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一种能瓦解和抑制细菌生物被膜的生成的皮克林乳液及其制备和应用

阅读：762发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种能瓦解和抑制细菌生物被膜的生成的皮克林乳液及其制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于生物技术领域，公开了一种能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液及其制备和应用。本发明利用亲水性氨基功能化二氧化硅的氨基与油相主要成分柠檬醛在水油界面处发生原位反应，生成希夫碱，从而降低氨功能二氧化硅的水溶性，将其迁移至油相系统，且不改变其特有的纳米形态，同时通过乳化均质，获得稳定O/W型皮克林乳液多通道运载体系。所得皮克林乳液可有效降低铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中弹性蛋白酶、胞外蛋白水解酶、鼠利糖脂、藻酸盐的水平和活性以及绿脓菌素的表达等生物被膜形成过程所涉及的毒力因子，从而抑制生物被膜的形成，并降低其感染性；同时，对已形成的生物被膜的消除瓦解能力显著。，下面是一种能瓦解和抑制细菌生物被膜的生成的皮克林乳液及其制备和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液，其特征在于主要包括以下成分：柠檬醛、右旋龙脑、氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒和水；
所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液主要包括以下质量分数的组分：
柠檬醛                                          0.1～0.95％
右旋龙脑                                        1～18.5％
含有氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的水      80.55～98.9％
其中，含有氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的超纯水中氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的质量分数为0.05～0.95wt％；所述的含有氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的超纯水的pH值为6～12。
2.根据权利要求1所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液，其特征在于：
所述的柠檬醛的纯度在96％以上；
所述的右旋龙脑是通过水蒸气法从梅片树叶提取得到粗油，接着将粗油经多次冷冻结晶，离心分离获得，纯度在98％以上；
所述的氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒是采用改进的法制备得到。
3.根据权利要求1所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液，其特征在于：所述的细菌指革兰氏阴性假单胞菌。
4.根据权利要求3所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液，其特征在于：所述的细菌是铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌或恶臭假单胞菌。
5.一种根据权利要求1～4任一项所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将粉末状右旋龙脑溶解入柠檬醛中，得到油相体系1；
(2)氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒(SiO2-NH2)与水混合均匀，调节至pH＝6～
12，得到水相体系2；
(3)将油相体系1加入至水相体系2中，滴加过程在5min内完成，同时利用乳化均质机在
10000～24000r/min的转速条件下，乳化均质20～50分钟，直至形成均一稳定半透明浅乳白色溶液，为体系3；
(4)将体系3密封，并于20～30℃避光保存；
(5)将避光保存的体系3过滤，滤液即为能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液。
6.根据权利要求5所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的粉状右旋龙脑颗粒大小在100目以上，且不产生粘连，结块；步骤(2)中所述的氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的粒径在80～180nm之间；步骤(4)中所述的避光保存的时间为30天以上；步骤(5)所述的过滤采用真空抽滤，滤材采用PTFE。
7.根据权利要求5所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的乳化均质机的转速条件为24000r/min；乳化均质时间为20min；
步骤(4)中所述的避光保存的温度为25℃；所述的保存的时间为80天。
8.根据权利要求1～4任一项所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液在制备治疗由革兰氏阴性假单胞菌引起的生物膜疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求1～4任一项所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液在制备清除由革兰氏阴性假单胞菌引起的生物膜污染的日化产品中的应用。

说明书全文

一种能瓦解和抑制细菌生物被膜的生成的皮克林乳液及其制

备和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液，具体涉及一种能够结合并抑制外膜毒力因子弹性蛋白中的特异表位并抑制外膜毒力因子弹性蛋白功能的具有抑制假单胞菌生物膜形成和减少现有生物膜作用的皮克林乳液及其制备和应用。

