进行固定。
[0057] 所述盐析纯化包括以下步骤：
[0058] 将所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与所述含有缓冲体系的硫酸铵溶液混合，获得沉淀；所述含有缓冲体系的硫酸铵溶液的pH值为4.5～8.0，优选为5.0～6.0，更优选5.0；所所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与所述含有缓冲体系的硫酸铵溶液混合后，所述硫酸铵的浓度控制在硫酸铵饱和度的15％～50％，优选为30％～35％，更优选为34％～36％；将所述含有赖氨酸脱羧酶的液体与所述含有缓冲体系的硫酸铵溶液混合后的温度为0～37℃，优选为20～35℃。
[0059] 优选地，所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白的液体是来源于微生物、植物或动物细胞的发酵细胞裂解液，所述赖氨酸脱羧酶在胞内表达；或者所述含有赖氨酸脱羧酶的液体是细胞发酵液、细胞发酵液的浓缩液或稀释液、细胞发酵液过滤除去细胞的无细胞液体，所述赖氨酸脱羧酶由宿主细胞分泌表达。进一步，在一些实施方案中，选择用来发酵的微生物可以是大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌。所述含有赖氨酸脱羧酶的液体中赖氨酸脱羧酶的蛋白浓度为1-3mg/ml。
[0060] 在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因在宿主细胞中可以为本底表达或者过表达；组成型表达或诱导型表达；胞内表达或者分泌表达。
[0061] 优选地，所述赖氨酸脱羧酶是野生型赖氨酸脱羧酶或者突变型赖氨酸脱羧酶。
[0062] 优选地，所述含有缓冲体系的硫酸铵溶液的缓冲体系是磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液。
[0063] 下面阐述本发明所述的方法中的固定，即对赖氨酸脱羧酶的固定。
[0064] 用于本发明的高分子载体为固体形态，可使负载的赖氨酸脱羧酶便于从反应体系中分离处理。在一个优选的实施方式中，本发明的高分子载体可以为纤维状(丝状)丝状或颗粒状，更优选为纤维状(丝状)丝状。
[0065] 用于本发明的高分子载体物质经处理前可以是天然高分子化合物，也可以是合成高分子化合物，只要其分子结构能够进行环氧基修饰即可。
[0066] 在一个优选的实施方式中，本发明的高分子物质为分子结构中含有羟基或胺基的高分子物质，或者为经过反应如水解(包括酸水解及碱水解)、重排等可使分子中含有羟基或胺基的高分子物质，其中，可适用于本发明的含羟基的高分子物质包括但不限于：纤维素、聚乙烯醇、醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物和含胺基的聚酯的水解产物(优选含胺基的聚酯纤维的水解产物)、脱脂棉、甘蔗渣、棉花、秸秆、羊毛、兔毛等。所述高分子物质可以单独使用，也可组合使用。
[0067] 在一个优选的实施方式中，本发明的高分子物质为：将含羟基的高分子物质与含苯胺基/胺基的试剂(醚化剂)反应，将其转变为含苯胺基/胺基的高分子物质。
[0068] 在一个优选的实施方式中，本发明的含胺基的高分子物质还可以为以下物质中的一种或多种：聚丙烯腈的水解产物、含胺基的聚酯的水解产物、聚酰胺的水解产物。该含胺基的高分子物质可以为纤维状或颗粒状，优选为纤维状；所述颗粒状优选为多孔颗粒状。
[0069] 以下以醋酸纤维素水解产物为例进行说明。
[0070] 在根据本发明的一个优选实施方式中，高分子物质可以为醋酸纤维素。本发明所采用的醋酸纤维素，可以是二醋酸纤维素(简称DAC)，也可以是三醋酸纤维素(简称TAC)，还可以是两者的混合物。醋酸纤维素通过水解，使纤维素上的羟基裸露并活化，然后再通过环氧基化试剂的反应，从而可使所的载体具备环氧基基团。
[0071] 在一些实施例中，利用醋酸纤维素作为用于化学改造的高分子物质，首先将醋酸纤维素水解后用水洗至中性滤干，然后将滤干的纤维素与环氧化试剂进行环氧化反应，再用乙醇洗和水洗至中性并压干，得到含有环氧基团的高分子载体。
[0072] 在本发明中，醋酸纤维素可采用氢氧化钠溶液进行水解，所采用的氢氧化钠溶液浓度可以为0.1～2mol/L，优选为0.2～0.5mol/L。氢氧化钠用量通常为醋酸纤维素的2～8％(W/W)，优选为3～4％。在水解过程中，水解时间可以为0.5～2h，水解温度可以为60～
100℃。可优选在沸水浴的条件下保温水解1h左右。当水解反应结束时，醋酸纤维素的水解液的pH值为7～8左右。
100℃。可优选在沸水浴的条件下保温水解1h左右。当水解反应结束时，醋酸纤维素的水解液的pH值为7～8左右。
