一种抗冠状病毒的博落回苄基异喹啉类生物碱与白藜芦醇组
合物及其应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及药学和冠状
病毒感染药物领域，特别涉及一种抗冠状病毒的博落回苄基异喹啉类生物碱与反式白藜芦醇组合物及其应用。
背景技术
[0002]
植物化合物被称为“第七类营养素”，广泛存在于日常食物，是一类对人体健康具 有特殊作用的非营养性化学物质。相关研究发现部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物活性，并逐渐成为抗病毒研究的热点之一。初步的研究结果显示：植物化合物的生物学效应主要表现在其对细胞膜生物学特性的影响和局部微环境平衡的改变等方面，部分植物化合物通过直接嵌入细胞膜脂质双层结构，改变细胞膜正常的功能性流动和电势电位差，进而发挥一定的生物学效应。
[0003] 博落回(Macleaya cordata(Willd)R.Br.)为多年生草本，罂粟科博落回属植物，博落回茎、叶、果实均含有生物碱。博落回植株中生物碱主要为苄基异喹啉类 (benzylisoquinolines) 生物碱，其中包含血根碱、白屈菜红碱、二氢血根碱、二氢白屈菜红碱等苯并菲啶类 (benzophenanthridines) 生物碱和原阿片碱、别隐品碱等普落托品类 (protopines)生物碱。在药品领域，博落回具有较强的杀菌、抑菌活性，同时具有较好的消炎和抗
心律失常作用，目前临床上的药用范围比较宽，可
治疗小儿
肺炎、急性扁桃体炎、支气管肺炎、
耳下腺炎、急性阑尾炎、深部脓肿、胆囊炎、脉管炎、子
宫颈糜烂、不全性肠梗阻等。同时值得注意的是有科学研究表明血根碱能通过调节NF-κB通路中的核转入因子p65,降低
炎症因子IL-1β、IL-6的表达,同时提高炎症因子IL-10的表达,从而对炎症起到抑制作用。
[0004] 白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚，白藜芦醇在自然条件下 以自由态形式存在，白藜芦醇的化学结构还分别存在顺式和反式两种异构体，即顺式白藜芦醇(cis-3,4’,5-trihydroxistilbene)、反式白藜芦醇(trans-3,4’,5-trihydroxistilbene)，反式白藜芦醇是存在于植物中的天然抗
氧化剂，主要通过清除或抑制自由基生成，抑制脂质过氧化、调节抗氧化相关酶活性等机制发挥抗氧化作用，对金黄色葡萄球菌、卡他球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有抑制作用，并对孤儿病毒、单纯疱疹病毒及肠道病毒、柯萨奇A、B组有较强的抑制作用。
[0005] 冠状病毒在系统分类上属冠状病毒属（Coronavirus），冠状病毒是具有包膜的正链RNA病毒。由于2003年严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS）和2012年中东呼吸综合征（Middle East Respiratory Syndrome, MERS）的爆发，冠状病毒逐渐成为病毒学领域的一个研究热点。2019年12月，中国武汉报道了由冠状病毒新变种Covid-19冠状病毒引起的肺炎，其特点是病毒变异快、宿主多且具有较强的宿主适应性等特点。作为一种高致病性的传染性病毒，临床上尚无针对其有效的治疗药物，多以对症治疗、
预防干预为主，冠状病毒一种很容易发生突变的RNA病毒，在复制的过程中，其错误修复机制的酶活性很低，所以它产生变异的速度会非常快，而
疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发研究，所以它的疫苗比较难开发，目前，已在广泛应用抗病毒药物如：沙奎那韦(saquinavir)、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)和洛匹那韦(lopinavir)主要用于人类免疫缺乏病毒(HIV)是一种导致AIDS及其相关病变的病原性反转录病毒。吉利德科学公司研发的抗埃博拉病毒的试验药物瑞德西韦(remdesivir)，可抑制RNA合成酶（RdRp），有希望抑制Covid-19冠状病毒。因此，目前迫切需要尽快找到更多安全、有效的治疗冠状病毒的药物。
[0006] 本
发明人在大量科学实验中意外的发现，所述的博落回苄基异喹啉类生物碱与白藜芦醇的组合物与冠状病毒相关蛋白靶点有独特的结合能
力，并对部分冠状病毒感染具有抑制作用，特别是对Covid-19冠状病毒的抑制。
发明内容