背景技术

[0002] 假单胞菌(Pseudomonadaceae)是临床上获得性感染中重要的条件致病菌，其致病力主要在于它可以在医疗器械表面形成生物被膜，从而使使用这些器械治疗的病人感染铜绿假单胞菌的几率大大增加。由于形成生物膜的铜绿假单胞菌可以抵抗多种抗生素和宿主免疫系统的清除作用，由假单胞菌生物膜造成的医用材料相关感染的难治性已被临床广泛关注，而由假单胞菌引起的慢性难治性下呼吸道感染也与生物膜形成密切相关。因此，具有抑制细菌生物膜形成作用的相关药物在发挥治疗生物膜感染性疾病方面具有广泛的应用前景。

[0003] 研究表明，在假单胞菌形成生物膜的过程中，细菌可以通过向细胞外释放多糖、核酸、蛋白质等多种物质促使细菌间发生相互粘附聚集，从而辅助和加强细菌菌落的聚集和细菌生物膜的形成；在这些辅助细菌生物膜形成的物质当中，群体感应(Quorum Sensing，QS)信号因子是诱导铜绿假单胞菌相互粘附聚集和生物膜形成的一种重要细胞外小分子化合物，该化合物的合成由外膜毒力因子弹性蛋白中的LasI蛋白和RhlR蛋白所调控。所述的外膜毒力因子弹性蛋白主要由A、B两个结构域构成，通过蛋白C端的特殊基序锚连在假单胞菌的细胞壁上发挥介导假单胞菌形成细菌生物膜的作用。现有文献证明针对RhlR蛋白基因截短蛋白OMPRhlr2.0的动物免疫血清、抗体或者小分子抑制剂可明显抑制假单胞菌生物膜的形成。

[0004] 基因组学研究也证明，QS调控假单胞菌的致病力，由细菌相关信号介导，转录调节人工构建的转录因子，可调控致病菌毒力基因表达作用。因此，通过干扰QS系统来降低致病菌毒力因子产生、抑制生物膜的形成以及提高抗感染药物敏感性是一个很有前景的手段，将为研制治疗假单胞菌感染的药物带来新的启发。

[0005] 随着假单胞菌类耐药机制的深入研究，非传统抗生素防治是当下抑制生物被膜形成和阻断其群感效应的有效策略。尤其是典型性革兰氏阴性模式菌-铜绿假单胞菌的耐药机制的深入研究，给临床治疗带来新的机遇和挑战。

[0006] 目前已报道的处于授权、公开或实审状态的关于抑制假单胞菌生物被膜形成或瓦解其已有被膜的国家发明专利中，作用于假单孢菌的药物主要有D-色氨酸，纳米环丙沙星颗粒，新型乳酸菌，噬菌体，Ps1G蛋白和黄芩苷等。以上生物被膜防控体系等都能在一定程度上抑制假单孢菌生物被膜的生成。其中已授权专利-黄芩苷在抗细菌感染和预防细菌感染中的应用(专利号：201010202023.2)是唯一一例将我国中草药-黄芩的活性成分，黄芩苷及其衍生物，应用于抗细菌感染及预防细菌感染中，且其在抗铜绿假单胞菌感染药物及预防铜绿假单胞菌感染药物发挥效果显著。

[0007] 而中草药历来是我国丰富的医用化合物宝库，中草药制剂及天然活性提取成分在各类感染性疾病的预防治疗方面著有特殊优势。但迄今为止，尚没有关于天然产物-柠檬醛与右旋龙脑二者联合用药，治疗由假单胞菌等引起的感染的报道。一方面，中草药活性成分如血根碱、白桦脂酸、紫檀茋、白屈菜红碱在生物被膜防治方面效果显著，另一方面，天然活性产物的稳定性较差，易挥发和溶解性较低等，用药量与被膜抑制率一般呈正相关关系，且一般用量较大，即具有剂量依赖性，增加投入成本。一般用乙醇或其他有机试剂溶解后对呼吸道等具有刺激性等缺点，限制其广泛应用。因此，利用功能化纳米分子材料对天然抑菌活性成分进行包埋封装，获得水溶性的、稳定的、具有缓释作用，效果持久的生物被膜防控体系是当前研究的热点。

