技术领域
[0001] 本
发明属于金属材料制备技术领域,特别涉及一种中药提取环肽改性的金属表面的制备及防污评价方法。
背景技术
[0002] 当船体浸入到
海水中,其表面会很快被细菌或其它
微生物附着,造成船体表面的污损现象,生物污损现象是全球航运业面临的严重问题,它降低了
船舶机动性,提高了运营成本,目前船体常用的涂料对周围环境造成危害,不易于海洋环境的保护。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于,为了克服
现有技术中的
缺陷,提供一种中药提取环肽改性的金属表面的制备及防污评价方法,解决现有技术中船用金属材料表面生物污损的技术问题,使用本发明修饰金属表面可以提高防污性能。
[0004] 本发明的目的是这样实现的:一种中药提取环肽改性的金属表面的制备方法,包括以下步骤:(1)将紫花地丁晾干、碾碎成粉末;
(2)使用10L
乙醇和水的混合溶液提取1000 g紫花地丁粉末中的抗菌环肽,并以
微波辅助;
(3)通过高速离心将含有紫花地丁的溶解液实现固液分离,以获得含有抗菌环肽的溶液;
(4)使用高效液相色谱仪分离、纯化抗菌环肽;
(5)使用0.1µM 三(2-羧乙基)膦和0.5 µg/µL的胰蛋白酶还原和消化环肽;
(6)选取304不锈
钢为基底,将其抛磨至镜面,清洗、干燥后使用2 mg/mL的多巴胺溶液浸泡24h,从而得到表面活化的
不锈钢;
(7)将活化的不锈钢表面浸入抗菌环肽的溶液中24 h,取出样本,在氮气环境下晾干。
[0005] 为了进一步实现抗菌环肽的分离纯化,所述步骤(4)中,使用体积比为0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液为洗脱液的A液,含有体积比0.1% TFA的80%乙腈水溶液为洗脱液的B液。
[0006] 为了进一步方便分析抗菌环肽本身的生物化学特性,所述步骤(5)中,还原和消化环肽后,使用液相质谱仪和元二色
光谱仪分别获得抗菌环肽的
氨基酸序列及空间结构;此设计中,通过获得氨基酸序列及空间结构,分析抗菌环肽本身的生物化学特性,以便后续改进环肽的结构和性能,提高所制备改性表面的理化性能。
[0007] 作为本发明的进一步改进,所述步骤(2)中,乙醇和水的体积比为3:2。
[0008] 使用制备出的抗菌环肽修饰表面进行防污评价的方法,包括以下步骤:(1)选用海洋优势菌株需钠弧菌、法式
柠檬酸杆菌和芽孢杆菌,优势海藻三
角褐指藻、小球藻和舟形藻,将细菌和海藻分别培养;
(2)将制备出的样本分别浸入细菌和海藻培养液中,将制备出的样本分别浸入细菌和海藻培养液中,一段时间后取出样本,清洗后使用戊二
醛固定,一段时间后取出样本,清洗细菌溶液浸泡后的样本,使用碘化丙啶
染色30min,然后洗掉残留的溶液,过程需注意避光;
将海藻溶液浸泡后的样本使用戊二醛固定,利用激光共聚焦
荧光显微镜观察样本表面细菌/海藻粘附变化,计算和分析样本表面的细菌/海藻粘附率变化,分析抗菌环肽修饰表面的抗菌/海藻机理,为获得具有抗菌/海藻的绿色防污表面提供方法和理论依据。
[0009] 本发明与其他防污材料制备方法相比,是以硬质金属为研究对象,抗菌环肽修饰表面不仅具有绿色环保的特点,而且原料易得,操作简单,可以大批量、大面积的制备。
附图说明
[0010] 图1为中药紫花地丁提取环肽修饰的金属防污表面制备及防污评价方法
流程图。
[0011] 图2为本发明中环肽改性前样本需钠弧菌附着图。
[0012] 图3为本发明中环肽改性后样本需钠弧菌附着图。