[0007] 基于此，有必要提供一种博落回生物碱、反式白藜芦醇组合物及其应用，该博落回生物碱、反式白藜芦醇组合物具有抗冠状病毒的作用，特别是抗Covid-19新型冠状病毒。
[0008] 本发明第一方面提供了一种博落回生物碱、白藜芦醇组合物，具有：式1、2、3、4、5所示结构：式1 血根碱Sanguinarine
式2 白屈菜红碱Chelerythrine
式3 原阿片碱Protopine
式4 别隐品碱Allocryptopine
式5 反式白藜芦醇trans-3,4’,5-trihydroxistilbene
根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其中含有0.2％以上的式1-5结构的组合物，例如含有0.5％以上的式1-5结构的组合物，例如含有90％以上的式1-5结构的组合物。
[0009] 根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其中含有10％～90％的式1-5结构的组合物，例如含有90.5％～99.8％上的式1-5结构的组合物。
[0010] 根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其中相对于式1-5结构的组合物而言，式6-17结构的含量小于0.2%。，例如小于0.19％，例如小于0.15％，例如小于0.1％，例如小于0.05％。
[0011] 在本发明中，短语“对于式1-5结构的化合物而言，式6-17结构的化合物的含量”是指对于所涉及的组合物中，式6-17结构的化合物相对于式1-5结构的化合物的量。例如对于某一组合物中若其中包含10mg式1-5结构的组合物，经测定其中还包含有0 .02mg的式6-17结构式的组合物，则对于式1-5结构式的组合物而言，式9-17结构式组合物的量为0.2％。对于其它衍生物或杂质相对于式1-5结构式的组合物物的量的类似表述亦有类似含义。
[0012] 本发明的目的在于提供一种针对冠状病毒，特别是对Covid-19冠状病毒有明显抑制或阻断作用的药物组合，例如具有稳定药学特征，特别是式1-5化合物的原料或者由其制成的制剂。并通过将式1-5化合物的原料中的衍生物或杂质式6-17控制在一定范围以下，以实现该种药物组合制剂具有优异的
稳定性。
[0013] 本发明通过设立阳性性对照，进行
人工智能模拟药物分子靶点筛选发现，博落回苄基异喹啉类生物碱与反式白藜芦醇组合物对以Covid-19冠状病毒为例的冠状病毒特征蛋白靶点有很好结合活性和显著的病毒活性抑制作用，因此所述组合物有望作为治疗以Covid-19冠状病毒为例的冠状病毒主感染的潜在药物。
[0014] 在本发明的一个
实施例中，所述用于抑制病毒感染的组合物具体由血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇组合而成；所述血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇的
质量配比为1:0.1:0.1:0.1:1。
[0015] 在本发明中，所述抑制冠状病毒感染为如下(a)或(b)：(a)预防冠状病毒感染；
(b)在与冠状病毒同时作用于宿主或宿主细胞时，抑制所述冠状病毒对所述宿主或所述宿主细胞的感染。
[0016] 更加具体的，在本发明的实施例中，所述制剂对所述冠状病毒感染的抑制作用具体体现为：以
哺乳动物细胞作为冠状病毒感染对象，在冠状病毒感染细胞的同时或者在冠状病毒感染细胞前施用所述组合物，所述组合物对冠状病毒的半数抑制浓度与抑制病毒感染的阳性对照药物相比显著降低。所述阳性对照药物具体为利巴韦林(Ribavirin)。
[0017] 本发明以Covid-19冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)为实验对象，采用人工智能计算机辅助药物分子结构设计系统，分别测试了血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇这五种植物化合物
单体与冠状病毒蛋白靶点结合规律和特点。结果证实：本发明所提供的五种植物化合物单体与潜在阳性对照药物瑞德西韦相比均具有较明显的病毒靶点结合活性，显示可以有效的抑制冠状病毒的感染。
[0018] 本发明以冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV)为实验对象，采用观察细胞病变的方法，在不同的感染条件下，分别分析了血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇这五种植物化合物单体及其混合制剂抑制病毒感染的规律和特点。结果证实：本发明所提供的五种植物化合物单体和复合配方组合物的细胞毒性均不高于已经获得安全