[0008] 研究表明，右旋龙脑是一种有效的渗透促进剂、透皮促进剂，被证实能提高其他药物在器官、组织及细胞表面的的生物利用率；我国古籍《本草衍义》也有记载龙脑“独行则势弱，佐使则有功”；而山苍子是我国特有的香料植物资源之一，国外少有发现，其精油的主要成分-柠檬醛具有广谱抑菌活性；因此，两者配合使用，制备具有抑制生物被膜生成和消除已有被膜的复合制剂，将达到事半功倍的效果。

[0009] 本发明制剂属于纳米粒子生物被膜防控体系，其主要成分柠檬醛、右旋龙脑等均为天然植物活性成分，其溶剂为超纯水，能够有效地抑制生物被膜的生成并瓦解已有被膜，同时不污染医疗器械并提供长期防护。目前尚没有关于柠檬醛复配右旋龙脑制备生物被膜消除剂等的相关报道。

发明内容

[0010] 为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液；具体涉及一种能够结合并抑制外膜毒力因子弹性蛋白的RhlR蛋白功能的具有抑制假单胞菌生物膜形成和减少现有生物膜作用的皮克林乳液。本发明的一种抑制细菌生物膜形成和瓦解已有生物被膜的皮克林乳液以假单胞菌聚集相关蛋白(外膜毒力因子弹性蛋白)的RhlR蛋白截短体OMPRhlr2.0蛋白为特异作用位点制备而成；所述的皮克林乳液能识别位于RhlR蛋白中的特异表位并抑制RhlR蛋白的功能，从而发挥抑制假单胞菌生物膜形成和减少现有生物膜的作用。

[0011] 本发明另一目的在于提供上述能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液的制备方法。

[0012] 本发明再一目的在于提供上述能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液的应用。

[0013] 本发明的目的通过下述方案实现：

[0014] 一种能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液，其主要包括以下成分：柠檬醛、右旋龙脑、氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒(SiO2-NH2)和水。

[0015] 优选的，所述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液，其主要包括以下质量分数的组分：

[0016] 柠檬醛 0.1～0.95％

[0017] 右旋龙脑 1～18.5％

[0018] 含有氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的水 80.55～98.9％

[0019] 其中，含有氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的超纯水中氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的质量分数为0.05～0.95wt％；

[0020] 所述的含有氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的水的pH值为6～12。

[0021] 所述的柠檬醛的纯度在96％以上。

[0022] 所述的右旋龙脑是通过水蒸气法从梅片树叶提取得到粗油，接着将粗油经多次冷冻结晶，离心分离获得。具体的由以下步骤得到：将梅片树叶放入提取罐中进行水蒸气蒸馏，得到粗油；接着将粗油冷冻结晶、离心分离后，再经多次溶解，并重复以上步骤直至纯度在98％以上即可。

[0023] 所述的氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒是采用改进的法制备得到，具体步骤如下：将24mL氨水加入300mL无水乙醇的圆底烧瓶(500mL)中，搅拌5min后，加入12mL正硅酸乙酯，于室温搅拌过夜；为了将纳米粒子表面功能化，1.22mL的氨丙基三乙氧基硅烷加入上述体系，并于室温搅拌24h。反应液经多次水洗离心、醇洗后，冷冻干燥，以粉末状态备用。

[0024] 所述的细菌指革兰氏阴性假单胞菌。

[0025] 优选的，所述的细菌是铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌或恶臭假单胞菌。

[0026] 所述的抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液针对的B细胞表位，作用位点为假单胞菌毒力因子弹性蛋白B结构域的RhlR蛋白截短体蛋白OMPRhlr2.0。

[0027] 一种上述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液的制备方法，其主要包括以下步骤；

[0028] (1)将粉末状右旋龙脑溶解入柠檬醛中，得到油相体系1；

[0029] (2)氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒(SiO2-NH2)与水混合均匀，调节至pH＝6～12，得到水相体系2；

[0030] (3)将油相体系1加入至水相体系2中，5min内滴加完毕，同时利用乳化均质机在10000～24000r/min的转速条件下，乳化均质20～50分钟，直至形成均一稳定半透明浅乳白色溶液，为体系3；

[0031] (4)将体系3密封，并于20～30℃避光保存；

[0032] (5)将避光保存的体系3过滤，滤液即为能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液。

