一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统及其制备方法和应用
阅读：198发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种测定三 磷酸 腺苷的电 化学发光 传感器 系统及其制备方法和应用，所述系统由放大三磷酸腺苷浓度 信号 的 磁性 探针和测定Trigger DNA的电化学发光传感器组成；磁性探针由Fe3O4 纳米粒子 、金纳米粒子、DNA substrate及aptazyme依次复合而成；电化学发光传感器通过戊二 醛 交联作用将 氨 基修饰的Capture DNA连接至修饰RuSiO2-CS的工作 电极 表面得到。本发明中三磷酸腺苷先参与由磁性探针引导的恒温扩增反应，并产生大量中间物Trigger DNA；随后通过本发明的电化学发光传感器对该中间物Trigger DNA进行定量检测，最终达到间接定量检测三磷酸腺苷的目的。，下面是一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，其特征在于，所述系统由放大三磷酸腺苷浓度信号的磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme和测定Trigger DNA的电化学发光传感器组成；所述磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme由Fe3O4纳米粒子、金纳米粒子、DNA substrate及aptazyme依次复合而成；所述测定Trigger DNA的电化学发光传感器通过戊二醛交联作用将氨基修饰的Capture DNA连接至修饰RuSiO2-CS的工作电极表面得到。
2.根据权利要求1所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，其特征在于，所述DNA substrate序列为“SH-AAAAAAAAAATTCACCAACTATrAGCT ACGATGACTCACCTAGGAG”；所述aptazyme序列为“TCATCGTAGAGCGATCTAGGGGGAGTATTGCGGAGGATAGCACCCATGTTAGTTGGTGAA”；
所述Trigger DNA序列为“GCTACGATGACTCACCTAGGAG”；所述氨基修饰的Capture DNA序列为“NH2-CTCCTAGGTGAGTCATCGTAGCCTCCTGGTATTGCTACGATGACTCA”。
3.根据权利要求1所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，其特征在于，所述RuSiO2-CS是优选由RuSiO2溶液与含有CS溶液混合得到；所述RuSiO2为向Triton X-100，环己烷，正己醇的混合液中，加入Ru(bpy)3Cl2水溶液，混匀后加入TEOS及氨水，搅拌反应；加入丙酮后进行离心，清洗沉淀得到RuSiO2。
4.根据权利要求1所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，其特征在于，所述磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme的制备步骤如下：
(1)称取FeCl3及柠檬酸三钠溶解于乙二醇中，加入乙酸钠，搅拌后的混合液加入至反应釜中，反应后沉淀清洗，得到Fe3O4纳米粒子；
(2)向HAuCl4水溶液中加入柠檬酸三钠水溶液，持续煮沸，得到Au纳米粒子；
(3)用APTES对Fe3O4纳米粒子进行氨基化修饰，产物与Au纳米粒子混合，磁性分离后清洗，得到Au@Fe3O4纳米粒子；
(4)Au@Fe3O4纳米粒子与DNA substrate混合后，反应后磁性分离后用水清洗，得到Au@Fe3O4-substrate溶液；然后与aptazyme混合，过夜反应，得到Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针。
5.根据权利3所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述APTES添加量为反应溶液的1～10％，Fe3O4纳米粒子的浓度为0.5～5mg/mL；
步骤(4)所述Au@Fe3O4纳米粒子浓度为0.5～5mg/mL，DNA substrate的浓度为1～10μM，aptazyme的浓度为1～10μM。
6.根据权利要求1所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，其特征在于，所述测定Trigger DNA的电化学发光传感器的制备过程如下：
(1)将工作电极进行抛光后，超声清洗；
(2)取RuSiO2-CS溶液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥，清洗晾干；
(3)向上述电极表面滴加戊二醛水溶液，室温反应后清洗晾干；将Capture DNA滴加至电极表面，反应后清洗晾干；
(4)向上述电极表面滴加Blocker，室温反应后清洗晾干，得到测定Trigger DNA的电化学发光传感器。