[0073] 醋酸纤维素经水解后，所得到的纤维素表面具有羟基，可用环氧氯丙烷进行处理环氧基修饰，也可采用液态低分子环氧树脂处理，直接进行环氧化反应，使醋酸纤维素获得环氧基，得到环氧基修饰的高分子载体。
[0074] 以下，再以聚乙烯醇(简称PVA)为例进行说明。
[0075] 聚乙烯醇外观为白色丝状，是一种用途相当广泛的水溶性高分子聚合物，其性能介于塑料和橡胶之间。PVA分子结构中含有羟基，可按照前述醋酸纤维素相同的过程，经水解、再通过醚化反应等胺基化反应引入苯胺基，然后再进行环氧基化处理，得到含有环氧基活化基团的环氧基修饰的高分子载体，该高分子载体表面具有的环氧基可与酶蛋白质分子上的功能基团以共价键形式结合形成固定化赖氨酸脱羧酶。
[0076] 在一些实施例中，由于胺基反应活性高于羟基，为了获得更好的环氧化效果，可在醋酸纤维素水解后用含苯胺基/胺基的试剂处理纤维素，将苯胺基/胺基引入后，再对引入的苯胺基/胺基进行环氧化处理，上述的将胺基引入的反应称为胺基化反应。
[0077] 在本发明中，对可引入苯胺基/胺基的试剂不做限定，任何可向含羟基的高分子物质引入苯胺基/胺基的试剂均可。
[0078] 在一些实施例中，采用带有苯胺基基团的醚化剂与含羟基的高分子物质通过醚化反应向含羟基的高分子物质中引入苯胺基基团，得到含苯胺基的高分子物质。例如可采用对β-硫酸酯乙砜基苯胺(简称SESA，是一种染料中间体)。在一些实施例中，将SESA用含2wt％碳酸钠的0.1N NaOH的溶液配制成10wt％的溶液，过滤除渣，取清液使用。
[0079] 在一些实施例中，采用带有胺基基团的醚化剂与含羟基的高分子物质，通过醚化反应，向含羟基的高分子物质中引入胺基基团，得到含胺基的高分子物质。例如可以采用：硅烷化试剂。
[0080] 在本发明中，对醚化反应的各条件参数不做限定。
[0081] 醚化试剂的浓度和用量，没有特别的限定，只要醚化试剂能够将含羟基的高分子物质安全醚化即可。
[0082] 醚化试剂可以为浓度1～40wt％的溶液形式，优选浓度可以为5～20wt％。
[0083] 在本发明中，进行醚化反应时，醚化试剂的用量范围可以为纤维素水解产物等含羟基的高分子物质的1～5倍，优选为1.5～3倍。
[0084] 醚化反应的温度可以为50～100℃，优选可以为80～100℃。
[0085] 醚化反应的pH值可以为4～12，优选可以为7～11。
[0086] 醚化反应的时间可以为0.5～3h，优选可以为1h～2h。醚化反应的固液比可以为5～50(w/v)，优选可以为10～20(w/v)。
[0087] 醚化反应的时间可以为0.5～3h，优选可以为1h～2h。
[0088] 醚化反应过程中，水浴保持反应温度70℃～100℃，滴加2N的NaOH或碳酸钠以控制醚化液的pH在7～12的范围内，当溶液pH不再下降时，采用沸水浴继续保温30分钟后，倾出醚化液，得到含胺基的高分子物质；用热的0.1N NaOH洗涤含胺基的高分子物质两遍，再用水洗涤至中性，甩干。
[0089] 例如，以纤维素水解产物为含羟基的高分子载体，经β-硫酸酯乙砜基苯胺醚化剂的上述醚化反应后，可得即得ABSE-C(β-乙砜基苯胺纤维素)载体。
[0090] 醚化处理得到的含胺基的高分子物质，可以在干燥状态下长期保存。至此，含羟基的高分子物质经醚化反应，得到含苯胺基/胺基的高分子物质。本发明优选所采用的另一种原始载体为含胺基的高分子载体，例如可以为：聚丙烯腈纤维。聚丙烯腈纤维，其分子结构中含有-CN，依次经过水解、重排处理后，分子结构中可含有胺基，得到含有胺基的高分子物质，再经环氧化处理，可得到修饰后含有环氧基的高分子载体，再与赖氨酸脱羧酶共价结合，形成固定化赖氨酸脱羧酶。
[0091] 在聚丙烯腈纤维的水解过程中，采用酸或碱都可以对聚丙烯腈纤维进行水解。所述的酸包括但不限于硫酸、盐酸、硝酸中的任一种或其组合。所述的碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾等中的任一种或其组合。在一些实施例中，采用硫酸对聚丙烯腈纤维进行水解，向硫酸溶液中投入聚丙烯腈纤维，可以在60～90℃保温水解3～6小时，优选可以在70～80℃水解4～5小时。水解时间与硫酸溶液的浓度相关。在一些实施例中，硫酸的浓度可以为
50％左右。聚丙烯腈纤维对50％的硫酸溶液的比可以为5～20(w/v)，优选可以为10～15(w/v)。
50％左右。聚丙烯腈纤维对50％的硫酸溶液的比可以为5～20(w/v)，优选可以为10～15(w/v)。
[0092] 水解所得的聚丙烯腈纤维在重排液中进行重排反应。在本发明中，可采用次氯酸钠溶液作为重排液。次氯酸钠的浓度范围可以为0.2～1％。在一些实施例中，用NaOH溶液将市售的次氯酸钠溶液(浓度为3～5％)稀释至0.2～1％作为重排液，其中NaOH溶液浓度可以为0.1～1mol/L，优选可以为0.2～0.6mol/L。在进行重排反应时，将重排液冷却至4℃左右后，投入上述水解得到的聚丙烯腈纤维。其中，聚丙烯腈纤维与重排液的反应比可以为5～20(w/v),优选可以为6～15(w/v)。重排反应结束后，将反应所得的载体用水洗涤至洗涤水为pH中性。经上述处理的载体可以在4℃左右保存适当时间。