[0033] 步骤(1)所述的粉状右旋龙脑是经机械快速破碎获得，颗粒大小在100目以上，且不产生粘连，结块；

[0034] 步骤(2)中所述的氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒的粒径在80～180nm之间；

[0035] 步骤(3)中所述的乳化均质机的转速条件优选在24000r/min；乳化均质时间优选在20min；

[0036] 步骤(4)中所述的避光保存的温度优选为25℃；所述的保存的时间为30天以上，优选为80天。

[0037] 为实现更好的技术效果，步骤(4)所述的避光保存的期间可不间断震荡，使得柠檬醛、右旋龙脑、氨基功能化二氧化硅纳米粒子载体颗粒和去离子水混合得更好；震荡的速度优选160r/min；

[0038] 步骤(5)所述的过滤优选采用真空抽滤，滤材优选采用PTFE(孔径≤50微米)。

[0039] 上述的能够抑制细菌生物被膜形成和消除已有生物被膜的皮克林乳液可用于制备治疗由革兰氏阴性假单胞菌引起的生物膜相关疾病的药物及用于制备清除由革兰氏阴性假单胞菌引起的生物膜污染的日化产品。

[0040] 本发明的皮克林乳液可进一步与其它药物混合或者作为其它药物的载体，用于制备治疗由革兰氏阴性假单胞菌引起的生物膜相关疾病的药物。

[0041] 本发明的机理为：

[0042] 本发明利用亲水性氨基功能化二氧化硅的氨基与油相主要成分柠檬醛在水油界面处发生原位反应，生成希夫碱(Schiff base)，从而降低氨功能二氧化硅的水溶性，将其迁移至油相系统，且不改变其特有的纳米形态，同时通过乳化均质，获得稳定O/W型皮克林乳液多通道运载体系。其中，油相体系的主要疏水成分，在此运载体系中同时承担结构支撑功能和抗菌功能；如龙脑油滴为纳米颗粒提供主要的疏水核心，柠檬醛在油核内部共价偶联氨基功能化二氧化硅，改善该纳米体系运载体系胶囊的核结构等。该混合无机-有机纳米复合体系O/W型皮克林乳液的构建，与单一体系相比，具有结构更稳定、抑菌活性功能更强等优点。

[0043] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

[0044] (1)本发明所得皮克林乳液对假单胞菌生物被膜的形成具有显著的抑制作用，有效降低铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中弹性蛋白酶、胞外蛋白水解酶、鼠利糖脂、藻酸盐的水平和活性以及绿脓菌素的表达等生物被膜形成过程所涉及的毒力因子，从而抑制生物被膜的形成，并降低其其感染性；同时，对已形成的生物被膜的消除瓦解能力显著。

[0045] (2)本发明利用亲水性氨基功能化二氧化硅的氨基与油相主要成分柠檬醛在水油界面处发生原位反应，生成希夫碱(Schiff base)，从而降低氨功能二氧化硅的水溶性，将其迁移至油相系统，且不改变其特有的纳米形态，同时通过乳化均质，获得稳定O/W型皮克林乳液多通道运载体系。该体系有效改善了天然活性产物易挥发、不稳定及水溶性差的问题，且该混合无机-有机纳米复合体系O/W型皮克林乳液的构建，与传统单一体系相比，具有结构更稳定、抑菌活性功能更强等优点。同时，我国具有丰富的山苍子树、梅片树资源，天然产物-柠檬醛和右旋龙脑在生物被膜防控体系的利用，大大拓展其适用范围，有效提高了该产业的附加经济值。附图说明

[0046] 图1为PCR扩增PAO1rhlR基因电泳图。

[0047] 图2为皮克林乳液对假单胞菌PA15株生物膜形成和减少现有生物膜的影响结果图。

[0048] 图3为铜绿假单胞菌野生型标准菌株PAO1ATCC15692以及PA39株细菌裂解液上清蛋白的Western blot图。

[0049] 图4为藻酸盐标准样品光吸收标准曲线图。

[0050] 图5为PAO1在不同抑制剂的亚抑制浓度下所产藻酸盐量随时间的变化图。

[0051] 图6为亚抑制浓度下的皮克林乳液对绿脓菌素释放量的影响图。

[0052] 图7为鼠李糖标准样品光吸收标准曲线图。

具体实施方式

[0053] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0054] 实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