7.一种权利要求1所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统在定量检测三磷酸腺苷中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括检测三磷酸腺苷的步骤如下：
(1)将三磷酸腺苷溶液与磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme混合并持续反应，利用磁性吸附分离三磷酸腺苷与磁性探针的结合复合物；
(2)用酶切缓冲液重悬上述复合物，激活酶切反应，产生大量Trigger DNA，并通过磁性吸附将磁性探针去除，得到含有Trigger DNA的上清溶液；
(3)将上述溶液等体积与hairpin-Fc混合并滴加于电化学发光传感器表面，反应一段时间后，测试该传感器的电化学发光信号，通过电化学发光信号的衰减值计算相应的ATP浓度。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述hairpin-Fc序列为TCGTAGCAATACCAGGAGGCTACGATGACTCACTCCTGGTATT-Fc。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme用于三磷酸腺苷分子的特异性捕获，同时启动aptazyme的恒温酶放大反应，产生大量的Trigger DNA；在Trigger DNA的催化作用下，hairpin-Fc与传感器表面RuSiO2-CS上修饰的Capture DNA进行互补结合，从而将大量hairpin-Fc固定于电极表面；
由于Fc能够剂量依赖地抑制RuSiO2-CS的电化学发光信号，因此三磷酸腺苷的浓度与电化学发光信号衰减值呈线性关系实现三磷酸腺苷的定量检测。
一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统及其制备方法
和应用
技术领域
背景技术
[0002] 三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)是一种小分子高能磷酸化合物，也是有机生命体中主要的能量来源，保证了细胞各项生命活动的能量供应。作为一种“能量货币”，它参与了生命体中许多重要的生理过程，如：基因合成、营养物质代谢、药物传输以及免疫和神经介导等生物活性调节。已有相关研究表明，ATP作为有机生命体细胞活力及细胞损伤的指示剂，其含量的变化和心血管疾病、帕金森症、阿尔茨海默病等疾病的发生有密切关系。此外，在食品安全领域，ATP的定量检测也被用于食源性病原微生物的检测。因此建立高灵敏度、高特异性的ATP定量检测方法，对生命科学研究、临床诊断、食品安全和环境分析等领域具有直观重要的作用。
[0003] 目前已有多种检测方法被开发用于ATP的定量检测，如：毛细管电泳法、高效液相色谱法、质谱分析法、化学发光法等。上述检测方法具有准确、高效等优点，但也存在样品处理步骤繁琐耗时、灵敏度低、设备庞大、成本高等缺点，一定程度上限制了它们在不同领域的广泛应用。因此，为满足各个领域的研究、应用需要，亟需开发一种简单、快速，高灵敏度的ATP定量检测方法。
[0004] 电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)是一种由电化学驱动的化学发光现象，通过智能整合电化学及化学发光技术，使其相较于其他光学检测方法其具有更加优越的性能。电化学发光不需要额外的光源，这不仅简化了实验的设备，同时也避免了杂志及散射光源的背景干扰，具有较高的灵敏度。此外，电化学发光还具有特异性高、操作简单、重现性好等优势，吸引了众多研究者的关注，并被广泛地应用于食品和药品分析、环境监测等领域，是实现优势ATP定量检测的最有潜力的平台之一。为开发满足当前ATP定量检测需求的传感器，本发明整合了DNA信号放大策略、纳米材料的优异发光效果，从而实现多重信号放大体系，并成功应用于ATP的定量检测。
发明内容
[0005] 发明目的：针对现有技术存在的繁琐耗时、灵敏度低、设备庞大、成本高等缺点，本发明提供了一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，本发明针对三磷酸腺苷的特殊性设计了一种基于多重信号放大策略的电化学发光传感器系统。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统的制备方法。
[0007] 本发明的另一个目的是提供所述三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统的应用。本发明提供了应用该传感器系统进行人血清中三磷酸腺苷的定量检测的方法，所述检测方法特异性好、灵敏度高、线性范围宽，且具有成本低廉的优势。
[0008] 技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，所述系统由放大三磷酸腺苷浓度信号磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme和测定Trigger DNA的电化学发光传感器组成；所述磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme由Fe3O4纳米粒子、金纳米粒子、DNA substrate及aptazyme依次复合而成；所述测定Trigger DNA的电化学发光传感器通过戊二醛交联作用将氨基修饰的Capture DNA连接至修饰RuSiO2-CS的工作电极表面得到。