[0093] 综上，环氧基修饰的高分子载体，可通过含羟基的高分子物质，如聚乙烯醇，或者经过反应如水解(包括酸水解及碱水解)可使分子中含有羟基的高分子物质，如醋酸纤维素水解产物、丁酸纤维素水解产物、聚酯纤维水解产物等，与环氧基化试剂反应，得到；或者，通过含羟基的高分子物质，与含苯胺基/含胺基的醚化剂，进行醚化反应，得到含苯胺基/胺基的高分子物质，再通过环氧化反应，得到环氧基修饰的高分子载体；或者，还可以利用含胺基的高分子物质，如聚丙烯腈纤维或聚酰胺纤维水解产物，经环氧化反应得到。高分子物质或经前述水解后与环氧基化试剂进行反应、或经水解、醚化后与环氧基化试剂进行反应，或经水解、重排后与环氧基化试剂进行反应制备。
[0094] 环氧基化反应中，常采用乙醇、水、或乙醇和水的混合物等作为环氧基化试剂的溶剂，优选地，以乙醇和水的混合物作为溶剂时，所得的固定化赖氨酸脱羧酶活力最好。本发明中，将乙醇与水的混合物作为溶剂溶解环氧基化试剂用于环氧化处理，可制备得到酶活力回收较高的固定化赖氨酸脱羧酶。本发明中采取的乙醇/水溶液的水含量按重量可以为10～99％，在一些实施例中，水含量可以为60～95％、70～90％或75～85％，在一些实施例中，水含量可以为80％。
[0095] 环氧基化试剂溶液的浓度可以为2％～15％，其中环氧氯丙烷的浓度优选可以为2～5％，环氧树脂的用量一般需高于环氧氯丙烷，例如可以为环氧氯丙烷浓度的2倍。
[0096] 环氧基化反应的时间与最终载体上所携带的环氧基团有关，一般来说，反应时间越长，载体上的环氧基团越多，可负载的酶就越多，但是过多的负载量也会造成酶活力的下降，因此，环氧基化的反应时间可根据最终需要的酶活力来确定，并可方便调整，本发明不做特别限定。在一些实施例中，，当使用环氧树脂作为环氧基化试剂进行环氧化时，环氧基化反应时间的范围可控制为24～72h，在一些实施例中，环氧基化反应间的范围为24～48h。
[0097] 在一些实施例中，当使用环氧氯丙烷作为环氧基化试剂进行环氧化时，可先用乙醇和水的混合物将环氧氯丙烷溶解，配制成2～5％的环氧氯丙烷溶液。
[0098] 进行环氧化反应时，可利用水浴控制反应温度范围所述环氧化反应的温度可以为50～70℃。
[0099] 进行环氧化反应时，反应同时可滴加2N的氢氧化钠水溶液催化反应。在环氧化反应过程中的前期，氢氧化钠起催化作用，在后期则是中和反应产生的盐酸，促进闭环作用产生环氧基。
[0100] 进行环氧化反应时，所述环氧化反应的反应时间可以为1～5h，，在一些实施例中，环氧基化反应时间的范围可以为2～3h。
[0101] 进行环氧化反应时，并控制反应结束时反应溶液的pH为6～8，优选为6.5～7.5。
[0102] 在一些实施例中，当使用环氧树脂作为环氧基化试剂进行环氧化时，与环氧氯丙烷相似，使用后的处理液可回收继续使用。
[0103] 本发明的固定化赖氨酸脱羧酶的制备过程可以为：将所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶于缓冲溶液中进行反应即得。
[0104] 赖氨酸脱羧酶相对于环氧基修饰的高分子载体的用量可调，所得的固定化赖氨酸脱羧酶都能保持很高的酶活力。在一些实施例中，在一个优选的实施方式中，赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述环氧基修饰的高分子载体为1500～34000U。在一些实施例中，赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述环氧基修饰的高分子载体为2000～3500U；在一些实施例中，赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述环氧基修饰的高分子载体为2500～3000U。
[0105] 在一些实施例中，赖氨酸脱羧酶液的活力浓度可控制在100～1000U/mL。
[0106] 所述环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶一般在缓冲溶液中进行反应。用于所述制备过程的缓冲溶液可选用的醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
[0107] 在一些实施例中，缓冲溶液的pH值为5～11，在一些实施例中，缓冲溶液的pH值为6～9，在一些实施例中，缓冲溶液的pH值为7～8。
[0108] 在一些实施例中，缓冲溶液中的离子浓度可以为0.1～2.0M，在一些实施例中，缓冲溶液中的离子浓度可以为1～2mol/L，在一些实施例中，缓冲溶液中的离子浓度可以为1.2～1.8mol/L。