[0055] 所用的氨基功能化二氧化硅纳米粒子的制备过程为：将24mL氨水加入300mL无水乙醇的圆底烧瓶(500mL)中，搅拌5min后，加入12mL正硅酸乙酯，于室温搅拌过夜；为了将纳米粒子表面功能化，1.22mL的氨丙基三乙氧基硅烷加入上述体系，并于室温搅拌24h。反应液经多次水洗离心、醇洗后，冷冻干燥，以粉末状态备用。

[0056] 实施例1

[0057] (1)皮克林乳液的制备：称取20g右旋龙脑粉末(100目以上)并缓慢加入5mL的柠檬醛中，搅拌均匀，溶解完全后，加入975mL含有0.5％(干重)氨基二氧化硅，pH＝10的水悬浮液中，于24000r/min的转速条件，乳化均质25分钟后，密封，于25℃避光保存80天；过滤，滤液即为具有抑制细菌生物膜形成和瓦解现有生物膜的皮克林乳液，封装入专用容器后，避光常温保存。

[0058] (2)检测：本发明采用蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测上述制备的皮克林乳液与假单胞菌外膜毒力因子弹性蛋白结合；并采用微量细菌生物膜检测试验，检测皮克林乳液对假单胞菌生物膜形成和现有生物膜的影响；同时检测与皮克林乳液共培养过程中外膜毒力因子如藻酸盐、绿脓菌素及鼠利糖脂的水平和活性等。

[0059] 1)采用微量细菌生物膜检测试验(96孔板生物膜形成试验)，将铜绿假单胞菌生物膜形成阳性株PAO1、PA15、PA10、PA39和PA7分别与皮克林乳液混合(终浓度10μg/mL)，接种于96孔板上，4℃孵育2小时后37℃培养14小时。细菌在孔内形成的生物膜采用结晶紫染色法检测，结晶紫染色水洗后，根据A570读数判断细菌生物膜形成和减少现有生物膜的强弱。

[0060] 具体实验方法如下：①假单胞菌接种于新鲜的TBS培养基(广州环凯微生物科技有限公司)中，37℃培养过夜；②细菌1:200用新鲜的TBS培养基稀释接种于96孔板，每孔200μl；加入皮克林乳液(终浓度为10μg/mL)，4℃孵育2小时后37℃静置培养14小时，每个样品采用三复孔上样。设置相同浓度的正常小鼠IgG(小鼠免疫球蛋白)处理假单胞菌生物膜为阴性对照。③弃菌液，用PBS洗板3次，晾干，每孔加200μL 2％结晶紫室温染色5分钟。④弃染液，用水洗板，将板晾干，酶标仪A570读数，每个样品读数取三复孔的均值。⑤该吸收值在一定范围内与被膜的产量成正比关系，并应用如下公式计算皮克林乳液对假单胞菌生物膜形成的抑制率：

[0061] (阴性对照A570均值－样品A570均值)/阴性对照A570均值×100％

[0062] 根据Gnebank上铜绿假单胞菌rhlR全序列(登录号:AE004768)，用Primer5 软件进行引物设计，经过PCR扩增得到的铜绿假单胞菌野生型标准菌株PAO1ATCC15692rhlR基因产物电泳图如图1所示，其中M:DL2000，lane 1:PAO1ATCC15692。

[0063] 皮克林乳液对假单胞菌生物膜形成的影响如表l所示，所述的皮克林乳液除能抑制铜绿假单胞菌野生型标准菌株PAO1ATCC15692生物膜形成和减少现有生物膜外，还能抑制多种假单胞菌菌株生物膜的形成。

[0064]