[0009] 本发明中三磷酸腺苷先参与由磁性探针引导的恒温扩增反应，并产生大量中间物Trigger DNA；随后通过本发明的电化学发光传感器对该中间物Trigger DNA进行定量检测，最终达到间接定量检测三磷酸腺苷的目的。
[0010] 其中，所述DNA substrate序列为“SH-AAAAAAAAAATTCACCAACTATrAGCTACGATGACTCACCTAGGAG”；所述aptazyme序列为“TCATCGTAGAGCGATCTAGGGGGAGTATTGCGGAGGATAGCACCCATGTTAGTTGGTGAA”；所述Trigger DNA序列为“GCTACGATGACTCACCTAGGAG”；所述氨基修饰的Capture DNA序列为“NH2-CTCCTAGGTGAGTCATCGTAGCCTCCTGGTATTGCTACGATGACTC A”；上述序列分别由SEQ ID NO.1-4所示。
[0011] 本发明所述中间物Trigger DNA是DNA substrate经由aptazyme酶切所产生的DNA片段，其作用是将磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme介导的信号放大策略与传感器检测有机联系起来：当ATP与磁性探针结合后，aptazyme的酶切活性被启动并特异性切合DNA substrate链，最终产生Trigger DNA；由于产物Trigger DNA的浓度与ATP浓度呈正比关系，因此通过检测Trigger DNA，传感器则能够实现对ATP的定量检测。
[0012] 本发明所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统的制备方法，包括如下步骤：
[0013] 磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme的制备
[0015] (2)向HAuCl4水溶液中加入柠檬酸三钠水溶液，持续煮沸，得到Au纳米粒子；
[0016] (3)用APTES对Fe3O4纳米粒子进行氨基化修饰，产物与Au纳米粒子混合，磁性分离后清洗，得到Au@Fe3O4纳米粒子；
[0017] (4)Au@Fe3O4纳米粒子与DNA substrate混合后，反应后磁性分离后用水清洗，得到Au@Fe3O4-substrate溶液；然后与aptazyme混合，过夜反应，得到Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针；
[0018] 作为优选，所述Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针制备方法如下：
[0019] (1)称取FeCl3及柠檬酸三钠溶解于乙二醇中，加入乙酸钠，磁力搅拌10～60min后的混合液加入至反应釜中，200℃反应6～16h；沉淀经磁性分离后依次用乙醇、水清洗，得到Fe3O4纳米粒子；
[0021] (3)用APTES对Fe3O4纳米粒子进行氨基化修饰，产物与Au纳米粒子混合，磁性分离后用水清洗，得到Au@Fe3O4纳米粒子；
[0022] (4)Au@Fe3O4纳米粒子与DNA substrate混合后，于37℃反应12～36h，磁性分离后用水清洗，得到Au@Fe3O4-substrate溶液；然后与aptazyme混合，37℃反应过夜，得到Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针；
[0023] 步骤(1)所述FeCl3、柠檬酸三钠和乙酸钠的质量比为：0.65:0.2:1.2。
[0024] 步骤(2)所述HAuCl4和柠檬酸三钠水溶液的体积比为50:1。
[0025] 步骤(3)所述APTES的终浓度为总反应液体积的1～10％(体积分数)，Fe3O4纳米粒子的浓度为0.5～5mg/mL。
[0026] 步骤(4)所述Au@Fe3O4纳米粒子浓度为0.5～5mg/mL，DNA substrate的浓度为1～10μM，aptazyme的浓度为1～10μM。
[0027] 更优选地：
[0028] (1)称取0.65g FeCl3及0.2g柠檬酸三钠溶解于20mL乙二醇中，加入1.2g乙酸钠，磁力搅拌30min后的混合液加入至反应釜中，200℃反应10h；沉淀经磁性分离后依次用乙醇、水清洗，得到Fe3O4纳米粒子；
[0029] (2)向沸腾的50mL 0.01％HAuCl4水溶液中加入1mL 0.1％柠檬酸三钠水溶液，持续煮沸15min，得到Au纳米粒子；
[0030] (3)加入总反应体积1％的APTES对1mg/mL Fe3O4纳米粒子进行氨基化修饰，产物与Au纳米粒子混合，磁性分离后用水清洗，得到Au@Fe3O4纳米粒子。
[0031] (4)1mg/mL Au@Fe3O4纳米粒子水溶液与1μM DNA substrate混合后，于37℃反应24h，磁性分离后用水清洗，得到Au@Fe3O4-substrate溶液；然后与1μM aptazyme混合，37℃反应过夜，得到磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme溶液。