[0109] 在一些实施例中，环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应温度为0～30℃，在一些实施例中，环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应温度为10～25℃，在一些实施例中，环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应温度为20～25℃。
[0110] 在一些实施例中，环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间为15～100小时，在一些实施例中，环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间为24～72小时；在一些实施例中，环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间为30～70小时；在一些实施例中，环氧基修饰的高分子载体与所述赖氨酸脱羧酶反应的反应时间为40～60小时。
[0111] 在一些实施例中，反应过程中还可进行搅拌，搅拌速度可以为50～200rpm；在一些实施例中，搅拌速度可优选为80～160rpm。
[0112] 所述制备过程还可以进一步包括：分离反应后所得的固定化赖氨酸脱羧酶，并洗涤除去固定化赖氨酸脱羧酶所残留的酶液，所得的固定化赖氨酸脱羧酶可冷藏备用。
具体实施方式
[0113] 下面通过实施例，对本发明的固定的技术方案进一步具体的说明。
[0114] 以下固定赖氨酸脱羧酶的实施例中一些定义如下：
[0115] 酶活定义：以赖氨酸盐为底物，每分钟内赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸盐生成1μmol 1,5-戊二胺所需的酶量为1个酶的活力单位U。
[0116] 半衰期检测定义：取制备的固定化赖氨酸脱羧酶4g，处理浓度为12％的赖氨酸溶液200mL，在37℃震荡反应2h左右，直至结束反应并分离固定化赖氨酸脱羧酶。重复上述操作(30次检测固定化赖氨酸脱羧酶活力，计算固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期)，直至与初始酶活力相比，酶活力降低50％，记录重复次数。
[0117] 以下固定赖氨酸脱羧酶的实施例中，聚乙烯醇、聚丙烯腈和醋酸纤维为市售材料，赖氨酸盐或者赖氨酸发酵液为自制，赖氨酸脱羧酶为自制。所述浓度如无特别说明均为质量浓度。
[0118] 本发明的涉及上述第一方面所述的沉淀富集的L-赖氨酸脱羧酶，无需利用透析或者疏水层析的方法除去硫酸铵(脱盐)，并利用特定的合成高分子物质使之固定化，显著提高固定化蛋白的酶活回收率。
[0119] 不同饱和度硫酸铵溶液的配制
[0120] 根据(NH4)2SO4溶液饱和度与温度和质量的对应关系如下：
[0121]
[0123] pH5.0，pH6.0，pH7.0，pH8.0的0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液配制方法见表1：
[0124] 表1.0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液配制方法。
[0125]
[0126]
[0127] 首先配置pH5.0，pH6.0，pH7.0，pH8.0的0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液，再按照上表称取对应质量的硫酸铵固体于溶液中，于室温溶解过夜后，用pH计对最终pH进行微调，得到的即为不同pH的含有缓冲体系的硫酸铵饱和溶液，由于是饱和溶液，必然会有少量晶体不能溶解，这些晶体就自然在容器中存在即可，不需要将上清移到新的容器中。
[0128] 制备实施例1含有赖氨酸脱羧酶的液体的制备
[0130] 将能够表达L-赖氨酸脱羧酶的蜂房哈夫尼基因工程菌(构建方法见申请公布号CN 102851307 A，申请公布日2013.01.02的中国发明专利申请的说明书的具体实施方式部分对重组菌Hac/pPlac-cadA-abt/abi的描述)甘油保存菌液接种于装有100ml LB液体培养基(包含1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉和1wt％氯化钠，自然pH，下同)的500ml种子培养瓶内，在30℃，250rpm摇床中培养15hrs。
[0131] (2)发酵
[0132] 在5L发酵罐内，加入3L LB培养基，121℃灭菌20min后以接入上述种子液开始发酵(发酵培养基为LB培养基)，于30℃，500rpm/min条件下开始发酵，控制通气流量为1vvm，罐压为0.1MPa；发酵过程中用碱溶液控制pH为7.0，发酵30小时后停止发酵。发酵结束后，6000r/min离心10min收集菌体(即湿菌体)。