[0065] #以上编号的假单胞菌菌株分别为：1.PAO1(ATCC15692)；2.PA15(ATCC27853)；3.PA10(ATCC9027)；4.PA39(ATCC 15442)；5PA7(CMCC10104)，*各菌株的生物膜形成能力用“++”和“+”表示，其中“++”表示生物膜形成能力较强，“+”表示生物膜形成能力较弱。

[0066] 表l结果表明，所述的皮克林乳液在体外能明显抑制假单胞菌生物膜的形成，与加入正常小鼠IgG的阴性对照相比，能显著降低假单胞菌生物膜的形成。

[0067] 以不做任何处理的细菌生物膜以及15μg/mL的正常小鼠IgG处理为对照，将15μg/mL的皮克林乳液加入培养基中同假单胞菌PA15培养0h、10h、15h，再利用结晶紫染色后在光学显微镜下观察。结果如图2所示，其中黑色为生物膜，白色表示生物膜随着时间变薄，图2的染色结果检测表明，铜绿假单胞菌PA15株在所述的皮克林乳液存在的条件下形成的生物膜中存在大量微小孔洞，并且生物膜中的很多部位明显变薄，同时生物膜中的死亡细菌数量增大。

[0068] 2)利用蛋白免疫印迹(Western blot)试验检测皮克林乳液对外膜毒力弹性蛋白的识别，实验方法如下：

[0069] ①将2mL过夜生长的假单胞菌PA39及ATCC 15692株细菌离心收集并重悬后，加入溶葡萄球菌酶10μg在37℃处理半小时。20000g高速离心后取上清蛋白进行7％SDS-PAGE电泳。电泳后将凝胶中的蛋白电转运至0.45μm的PVDF膜上。在4℃中将转有蛋白的PVDF膜置于5％的脱脂牛奶中封闭过夜。

[0070] ②利用5％的脱脂牛奶将储存液浓度为0.4mg/mL的皮克林乳液稀释至l nM后，与装有蛋白的PVDF膜于室温孵育2小时。反复洗膜后再将膜与HRP标记的羊抗小鼠二抗室温孵育l小时。反复洗膜后将膜置于适量的发光液(发光液由ECL发光试剂盒中的A液与B液以1：1的比例混合得到，购于美国Millipore公司)中反应，并将蛋白印迹情况反映在X光片上。

[0071] ③将位于PAGE胶中对应于Western blot中出现的印迹条带相对应的蛋白条带挖出，并对胶中的蛋白进行质谱分析。

[0072] 图3为铜绿假单胞菌野生型标准菌株PAO1ATCC15692以及PA39株细菌裂解液上清蛋白的Western blot图，图中所示的印迹条带对应的蛋白经质谱鉴定为外膜毒力弹性蛋白及其蛋白水解片段，Western blot检测结果表明：所述的皮克林乳液在被稀释到1nM以下时，仍然可以结合假单胞菌外膜毒力弹性蛋白。

[0073] 3)测定被膜条件下藻酸盐的释放量(1，3二羟基萘)

[0074] 该皮克林乳液最小抑菌浓度(MIC)的测定：通过二倍稀释法将皮克林乳液原液原液用TSB培养基稀释，使其浓度梯度为0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8μg/mL。然后分别吸取3mL上述培养基于试管中，并加入0.3mL活化后并稀释至0.5麦氏标准浓度(相当于1×107～8CFU/mL)PAO1菌液,每个浓度做3次重复，并做阴性对照(含药物的TSB不加菌液)和阳性对照(加菌液不加药物)，置于37℃摇床过夜培养。以肉眼可见完全抑制细菌生长所需的最小药物浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。

[0075] 在QS系统产生的众多的毒力因子中，藻酸盐构成了假单胞菌被膜结构中最主要成分之一；藻酸盐作为一类免疫原性物质能刺激机体产生抗藻酸盐的抗体，两者过量结合后沉积于组织细胞表面，产生炎性物质对其造成损害；同时，藻酸盐本身的粘稠状态可以帮助细菌成功逃脱众多抗菌药物的免疫攻击，是结被膜结构中细菌的保护伞。本实施例旨在亚抑制浓度(本实验为1/2MIC)的皮克林乳液存在条件下检测藻酸盐的释放量。