[0032] 本发明所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统的制备方法，所述RuSiO2-CS是由RuSiO2水溶液与CS溶液混合，充分混匀得到；所述RuSiO2为向Triton X-100，环己烷，正己醇的混合液中，加入Ru(bpy)3Cl2水溶液，混匀后加入TEOS及氨水，搅拌反应；加入丙酮后进行离心，清洗沉淀得到RuSiO2。
[0033] 所述RuSiO2按如下步骤制备：
[0034] 向Triton X-100，环己烷，正己醇的混合液中，加入Ru(bpy)3Cl2水溶液，混匀后加入TEOS及氨水，搅拌反应12～36h；加入丙酮后进行离心，沉淀用乙醇、水依次清洗，得到RuSiO2。
[0035] 优选地，量取1～3mL Triton X-100，5～10mL环己烷，1～3mL正己醇加入反应容器中，充分混合后，向混合液中加入250～500μL的5-100mM Ru(bpy)3Cl2水溶液，混匀后加入50～200μL TEOS及30～200μL氨水，搅拌反应12～36h；加入1～10mL丙酮后进行离心，沉淀用乙醇、水依次清洗，产物用乙醇重悬后制得1～8mg/mL RuSiO2溶液。
[0036] 所述RuSiO2-CS溶液按如下方法制备：
[0037] 将CS加入至乙酸水溶液并超声溶解，得到CS溶液；取等体积的RuSiO2溶液与CS溶液混合，超声处理10～50min充分混匀，得到RuSiO2-CS溶液。
[0038] 优选地，取0.1～2mg CS加入0.1mL～2mL体积分数为0.5％-3％乙酸水溶液中，超声分散5～30min，得到CS溶液；取0.1～2mL 1～8mg/mL RuSiO2溶液加入至0.1～2mL CS溶液，超声处理10～60min以获得分散均匀的RuSiO2-CS溶液。
[0039] 所述电化学发光传感器的制备过程如下：
[0041] (2)取RuSiO2-CS溶液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥，清洗晾干；
[0042] (3)向上述电极表面滴加戊二醛水溶液，室温反应后清洗晾干；将Capture DNA滴加至电极表面，反应后清洗晾干；
[0043] (4)向上述电极表面滴加Blocker，室温反应后清洗晾干；
[0045] 作为优选，电化学发光传感器的制备方法，按如下步骤制备：
[0046] (1)将工作电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后，依次用水、乙醇、水进行超声清洗2～10min；
[0047] (2)取2～20μL 1～8mg/mL RuSiO2-CS溶液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥，用PBS溶液清洗，晾干；
[0048] (3)向上述电极表面滴加质量分数0.5～5％戊二醛水溶液，室温反应1～3h后，用PBS溶液清洗，晾干；将2～20μL 1～10μM Capture DNA滴加至电极表面，37℃反应1～3h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0049] (4)向上述电极表面滴加2～20μL 1～10μM Blocker，室温反应1～3h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0050] 更优选地，
[0051] (1)将工作电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后，依次用水、乙醇、水进行超声清洗4min；
[0052] (2)取10μL 2mg/mL RuSiO2-CS溶液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥，用PBS溶液清洗，晾干；
[0053] (3)向上述电极表面滴加质量分数为2.5％的戊二醛水溶液，室温反应2h后，用PBS溶液清洗，晾干；将10μL 4μM Capture DNA滴加至电极表面，37℃反应2h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0054] (4)向上述电极表面滴加2～20μL 1～10μM Blocker，室温反应1～3h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0055] 其中，所述Blocker序列为NH2-TTTTTTTT。
[0056] 本发明所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统在制备定量检测三磷酸腺苷工具或试剂中的应用。
[0057] 所述的定量检测三磷酸腺苷，其检测操作步骤如下：
[0058] (1)将三磷酸腺苷溶液与磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme混合并持续反应一段时间，利用磁性吸附分离三磷酸腺苷与磁性探针的结合复合物；