[0013] 图4为环肽改性前样本表面法式柠檬酸杆菌附着图。
[0014] 图5为环肽改性后样本表面法式柠檬酸杆菌附着图。
[0015] 图6为环肽改性前样本表面芽孢杆菌附着图。
[0016] 图7为环肽改性后样本表面芽孢杆菌附着图。
[0017] 图8为环肽改性前样本表面小球藻附着图。
[0018] 图9为环肽改性后样本表面小球藻附着图。
[0019] 图10为环肽改性前样本表面三角褐指藻附着图。
[0020] 图11为环肽改性后样本表面三角褐指藻附着图。
[0021] 图12为环肽改性前样本表面舟形藻附着图。
[0022] 图13为环肽改性后样本表面舟形藻附着图。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图和实施方法对本发明作进一步说明。
[0024] 如图1所示的一种中药提取环肽改性的金属表面的制备方法,包括以下步骤:(1)将紫花地丁晾干、碾碎成粉末;
(2)根据天然产物化学成分与
溶剂间“极性相似相溶”原理,使用10L乙醇和水的混合溶液提取1000 g紫花地丁粉末中的抗菌环肽,并以微波辅助,乙醇和水的体积比为3:2,微波辅助的时间为0.5-3h,
温度保持20±2℃;
(3)通过高速离心将含有紫花地丁的溶解液实现固液分离,以获得含有抗菌环肽的溶液;
(4)使用高效液相色谱仪分离、纯化抗菌环肽;
(5)使用0.1µM 三(2-羧乙基)膦和0.5 µg/µL的胰蛋白酶还原和消化环肽,再使用液相质谱仪和元二色光谱仪分别获得抗菌环肽的氨基酸序列及空间结构;
(6)选取304不锈钢为基底,将其抛磨至镜面,清洗、干燥后使用2 mg/mL的多巴胺溶液浸泡24h,从而得到表面活化的不锈钢;
(7)将活化的不锈钢表面浸入抗菌环肽的溶液中24 h,取出样本,在氮气环境下晾干。
[0025] 其中,步骤(2)中,保持的温度优选为20℃,步骤(4)中,使用体积比为0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液为洗脱液的A液,含有体积比0.1% TFA的80%乙腈水溶液为洗脱液的B液。
[0026] 使用制备出的抗菌环肽修饰表面进行防污评价的方法,包括以下步骤:(1)选用海洋优势菌株需钠弧菌、法式柠檬酸杆菌和芽孢杆菌,优势海藻三角褐指藻、小球藻和舟形藻,将细菌和海藻分别培养;
(2)将制备出的样本分别浸入细菌和海藻培养液中,一段时间后(细菌溶液浸泡24 h,海藻溶液浸泡7天)取出样本,清洗细菌溶液浸泡后的样本,使用碘化丙啶(PI,50 µg/mL,溶剂为人工
海水)染色30min,然后洗掉残留的溶液,过程需注意避光;将海藻溶液浸泡后的样本使用戊二醛(2.5%)固定,利用激光共聚焦荧光显微镜(CLSM)观察样本表面细菌/海藻粘附变化,使用Image J计算和分析样本表面的细菌/海藻粘附率变化,分析抗菌环肽修饰表面的抗菌/海藻机理,为获得具有抗菌/海藻的绿色防污表面提供方法和理论依据(例如,如果观察到附着在样本表面的微生物
生物膜破裂,则认为修饰表面的环肽残基与微生物细胞壁发生的作用,使其破裂,从而实现抗菌/海藻的目的)。
[0027] 具体实施时,本发明从中药紫花地丁(采集自四川省永川县的中草药紫花地丁)中提取抗菌环肽,利用抗菌环肽改性304不锈钢表面,获得抗菌环肽修饰的不锈钢表面,通过海洋污损生物的静态粘附实验评价改性表面防污性能,具体工艺步骤如下:(1)选用紫花地丁为原料,将其晾干、碾碎后,用3.5 L二氯甲烷浸泡800 g紫花地丁粉末24 h,然后滤去大颗粒粉末,在96 h内重复三次,将二氯甲烷