[0133] (3)含有赖氨酸脱羧酶的液体的制备
[0134] 用50ml pH6.0的0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液悬浮离心收集的细胞，用高压破碎仪对细胞进行破碎，12000rpm，4℃离心10min去除细胞碎片和未裂解的细胞，上清为含有赖氨酸脱羧酶的液体。利用Bradford法测定赖氨酸脱羧酶溶液的蛋白浓度。
[0135] 制备例2醋酸纤维素的醚化反应
[0136] (1)将100g醋酸纤维素加入到2L的浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中，加入到热水中，水浴水解1小时，倾出水解液，用温水反复清洗至中性得水解后的纤维素。
[0137] (2)称取SESA，加入至20g/L浓度的碳酸钠水溶液中，加入氢氧化钠至其终浓度为到0.1mol/L，SESA浓度为100g/L，研磨溶解，待稳定后，用滤纸过滤，取清液为醚化液。
[0138] (3)称取50g步骤(1)中制得的水解后的醋酸纤维丝，加入300g步骤(2)中制得的醚化液，在60℃水浴加热条件下，进行醚化反应，反应同时滴加4mol/L的氢氧化钠溶液，手动搅拌，直至pH为9-11，停止加碱，继续搅拌反应1h。
[0139] (4)反应结束后，用60℃左右的热水清洗经过醚化的醋酸纤维素，然后用温水反复清洗至中性。
[0140] 固定赖氨酸脱羧酶的实施例1
[0141] (1)将制备例所得的醚化后的醋酸纤维素加入到160g 6％的环氧氯丙烷溶液中，其中，环氧氯丙烷溶液的溶剂中，水的含量为80％，乙醇含量为20％，滴加20％的NaOH水溶液，维持pH为7.5，在65℃处理2小时后用水洗涤，收集备用。
[0142] (2)取酶活为500U/g的赖氨酸脱羧酶溶液60g(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为1M的磷酸盐缓冲液)，pH值为7.0，将10g经环氧基化处理的醋酸纤维素加入至此酶液中，在30℃振荡搅拌进行固定化赖氨酸脱羧酶反应，反应48h后，分离固定化赖氨酸脱羧酶和残留酶液，用缓冲液洗涤固定化赖氨酸脱羧酶，得到纤维素固定化赖氨酸脱羧酶。
[0143] 测定固定化赖氨酸脱羧酶活力为1050U/g载体。
[0144] 用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经检测脱羧率可达到99.5％以上。
[0145] 经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用100次以上。
[0146] 固定赖氨酸脱羧酶的实施例2
[0147] (1)将制备例所得的醚化后的醋酸纤维素加入到160g 6％的环氧氯丙烷溶液中，其中，环氧氯丙烷溶液的溶剂中，水的含量为95％，乙醇含量为5％，滴加20％的NaOH水溶液，维持pH为7.5，在65℃摇床分别振荡处理2个小时后用水洗涤，收集备用。
[0148] (2)取酶活为500U/g的赖氨酸脱羧酶溶液60g(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为1.5M的磷酸盐缓冲液)，pH值为7.0，将10g经环氧基化处理的醋酸纤维素加入至此酶液中，在30℃振荡搅拌进行固定化赖氨酸脱羧酶制备，制备约48h后，将醋酸纤维素和酶液分开，用缓冲液洗涤醋酸纤维素，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
[0149] 测定固定化赖氨酸脱羧酶活力为900U/g载体。
[0150] 用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经检测脱羧率可达到99.5％以上。
[0151] 经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用100次以上。
[0152] 固定赖氨酸脱羧酶的实施例3
[0153] (1)将10g水解后的醋酸纤维素加入到80g环氧值为0.004mol/g的环氧树脂乙醇溶液中，搅拌均匀，在80℃水浴反应10h后用水洗涤，收集备用。
[0154] (2)取酶活为500U/g的赖氨酸脱羧酶溶液60g(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为1.5M的柠檬酸盐缓冲液)，pH值为7.0，将10g经环氧基化处理的醋酸纤维素加入至此酶液中，在30℃振荡搅拌进行固定化反应，反应48h后，分离固定化赖氨酸脱羧酶与残留酶液，用缓冲液洗涤固定化赖氨酸脱羧酶，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