[0076] 具体实验步骤如下：

[0077] 绘制藻酸盐的标准曲线：配制不同浓度的藻酸盐标品液，浓度分别为50、100、125、150、200、250、300、350和400μg/mL各做3个复孔，各测3次，得平均吸收值。取的绿脓杆菌悬液加3mL10％的CuSO4溶液，反应混合产品用1N盐酸调整pH值至4.0，室温保存1h，并在
10500g离心10min。沉淀再溶解在100μl 1N NH3·H2O中，再加900μl的水稀释。被处理的样品(1mL)铜盐酸试剂2mL(40mL浓盐酸加2.5％硫酸铜溶液1mL,加水9mL)和1mL的1，3二羟基萘试剂(1，3二羟基萘100mg溶于25mL水)，保持在沸水浴40min。后被冷冻混合，混合4mL醋酸乙酯，摇动，离心分离醋酸乙酷层，后用20％NaCl溶液洗2次，在565nm处的波长下进行测量。以浓度为横坐标，吸收值为纵坐标，绘制曲线。在标准曲线上读出其海藻酸盐含量。

[0078] 通过上述方法得到的藻酸盐的标准曲线如下图4所示，并利用线性方程检测在该皮克林乳液亚抑制浓度(本实验为1/2MIC)下PAO1被膜在分别培养了1d、2d、3d和4d时菌液中藻酸盐的释放量，并以革兰氏阴性菌抗生素(庆大霉素)作为被膜抑制对照药物，实验结果如表2及图5所示。

[0079] 表2 PAO1在皮克林乳液的亚抑制浓度下所产藻酸盐量随时间的变化

[0080]

[0081] 由以上实验结果可知，与庆大霉素相比，该皮克林乳液可显著降低PAO1藻酸盐的释放量，且在共培养第3天和第4天时，藻酸盐的含量基本趋于稳定，说明被膜量基本不再增加，在一定程度上干扰了被膜的生成，降低铜绿假单胞菌系统的耐药性。

[0082] 4)该皮克林乳液对PAO1绿脓菌素的释放抑制

[0083] 绿脓菌素是铜绿假单胞菌QS系统分泌的另一典型性毒力因子，具体检测方法如下：

[0084] 将PAO1按体积百分比1％的接种量接种到LB培养基，37℃过夜培养，复苏PAO1。挑单菌落至5mL的LB液体培养基(广州环凯微生物科技有限公司)中，37℃，200rpm震荡培养16h，8000rpm离心2min，取上清转入另一灭菌的大离心管中；每5mL上清液中加入3mL氯仿抽提，4500rpm离心8min离心。摇晃，待分层后取其下层溶液，然后加入1mL的盐酸(0.2N)混合，颠倒数次混匀，离心，收集上层液相，在520nm处测其吸收值，该数值与绿脓杆菌的释放量成正比。

[0085] 在亚抑制浓度(本实验为1/2MIC)下，分别检测共培养2d、4d、6d和8d时，绿脓菌素的释放量，结果如图6所示，从图6中可知，培养后的前4天，给药组和空白对照组的绿脓菌素释放量均保持在较低水平，且与对照组相比，该皮克林乳液可以抑制PAO1绿脓菌素的表达量。当培养至第6天之后，尤其是第8天时，绿脓菌素释放量迅速增加，呈上升趋势，推测可能的原因是，随着培养实践的延长，假单胞菌的被膜结构逐渐趋于完整，皮克林乳液的存在刺激被膜内的群体产生毒力因子，降低其对药物的敏感性，从而缓解药物带来的抑制压力，说明QS系统对被膜的调节是有时间差异性的，因此建议在临床治疗中，在感染的前6天内及时给药，彻底阻断被膜的形成。

[0086] 5)用浓硫酸-地衣酚方法进行鼠李糖脂含量及活性的测定

[0087] 鼠李糖标准曲线的制作，标品配制：将1mg/mL的鼠李糖用去离子水分别稀释为0、10、20、40、60、80及100μg/mL系列浓度，各取100μl，每个浓度做3个复孔，加入900μl的
0.19％的地衣酚浓H2SO4，80℃水浴，半小时后，室温冷却测OD421nm，根据所测数据绘制标准曲线，鼠李糖的标准曲线如图7所示。