[0059] (2)用酶切缓冲液重悬上述复合物，在特定温度下(37℃)激活酶切反应，产生大量Trigger DNA，并通过磁性吸附将磁性探针去除，得到含有Trigger DNA的上清溶液；
[0060] (3)将上述溶液等体积与hairpin-Fc混合并滴加于电化学发光传感器表面，反应一段时间后，测试该传感器的电化学发光信号，通过电化学发光信号的衰减值计算相应的ATP浓度。
[0061] 具体将传感器放在含有25mM三乙胺的0.01M PBS溶液中进行CV测试，电位范围0～1.3V，速率0.1V/s。同步记录ECL发光信号，光电倍增高压(PMT)为800V。计算ECL信号的衰减值，根据标准曲线计算对应的三磷酸腺苷的浓度。
[0062] 其中，所述hairpin-Fc序列为TCGTAGCAATACCAGGAGGCTACGATGACTCACTCCTGGTATT-Fc，上述序列由SEQ ID NO.5所示。
[0063] 作为优选，
[0064] (1)将待检测ATP溶液，与Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针混合，37℃反应0.5～3h，磁性分离后；
[0065] (2)用酶切缓冲液(包含100mM NaCl及20mM MgCl2的20mM HEPES缓冲液)重悬步骤(1)中的吸附三磷酸腺苷的磁性探针，37℃反应2h，磁性分离；
[0066] (3)将上清液与hairpin-Fc溶液等体积混合，取5～50μL混合液滴于电极表面，于37℃反应0.5～3h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0067] (4)测试传感器的ECL发光信号。
[0068] 更优选地，
[0069] (1)取100μL待检测ATP溶液，与100μL Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针混合，37℃反应2h，磁性分离后；
[0070] (2)用20μL酶切缓冲液(包含100mM NaCl及20mM MgCl2的20mM HEPES缓冲液)重悬步骤(1)中的吸附三磷酸腺苷的磁性探针，37℃反应2h，磁性分离；
[0071] (3)将上清液与2μM hairpin-Fc溶液等体积混合，取10μL混合液滴于电极表面，于37℃反应2h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0072] (4)测试传感器的ECL发光信号。
[0073] 本发明中用于清洗的PBS的pH为7.4。
[0074] 本发明所述的测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统，其检测原理为：磁性探针Au@Fe3O4-substrate-aptazyme用于三磷酸腺苷分子的特异性捕获，同时启动aptazyme的恒温酶放大反应，产生大量的Trigger DNA；在Trigger DNA的催化作用下，hairpin-Fc与传感器表面RuSiO2-CS上修饰的Capture DNA进行互补结合，从而将大量hairpin-Fc固定于电极表面；由于Fc能够剂量依赖地抑制RuSiO2-CS的电化学发光信号，因此三磷酸腺苷的浓度与电化学发光信号衰减值呈线性关系。基于此原理，本发明的电化学发光传感器系统实现三磷酸腺苷的定量检测。
[0075] 本发明中技术术语的缩写如下：
[0076] 三磷酸腺苷:ATP；三联吡啶氯化钌掺杂的二氧化硅微球:RuSiO2；壳聚糖:CS；Si(OC2H5)4:TEOS；H2NCH2CH2CH2Si(OC2H5)3:APTES；二茂铁：Fc。
[0077] 本发明中涉及的Trigger DNA、Capture DNA、DNA substrate、aptazyme、Blocker、hairpin-Fc等核酸序列由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明中的其他原料试剂都是市售可得。ATP、TEOS、APTES、HAuCl4、壳聚糖购自于美国Sigma公司，其余化学试剂均为国产分析纯，购自于上海国药集团化学试剂有限公司。
[0078] 在生命体的生理活动中，三磷酸腺苷常处于成分较为复杂的基质中，在实际检测过程中这会一定程度上造成假阳性结果的产生。而提升生物分析方法的灵敏度一种能够有效地降低基质效应的途径，因此本发明尝试利用核酸恒温扩增技术进行信号放大以增强分析方法的灵敏度。同时，磁性分离技术是目前一种能够将目标分析物从复杂基质中纯化出来，有效消除样品基质效应的有效手段。因此，本发明尝试将两种核酸恒温扩增方法与磁性分离技术有效结合，并利用电化学发光平台的高灵敏的特性，设计并制备测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统。