蒸发后即可获得紫花地丁粗提物,用3.5 L乙醇/水(体积比3:2)浸泡48小时,然后通过高速离心将含有紫花地丁的溶解液实现固液分离,以获得含有抗菌环肽的溶液;
(2)使用凝胶柱色谱从正丁醇级分中分离出环
氧化物(3 cm内径×42 cm长的色谱柱,装有70-230目
硅胶),并利用 CHCl3 和 无水乙醇的混合物洗涤样品,以 70 滴/min的速率增加乙醇的比例至 100%;
(3)使用高效液相色谱仪进一步分离提纯样本,其中A液为0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液,B液是含有0.1% TFA的80%乙腈水溶液,将时间设定为25 min,B液百分比从10%至70%线性增大,洗脱液在HPLC中的流速为4 mL / min;
(4)使用低温
真空干燥器处理每组流份,获得抗菌环肽粉末;
(5)使用0.1µM 三(2-羧乙基)膦和0.5 µg/µL的胰蛋白酶还原和消化抗菌环肽,然后使用液相质谱仪和元二色光谱仪分别获得抗菌环肽的氨基酸序列及空间结构;
(6)利用多巴胺作为
偶联剂(多巴胺溶液pH=8.5,浓度为2 mg/mL),将抗菌环肽结合在不锈钢表面(样本浸泡24 h),不锈钢的表面呈现暗黑色;
(7)分别使用XPS、
接触角测量仪、表面轮廓仪表征样本表面的化学成分、亲疏水性和表面形貌,分析采集的数据得到样本表面的粗糙度、表面能和
稳定性;
(8)选用需钠弧菌、法式柠檬酸杆菌、芽孢杆菌、海藻三角褐指藻、小球藻和舟形藻,分别扩大培养细菌和海藻至对数期,将抗菌环肽修饰的金属表面浸泡在稀释后的菌液中,每隔12 h观察细菌粘附情况,将抗菌环肽修饰的金属表面浸泡在稀释后的海藻溶液中,每隔
24 h观察海藻粘附情况(海藻的附着实验需要12 h黑暗、12 h光照交替的条件);
(9)使用戊二醛固定溶液浸泡实验后样本,将细菌溶液浸泡的样本使用PI染色,海藻溶液浸泡的样本放入-4℃
冰箱内待用,使用激光共聚焦荧光显微镜采集附着荧光图,观察样本表面细菌/海藻粘附率的变化,利用Image J计算
吸附量。实验结果显示:原始样本表面需钠弧菌、法式柠檬酸杆菌和芽孢杆菌的附着率分别为4.505%、6.13%和6.347%,改性样本表面三种海洋细菌的附着率分别为0.796%、0.894%和0.618%,与原始样本相比,三种海洋菌在环肽修饰后的表面附着率分别降低了82.33%、85.42%和90.26%(图2-图7);原始样本表面小球藻、三角褐指藻和舟形藻的附着率分别为8.51%、8.60%和2.23%,改性样本表面三种海洋细菌的附着率分别为0.697%、0.468%和0.358%,与原始样本相比,三种海藻在环肽修饰后的表面附着率分别降低了92.02%、94.56%和83.95%(图8-图13),这证明环肽修饰的表面具有明显的抗细菌/海藻吸附性能;其中,图2-图7中的白点为细菌附着量,图8-图13中的白点为海藻的附着量。
[0028] 本发明与其他防污材料制备方法相比,是以硬质金属为研究对象,抗菌环肽修饰表面不仅具有绿色环保的特点,而且原料易得,操作简单,可以大批量、大面积的制备。
[0029] 本发明并不局限于上述
实施例,在本发明公开的技术方案的
基础上,本领域的技术人员根据所公开的技术内容,不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和
变形,这些替换和变形均在本发明的保护范围内。