[0088] 将PAO1分别接种于容量为300mL的含50mL LB的种子培养基(广州环凯微生物科技有限公司)中，37℃下摇床(200rpm)震荡培养16-18h，4℃下保存备用。用培养基调菌液OD600nm＝0.05。设PAO1的空白组和皮克林乳液组(终浓度均为1/2MIC)，每个组的体积为20mL,放置在50mL无菌离心管中，30℃,200rpm,培养48h,各取10mL，6000g，离心10min,除菌体，将上清用浓HCl调pH在2.0左右，取1mL用等量乙酸乙酯连续萃取2次，收集上层有机相至新管，室温过夜挥发至干燥；次日在各管中分别加入500μl的无菌ddH2O重新溶解，取100μl上述溶解液测定421nm吸收值，根据标准曲线求出鼠李糖含量(1μg鼠李糖相当于2.5μg鼠李糖脂)。

[0089] 根据以上方法测定并计算鼠李糖含量，然后按照鼠李糖和鼠李糖脂的换算比例(1μg鼠李糖相当于2.5μg鼠李糖脂)，换算出对应的鼠李糖脂含量。培养48h后检测发现，加药组鼠李糖脂含量为39.5μg/mL，而空白组为156.3μg/mL，对比可知，在亚抑制浓度(本实验为1/2MIC)下皮克林乳液组的鼠李糖脂含量远小于对照组，说明该皮克林乳液具有抑制PAO1释放鼠李糖脂的功能。

[0090] 根据以上实验结果可知，该皮克林乳液均可在较低的剂量浓度(1nM或亚抑制浓度)下，在一定程度上减少生物被膜生成率，结合弹力蛋白，并有效减少毒力因子如藻酸盐、绿脓菌素和鼠李糖脂等释放量。并建议尽量在感染假单孢菌的较早期(前6天)有效给药，才能最大限度抑制被膜的生成。

[0091] 实施例2

[0092] (1)皮克林乳液的制备：称取90g右旋龙脑粉末(100目以上)并缓慢加入9mL的柠檬醛中，搅拌均匀，溶解完全后，加入901mL含有0.4％(干重)氨基二氧化硅，pH＝10的水悬浮液中，于24000r/min的转速条件，乳化均质30分钟后，密封，于25℃避光保存90天；过滤，滤液即为具有抑制细菌生物膜形成和瓦解现有生物膜的皮克林乳液，封装入专用容器后，避光常温保存。

[0093] (2)检测：同实施例1，检测结果与实施例1基本相同，该皮克林乳液可在较低的剂量浓度条件下，减少生物被膜生成率，并结合弹力蛋白，消除其毒性，并有效减少毒力因子如藻酸盐、绿脓菌素和鼠李糖脂等释放量。并建议尽量在感染假单孢菌的较早期(前6天)有效给药，才能最大限度抑制被膜的生成。

[0094] 实施例3

[0095] (1)皮克林乳液的制备：称取150g右旋龙脑粉末(100目以上)并缓慢加入9.5mL的柠檬醛中，搅拌均匀，溶解完全后，加入840.5mL含有0.8％(干重)氨基二氧化硅，pH10的水悬浮液中，于24000r/min的转速条件，乳化均质20分钟后，密封，于25℃避光保存80天；过滤，滤液即为具有抑制细菌生物膜形成和瓦解现有生物膜的皮克林乳液，封装入专用容器后，避光常温保存。

[0096] (2)检测：同实施例1，检测结果与实施例1基本相同，该皮克林乳液可在较低的剂量浓度条件下，减少生物被膜生成率，并结合弹力蛋白，消除其毒性，并有效减少毒力因子如藻酸盐、绿脓菌素和鼠李糖脂等释放量。并建议尽量在感染假单孢菌的较早期(前6天)有效给药，才能最大限度抑制被膜的生成。

[0097] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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