[0079] 本发明针对目标物的特殊性设计了一种新型双重信号放大策略的传感器系统，其中传感器是由适配体酶、催化发卡自组装基于的Enzyme-Free恒温信号放大技术串联而成，继而从发光材料的信号放大角度切入，合成了二氧化硅包裹三联吡啶氯化钌分子的RuSiO2纳米粒子，并将其与上述信号放大策略联合得到一种新型且性能优异的具备多重信号放大能力的电化学发光传感器。在检测过程中，适配体酶与三磷酸腺苷特异性结合并切割传感器系统中的底物探针，得到大量的Trigger DNA，其触发电极表面的催化发卡自组装反应，生成Capture DNA-Hairpin-Fc双链DNA，随后在电化学发光测试仪器上完成传感器发光信号值的检测。由于Fc能够有效淬灭RuSiO2的电化学发光信号，因此通过测试前后的信号衰减值则可实现对三磷酸腺苷的超灵敏检测。此外，本发明的传感器系统成功地实现了人血清中三磷酸腺苷的定量检测，所述检测方法特异性好、灵敏度高、线性范围宽，且具有成本低廉的优势。
[0080] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0081] (1)本发明电化学发光传感器系统应用于检测血清及细菌胞内的三磷酸腺苷，既不需要常规检测方法中对样品进行复杂处理，也避免了使用HPLC等常规检测方法费用高、操作繁琐等问题。
[0082] (2)本发明电化学发光传感器系统与现有的商业化三磷酸腺苷检测试剂盒及已报道的电化学发光传感器相比，具有更高的灵敏度。
[0083] (3)本发明电化学发光传感器系统与其它电化学发光传感器相比，应用了多重信号放大策略，具有高灵敏度、高特异性等优势；同时本发明利用磁性分离技术，有效减少了实际检测过程中的假阳性结果。
[0084] (4)本发明成功制备了高效发光材料RuSiO2，并且与适配体酶和催化发卡自组装等信号放大策略成功联用，对生物传感领域的多重信号放大策略开发具有一定指导意义及理论、实践价值。
[0085] (5)本发明针对目标分析物的ATP特殊性设计了一种基于多重信号放大策略的电化学发光传感器系统，本发明传感器系统成功地实现了人血清中三磷酸腺苷的定量检测，并且特异性好、灵敏度高、线性范围宽，且具有成本低廉，使用方便等优势。附图说明
[0086] 图1为本发明电化学发光传感器的设计及制备示意图；
[0087] 图2为本发明电化学发光传感器的循环伏安图；
[0088] 图3为本发明电化学发光传感器系统对酶切产物孵育时间与ECL强度之间的关系示意图；
[0089] 图4为本发明电化学发光传感器系统的ECL强度与抗原浓度的对数之间的线性关系图；
[0090] 图5为本发明电化学发光传感器系统的选择性考察图；
[0091] 图6为本发明的电化学发光传感器系统用于定量检测人血清中ATP的可行性示意图。
具体实施方式
[0093] 实施例1
[0094] Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针的制备
[0095] (1)Fe3O4纳米粒子的制备
[0096] 称取0.65g FeCl3及0.2g柠檬酸三钠加入盛有20mL乙二醇的烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，向其中加入1.2g乙酸钠，进行磁力搅拌30min，将上述混合液加入至反应釜中，200℃反应10h；沉淀经磁性分离后依次用乙醇、水清洗各三次，得到Fe3O4纳米粒子。
[0097] (2)Au纳米粒子的制备
[0098] 配置50mL质量分数为0.01％HAuCl4水溶液加入圆底烧瓶中，将其加热至沸腾后，向溶液中加入1mL质量分数为0.1％柠檬酸三钠水溶液，持续加热煮沸15min，样品冷却至室温后得到Au纳米粒子溶液。
[0099] (3)Au@Fe3O4纳米粒子制备
[0100] 称取10mg Fe3O4纳米粒子加入10mL乙醇溶液中，充分搅拌使之充分分散，向溶液中加入100uL APTES溶液，室温反应10h后，得到氨基化修饰的Fe3O4纳米粒子。取1mL氨基化的Fe3O4溶液，向其中加入10mL Au纳米粒子溶液，室温下置于水平摇床上反应过夜，固体产物用乙醇、水各洗三次，得到Au@Fe3O4纳米粒子。
[0101] (4)Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针的制备
[0102] 取1mL 1mg/mL Au@Fe3O4纳米粒子水溶液与400uL 1μM DNA substrate溶液充分混合，于37℃反应24h，经磁性分离后，固体复合物用水清洗三次，用1mL PBS缓冲液(Ph7.4)重悬产物得到Au@Fe3O4-substrate溶液。然后将上述溶液与400uL 1μM aptazyme混合，37℃反应过夜，固体产物经磁性分离，用水清洗三次，得到Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针。
[0103] 实施例2
[0104] RuSiO2-CS溶液按如下步骤制备：
[0105] 量取2mL Triton X-100，8mL环己烷，2mL正己醇加入反应容器中，充分混合后，向混合液中加入350μL的40mM Ru(bpy)3Cl2水溶液，混匀后加入150μL TEOS及100μL氨水，搅拌反应24h；加入5mL丙酮后进行离心，沉淀用乙醇、水依次清洗，产物用乙醇重悬后制得4mg/mL RuSiO2溶液。
[0106] 取1mg CS加入1mL体积分数为2％乙酸水溶液中，超声分散20min，得到CS溶液；取1mL 4mg/mL RuSiO2水溶液加入至1mL CS溶液，超声处理30min以获得分散均匀的RuSiO2-CS溶液。
[0107] 实施例3
[0108] 测定Trigger DNA的电化学发光传感器的制备方法