[0155] 测定固定化赖氨酸脱羧酶活力为800U/g载体。
[0156] 用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经检测脱羧率可达到99.5％以上。
[0157] 经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用100次以上。
[0158] 固定赖氨酸脱羧酶的实施例4
[0159] (1)将10g水解后的醋酸纤维素加入到80g环氧值为0.004mol/g的环氧树脂乙醇溶液中，搅拌均匀，在室温放置10h后用水洗涤纤维，收集备用。
[0160] (2)取酶活为500U/g的赖氨酸脱羧酶溶液60g(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为2M的磷酸盐缓冲液)，pH值为7.0，将10g经环氧基化处理的醋酸纤维素加入至此酶液中，在30℃振荡搅拌进行固定化赖氨酸脱羧酶制备，制备约48h后，将醋酸纤维素和酶液分开，用缓冲液洗涤，得到固定化赖氨酸脱羧酶。
[0161] 测定固定化赖氨酸脱羧酶活力为700U/g载体。
[0162] 用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经检测脱羧率可达到99.5％以上。
[0163] 经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用100次以上。
[0164] 固定赖氨酸脱羧酶的实施例5
[0165] (1)称取20g聚丙烯腈纤维，加入300g 6N NaOH溶液，搅拌均匀，在65℃水浴中水解5h后，用水洗涤聚丙烯腈纤维3-5次，沥干水分。将8g水解后的聚丙烯腈纤维加入0.2％次氯酸钠溶液150mL，在4℃左右进行重排反应，将反应所得的载体用水洗涤至洗涤水为pH中性。
[0166] (2)经上述处理的载体加入到80g环氧值为0.004mol/g的环氧树脂乙醇溶液中，搅拌均匀，放置10h收集聚丙烯腈纤维，用乙醇洗涤1遍，再用水洗涤3-5遍，沥压干水分备用。
[0167] (3)称取环氧化处理的聚丙烯腈载体5g置于250ml三角瓶中，按照固液比为1∶10加入500U/g赖氨酸脱羧酶酶液(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为2M的柠檬酸盐缓冲液)，pH值为7.0，在100rpm摇床振荡反应24h，反应结束后收集固定化赖氨酸脱羧酶，除去剩余酶液，将固定化赖氨酸脱羧酶用水洗涤3遍，获得聚丙烯腈纤维固定化赖氨酸脱羧酶。
[0168] 测定固定化赖氨酸脱羧酶活力为650U/g载体。
[0169] 用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经检测脱羧率可达到99.5％以上。
[0170] 经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用100次以上。
[0171] 固定赖氨酸脱羧酶的实施例6
[0172] (1)称取20g聚丙烯腈纤维，加入300g 6N NaOH溶液，搅拌均匀，在65℃水浴中水解5h后，用水洗涤聚丙烯腈纤维3-5次，沥干水分。将8g水解后的聚丙烯腈纤维加入0.2％次氯酸钠溶液150mL，在4℃左右进行重排反应，将反应所得的载体用水洗涤至洗涤水为pH中性。
[0173] (2)经上述处理的载体加入到80g 12％的环氧氯丙烷溶液(水的含量为80％，乙醇含量为20％，)中，搅拌均匀，在室温放置10h收集聚丙烯腈纤维，用水洗涤3-5遍，沥压干水分备用。
[0174] (3)称取环氧化处理的聚丙烯腈载体5g置于250ml三角瓶中，按照固液比为1∶10加入500U/g赖氨酸脱羧酶酶液(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为1.5M的醋酸盐缓冲液)，pH值为7.0，在100rpm摇床振荡反应24h，反应结束后收集固定化赖氨酸脱羧酶，除去剩余酶液，将固定化赖氨酸脱羧酶用水洗涤3遍，获得聚丙烯腈纤维固定化赖氨酸脱羧酶。
[0175] 测定固定化赖氨酸脱羧酶活力为900U/g载体。
[0176] 用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经检测脱羧率可达到99.5％以上。
[0177] 经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用100次以上。
[0178] 固定赖氨酸脱羧酶的实施例7
[0179] (1)在100g醋酸纤维素中加入到2L的浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中，加入到热水中，水浴水解1小时，倾出水解液，用温水反复清洗至中性得水解后的纤维素。