[0109] 电化学发光传感器的制备方法如图1所示，包括以下步骤：
[0110] (1)电极预处理：将工作电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后，依次用水、乙醇、水进行超声清洗4min；
[0111] (2)修饰RuSiO2：取10μL 2mg/mL RuSiO2-CS溶液(实施例2)滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥，用PBS溶液清洗，晾干；
[0112] (3)共价连接Capture DNA：向上述电极表面滴加质量分数为2.5％戊二醛水溶液，室温反应2h后，用PBS溶液清洗，晾干；将10μL 4μM Capture DNA滴加至电极表面，37℃反应2h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0113] (4)封闭：向上述电极表面滴加10μL 4μM Blocker，室温反应2h，用PBS溶液清洗，晾干。
[0114] 实施例4
[0115] 循环伏安法监测电化学传感器的组装过程
[0116] 为探究电化学发光传感器的成功制备，进行循环伏安扫描记录各修饰阶段传感器的信号响应分析，将实施例3中每个步骤得到的玻碳电极(工作电极)置于含有2mM K3[Fe(CN)6]的0.01M PBS溶液中以0.1V/s的速度进行循环伏安扫描，结果见图2所示。当RuSiO2-CS修饰至电极表面后，由于电阻增大，其CV曲线峰电流值相较于裸电极有所下降。当经过Capture DNA修饰步骤后，电流值显著降低，表明有大量的Capture DNA被修饰于电极表面，有利于后续抗原检测步骤的顺利进行。随后工作电极每经历一次修饰，电流都有小幅度的下降，这是由于DNA在电极表面结合后所产生的位阻效应及电负性造成的。本实施例说明利用电化学方法监测传感器组装过程，说明传感器制备过程中成功将对应的材料和DNA修饰至电极表面。
[0117] 实施例5
[0118] 测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统检测过程
[0119] (1)取100μL待检测ATP溶液，与100μL Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针混合，37℃反应2h，磁性分离后；
[0120] (2)用20μL酶切缓冲液(包含100mM NaCl及20mM MgCl2的20mM HEPES缓冲液)重悬步骤(1)中的吸附三磷酸腺苷的磁性探针，37℃反应2h，磁性分离；
[0121] (3)将含有Trigger DNA的上清液与2μM hairpin-Fc溶液等体积混合，取10μL混合液滴于电极表面，于37℃反应2h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0122] (4)测试传感器的ECL发光信号：传感器放在含有25mM三乙胺的0.01M PBS(pH7.4)溶液中进行CV测试，电位范围0～1.3V，速率0.1V/s，同步记录ECL发光信号，光电倍增高压(PMT)为800V，计算ECL信号的衰减值，根据标准曲线计算对应的三磷酸腺苷的浓度。
[0123] 实施例6
[0124] 测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统孵育时间的优化
[0125] 探究Trigger和Hairpi-Fc的在电极表面孵育时间对ECL信号强度的影响。电化学发光传感器系统的检测过程同实施例5，ATP浓度为100pM且步骤(3)中含有Trigger DNA的上清液和Hairpin-Fc的混合液在电极表面孵育时间选用30min、60min、90min、120min、150min等5个不同时间进行本次实验。结果如图3，在反应时间≤90min，ΔECL信号强度随时间的延长而急剧增加，且在90min时达到最大值，故本发明的电化学发光传感器系统选用
90min作为孵育时间。
90min作为孵育时间。
[0126] 实施例7
[0127] 测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统ΔECL强度与抗原浓度之间的线性关系[0128] 电化学发光传感器系统的检测过程同实施例5。配制不同浓度的三磷酸腺苷标准溶液，分别为0.1pM，1pM，10pM，100pM，1000pM，每个浓度设置3个平行实验组，采用实施例5的检测方法。
[0129] 将得到ΔECL信号强度与抗原浓度的对数值进行线性关系分析，结果见图4。随着ATP浓度的升高，ΔECL信号强度逐渐变大，并呈线性关系。该传感器的最低检测限位0.054pM，与现有的商品化ATP检测试剂盒(化学发光法，最低检测限为0.1nM)相比，本发明具有更高的灵敏度。
[0130] 实施例8
[0131] 测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统对目标检测的特异性分析[0132] 考察本发明的电化学发光传感器系统对目标分析物的结构类似物是否有非特异性响应情况，电化学发光传感器系统的检测过程同实施例5，不同的是步骤(1)是选用不同的抗原：UTP、GTP、CTP代替ATP，结果如图5。在相同浓度即1000pM下，传感器能有效区分ATP，且当结构类似物存在情况下，传感器的响应信号相较于对照组无明显变化，说明本发明设计的传感器具有良好的特异性。
[0133] 实施例9
[0134] 本发明的电化学发光传感器系统应用人血清中ATP的定量检测
[0135] 为考察本发明的电化学发光传感器系统用于定量检测人血清中ATP的可行性，电化学发光传感器系统的检测过程同实施例5，步骤(1)中使用的待检测ATP溶液的制备方法为：称取不同量的ATP溶解于体积分数为10％的人血清溶液(溶剂为0.01M PBS，pH 7.4)至终浓度分别为0.1pM，1pM，10pM，100pM，1000pM。结果如图6所示，检测结果显示，本发明的电化学发光传感器系统用于检测人血清中的ATP的回收率分布于95.68％-103.4％，不同对照组间的相对标准偏差分布于1.881％-5.689％，表明该传感器系统的测试数据稳定、可靠性良好，能够用于人血清中的ATP定量检测。
[0136] 实施例10
[0137] 本实施中Au@Fe3O4-substrate-aptazyme探针的制备与实施例1制备方法相同，不同之处在于：步骤(3)所述APTES添加量为反应溶液体积的10％；Fe3O4纳米粒子的浓度为5mg/mL；步骤(4)所述Au@Fe3O4纳米粒子浓度为5mg/mL，DNA substrate的浓度为10μM，aptazyme的浓度为10μM。
[0138] RuSiO2-CS溶液按制备同实施例2，不同之处在于：量取1mL Triton X-100，5mL环己烷，1mL正己醇加入反应容器中，充分混合后，向混合液中加入250μL的5mM Ru(bpy)3Cl2水溶液，混匀后加入50μL TEOS及30μL氨水，搅拌反应12h；加入1mL丙酮后进行离心，沉淀用乙醇、水依次清洗，产物用乙醇重悬后制得1mg/mL RuSiO2溶液。
[0139] 取0.1mg CS加入0.1mL体积分数为0.5％乙酸水溶液中，超声分散5min，得到CS溶液；取0.1mL 1mg/mL RuSiO2水溶液加入至0.1mL CS溶液，超声处理10min以获得分散均匀的RuSiO2-CS溶液。
[0140] 电化学发光传感器的制备同实施例2，不同之处在于：(1)电极预处理：将工作电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后，依次用水、乙醇、水进行超声清洗2min；
[0141] (2)修饰RuSiO2：取2μL 1mg/mL RuSiO2-CS溶液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥，用PBS溶液清洗，晾干；
[0142] (3)共价连接Capture DNA：向上述电极表面滴加质量分数为0.5％戊二醛水溶液，室温反应1h后，用PBS溶液清洗，晾干；将2μL 1μM Capture DNA滴加至电极表面，37℃反应1h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0143] (4)封闭：向上述电极表面滴加2μL 1μM Blocker，室温反应1h，用PBS溶液清洗，晾干。
[0144] 实施例11
[0145] 实施例10与实施例1制备方法相同，不同之处在于：步骤(3)所述APTES添加量为反应溶液体积的5％；Fe3O4纳米粒子的浓度为0.5mg/mL；步骤(4)所述Au@Fe3O4纳米粒子浓度为0.5mg/mL，DNA substrate的浓度为5μM，aptazyme的浓度为5μM。
[0146] RuSiO2-CS溶液按制备同实施例2，不同之处在于：量取3mL Triton X-100，10mL环己烷，3mL正己醇加入反应容器中，充分混合后，向混合液中加入500μL的100mM Ru(bpy)3Cl2水溶液，混匀后加入200μL TEOS及200μL氨水，搅拌反应36h；加入10mL丙酮后进行离心，沉淀用乙醇、水依次清洗，产物用乙醇重悬后制得8mg/mL RuSiO2溶液。
[0147] 取2mg CS加入2mL体积分数为3％乙酸水溶液中，超声分散5min，得到CS溶液；取2mL 8mg/mL RuSiO2水溶液加入至2mL CS溶液，超声处理60min以获得分散均匀的RuSiO2-CS溶液。
[0148] 电化学发光传感器的制备同实施例2，不同之处在于：(1)电极预处理：将工作电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后，依次用水、乙醇、水进行超声清洗10min；
[0149] (2)修饰RuSiO2：取20μL 8mg/mL RuSiO2-CS溶液滴加至上述工作电极表面，室温下静置干燥，用PBS溶液清洗，晾干；
[0150] (3)共价连接Capture DNA：向上述电极表面滴加质量分数为5％戊二醛水溶液，室温反应3h后，用PBS溶液清洗，晾干；将20μL 10μM Capture DNA滴加至电极表面，37℃反应3h，用PBS溶液清洗，晾干；
[0151] (4)封闭：向上述电极表面滴加20μL 10μM Blocker，室温反应3h，用PBS溶液清洗，晾干。
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