[0180] (2)将步骤(1)制得的醋酸纤维素加入到150g 8％的环氧氯丙烷溶液中，其中，环氧氯丙烷溶液的溶剂中，水的含量为90％，乙醇含量为10％，滴加20％的NaOH水溶液，维持pH为8，在65℃处理2.5小时后用水洗涤，收集备用。
[0181] (3)取酶活为500U/g的赖氨酸脱羧酶溶液60g(赖氨酸脱羧酶的量基于每克所述高分子载体为3000U，溶液为离子浓度为1.5M的磷酸盐缓冲液)，pH值为7.0，将10g经环氧基化处理的醋酸纤维素加入至此酶液中，在25℃振荡搅拌进行固定化赖氨酸脱羧酶反应，反应48h后，分离固定化赖氨酸脱羧酶和残留酶液，用缓冲液洗涤固定化赖氨酸脱羧酶，得到纤维素固定化赖氨酸脱羧酶。
[0182] 测定固定化赖氨酸脱羧酶活力为650U/g载体。
[0183] 用上述实施例所得的固定化赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸溶液中的赖氨酸进行脱羧，经检测脱羧率可达到99.5％以上。
[0184] 经脱羧反应后的固定化赖氨酸脱羧酶，可经离心、过滤等方式，从溶液中经固液分离回收，回收的固定化赖氨酸脱羧酶可重复使用多次进行脱羧反应。该固定化赖氨酸脱羧酶的半衰期(与初始酶活力相比，酶活力降低50％)为重复使用100次以上。
[0185] 本发明的方法的进一步研究。
[0186] 下文所述的各实验，除非特别指明，盐析实验都在室温(25℃)下完成。
[0187] 含有赖氨酸脱羧酶的液体用不同浓度的硫酸铵沉淀方法
[0188] 表2硫酸铵沉淀赖氨酸脱羧酶的方法。
[0189]
[0190] pH8.0条件下不同硫酸铵浓度的混合液对赖氨酸脱羧酶沉淀的影响
[0191] 考虑到赖氨酸脱羧酶CadA蛋白是一个十聚体蛋白，蛋白浓度和pH会对它的聚合形式产生影响，在低pH时，赖氨酸脱羧酶CadA以十聚体甚至更高级的多聚体形式存在，而高pH时，赖氨酸脱羧酶CadA往往会解聚为二聚体。因此在摸索其硫酸铵沉淀的条件时必须考虑到环境的pH会通过影响蛋白的聚合形式从而造成在不同的硫酸铵浓度条件下的沉淀状态。因此在本实验中，首先将pH固定到8.0，在此条件下摸索不同浓度的硫酸铵对赖氨酸脱羧酶CadA的沉淀的影响情况。
[0192] 分别使用硫酸铵浓度为饱和度的15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％和50％的混合液进行盐析，沉淀用等体积pH8.0的0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液悬浮，上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，评价对蛋白的沉淀效果，结果如图1所示。
[0193] pH8.0条件下，当混合液中含有的硫酸铵的浓度为饱和度的15％～30％时，蛋白大部分都存在于上清中，且CadA和杂蛋白不能有效的分开，沉淀中会出现一条蛋白条带，它是CadA的条带。当硫酸铵的浓度为饱和度的35％时，沉淀中开始出现杂蛋白的条带，浓度为硫酸铵饱和度的35％和40％为CadA蛋白沉淀与否的临界饱和度，当硫酸铵浓度上升到饱和度的40％时，大部分CadA蛋白发生了沉淀，上清中会留下很少一部分CadA和一部分杂蛋白；当硫酸铵的浓度继续上升，到为饱和度的45％和50％时，裂解液中的CadA完全沉淀，全部出现在了沉淀中，但对应的上清中杂蛋白的量也比35％和40％要少；可见CadA与杂蛋白并不能很严格的明显区分开，最大程度去除杂蛋白时，也会面临目的蛋白的损失，如果不损失目的蛋白，那么杂蛋白的去除率从结果中看也会降低。
[0194] 不同pH以及不同浓度的硫酸铵对赖氨酸脱羧酶发酵裂解液(即含有赖氨酸脱羧酶的液体)的沉淀效果
[0195] 由于CadA蛋白的聚合形式会随pH的改变而变化，因此在同样硫酸铵浓度下，pH也会影响CadA蛋白的沉淀情况，于是根据上述实验的结果，选择了三个硫酸铵的浓度：硫酸铵浓度为饱和度的35％-pH8.0时CadA大部分在上清中；硫酸铵浓度为饱和度的40％-pH8.0时CadA大部分在沉淀中；硫酸铵浓度为饱和度的45％-pH8.0时CadA完全在沉淀中；在四个不同的pH条件下观察赖氨酸脱羧酶的沉淀情况。结果如图2和图3所示。
[0196] 从图2和图3中可以看出，当硫酸铵浓度为饱和度的35％时，从pH8.0逐步降低pH，CadA会从上清中逐步转移到沉淀中；pH5.0条件下，CadA全部出现在了沉淀中，上清中主要为杂蛋白，但还是如同上面所说的，始终有一部分杂蛋白与CadA同时存在，不能绝对的与CadA分开。为了再更大程度的除掉杂蛋白，在pH5.0条件下，进一步降低硫酸铵的浓度。虽然在硫酸铵的浓度为饱和度的40％时，降低pH，也会使CadA蛋白由上清向沉淀中转移，但比较pH5.0时，浓度为饱和度的35％的硫酸铵沉淀下来的杂蛋白条带比40％沉淀下来的要多，同时考虑到成本问题和后续尽量减少沉淀中硫酸铵的盐离子浓度的目的，选择硫酸铵浓度为饱和度的35％，pH5.0的条件继续研究。
[0197] pH5.0条件下不同硫酸铵浓度的混合液对赖氨酸脱羧酶发酵裂解液(含有赖氨酸脱羧酶的液体)的沉淀效果
[0198] 在pH5.0条件下，选择硫酸铵的浓度为饱和度的15％，20％，25％，30％，35％，同时考虑温度对硫酸铵沉淀效果的影响，选择了室温和4℃分别进行沉淀；对上清和沉淀溶液分别进行SDS-PAGE检测，结果如图4和图5所示；从中可以看出，在室温下进行沉淀，pH5.0时，硫酸铵浓度为饱和度的35％时可以实现CadA蛋白全部沉淀，留在上清中的全部都是杂蛋白；而逐步降低硫酸铵的浓度，沉淀的蛋白中CadA的量逐步减少，硫酸铵的浓度为饱和度的30％时还可以检测到沉淀中一定量的CadA蛋白，但是更低的硫酸铵的浓度时，沉淀中的CadA几乎检测不到了，相应的杂蛋白的量也几乎检测不到了。这说明在pH5.0条件下，硫酸铵浓度为饱和度的30％和35％对于CadA蛋白的沉淀及富集有利，从SDS-PAGE上(图4和图5)看，硫酸铵浓度为饱和度的30％时在除掉杂蛋白时损失的目的蛋白也较多。
[0199] 而在4℃条件下进行同样的沉淀操作，由于4℃条件下硫酸铵的溶解度会出现降低，所以这种情况下硫酸铵浓度为饱和度的35％的沉淀效果和室温下硫酸铵浓度为饱和度的30％的沉淀效果一致。
[0200] pH5.0，硫酸铵浓度为饱和度的30％和35％的混合液沉淀蛋白效率以及未脱盐沉淀活性的测定
[0201] 对pH5.0条件下，硫酸铵浓度为饱和度的30％和35％的混合液沉淀的蛋白以及未沉淀的蛋白进行蛋白浓度的测定，并计算蛋白回收率，结果如下表3所示，从中可以看出，无论用硫酸铵浓度为饱和度的30％还是35％的混合液进行沉淀实验，总蛋白都并无显著的损失，只是分开分布在上清和沉淀中了；硫酸铵浓度为饱和度的35％的混合液沉淀的蛋白浓度回收率为60.35％，相比较30％的饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白而言多了20％。
[0202] 表3.沉淀后上清和沉淀中蛋白浓度测定及蛋白回收率计算。
[0203]
[0204] 为了确定沉淀重悬的蛋白仍然具有赖氨酸脱羧酶的活性，并且同时比较沉淀前和沉淀后的蛋白的活性的差异，使用等量(48μg或96μg)未沉淀的赖氨酸脱羧酶(HKCadA)和硫酸铵浓度为饱和度的30％，35％的混合液沉淀的蛋白进行L-赖氨酸转化实验，反应pH为6.0，按如下体系配制反应：
[0205]
[0206] 反应时间为2hrs，温度为37℃，在沸水浴中煮沸10min结束酶反应，后向核磁管中加入100μl D2O:DMSO＝30：1作为内标，并加入500μl反应液，利用核磁共振检测反应体系中剩余的L-赖氨酸的量，以此计算生成的戊二胺的量和L-赖氨酸转化率。结果如图6所示，在使用等量(48μg或96μg)催化反应时，硫酸铵浓度为饱和度的35％的混合液沉淀后的蛋白反应2hrs后的L-赖氨酸转化百分比相比较未沉淀的蛋白而言提高了近一倍，而同样蛋白浓度的硫酸铵浓度为饱和度的30％的混合液沉淀的蛋白的L-赖氨酸转化率相对于未沉淀的蛋白而言提高了约1.5倍。结合表3中蛋白浓度的测定数据，可以反推出沉淀后未经脱盐处理的L-赖氨酸脱羧酶活性与未经沉淀的蛋白原液相比几乎无损失。据此本发明提出将L-赖氨酸脱羧酶纯化后，不经过脱盐，进行固化。
[0207] 硫酸铵浓度为饱和度的30％和35％的混合液沉淀的蛋白制备固定化酶[0208] 在pH5.0条件下分别用硫酸铵浓度为饱和度的30％和35％的混合液制备沉淀蛋白，沉淀蛋白用pH6.0的0.2M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液悬浮。将未沉淀和沉淀的蛋白稀释到同样的酶活为500U/g，分别制备固定化酶。制备固定化酶时所使用的高分子物质为环氧基化处理的醋酸纤维素，给酶总量如表4所示，按3000U/g载体的比例称取载体，加入到赖氨酸脱羧酶酶液中，具体做法参见固定赖氨酸脱羧酶的实施例1，得到纤维素固定化赖氨酸脱羧酶制备固定化酶过程中的参数，包括制备后剩余酶液量，剩余酶液酶活，洗液量，洗液酶活，固定化酶活力，酶活回收率以及固定化效率，如表4所示；从中可以看出，硫酸铵浓度为饱和度的35％的混合液沉淀的蛋白的固定化酶活力最高，相比未沉淀的酶液而言增加了～10％；硫酸铵浓度为饱和度的35％的混合液沉淀的蛋白相比未沉淀酶液制备的固定化酶的酶活回收率增加了4％。
[0209] 表4.固定化酶制备效率计算
[0210]
[0211] 备注：定义一个酶活力单位为单位时间内催化L-赖氨酸转化为戊二胺的μmol数，[0212] 酶活回收率＝固定化酶活力×固定化酶量/给酶总量×100％。
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