许可的对照样品利巴韦林，较为安全。在安全的使用浓度下，预防性使用血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇单体以及
植物提取物复合配方组合物，可以有效的抑制冠状病毒的感染。本发明所提供的组合物具有进一步研发为冠状病毒感染
抑制剂的商业价值。
[0019] 本发明提供一种预防或治疗含有冠状病毒感染的组合物，其活性成分为博落回苄基异喹啉类生物碱与反式白藜芦醇组合物，该组合物包含上述含有博落回苄基异喹啉类生物碱与反式白藜芦醇以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、
粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、
表面活性剂、
吸附载体、
润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、栓剂、悬浮剂或乳剂的形式使用。其
给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射、黏膜给药。
[0020] 本发明具有的优点和积极效果是：本发明提供了针对以Covid-19冠状病毒为例的冠状病毒感染的抑制剂，这种抑制剂为博落回苄基异喹啉类生物碱与反式白藜芦醇组合物，对以Covid-19冠状病毒为例的冠状病毒活性具有显著的抑制效果。
[0021]
附图表说明图1为血根碱分子、瑞德西韦分子与Covid-19冠状病毒RNA合成酶RdRp对接模式图。
具体实施方式
[0022] 下面将结合本发明的具体实施例以及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明均为本领域的常规方法。
[0024] 下述实施例中涉及的定量实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 17 .0统计
软件运用单因素
水平方差分析的方法对组间比较数据进行统计处理。
[0025] 细胞株：鼠
成纤维细胞(17Cl-1细胞)，病毒：冠状病毒(鼠
肝炎冠状病毒A59株，简称MHV-A59 )培养液：①、细胞生长培养液：以DMEM培养基为母液，分别加入10％(体积分数)胎
牛血清，0.2mg/ml谷
氨酰胺，100U/ml 青霉素，
链霉素。②、细胞维持培养液，胎牛血清含量为2％(体积分数)，其余与1 )均相同。③、病毒增殖培养液：与细胞生长培养液相同。
[0026] 供试品：血根碱CAS#: 5578-73-4、白屈菜红碱CAS#: 34316-15-9、原阿片碱CAS#: 130-86-9、别隐品碱CAS#: 485-91-6和白藜芦醇CAS#: 501-36-0
阳性对照品：利巴韦林(Ribavirin)
仪器设备：倒置相差
显微镜、多功能细胞
培养箱、多功能酶标仪。
[0027] 试验流程：1、细胞复苏与传代→2、病毒增殖→3、病毒滴度TCID50测定。
[0028] 实施例一、博落回苄基异喹啉类生物碱与白藜芦醇组合物病毒感染抑制剂的制备
将血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇的质量配比按1:0.1:0.1:0.1:
1的比例混合均匀，得到组合物配方制剂。
[0029] 实验前以PBS缓冲液溶解，制成2800μg/ml（血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇在溶液中的总浓度）过滤，除菌后，-20℃保存备用。
[0030] 实施例二、细胞毒性试验
本实施例采用中性红吞噬法测定实施例一制备的组合物配方制剂对哺乳动物细胞的细胞毒性。
[0031] 表1. 植物化合物单体和组合物配方制剂的细胞最大无毒性实验结果实施例三、冠状病毒感染抑制试验
本实施例采用CPE法测定实施例1制备的组合物配方制剂对冠状病毒感染的抑制效果。
供试冠状病毒为鼠肝炎冠状病毒A59株。
[0032] 结果显示，组合物复合配方制剂和利巴韦林均可干扰冠状病毒感染17Cl-1细胞。其中，在病毒吸附同时和吸附前添加抑制剂的情况下，组合物复合配方制剂抑制病毒感染的效果最好，其病毒半数抑制浓度分别为168±11μg/ml 和129±16μg/ml，而在病毒吸附后添加抑制剂的条件下，对照药品利巴韦林抑制病毒的效果较好，其病毒半数抑制浓度为243±25μg/ml。在单体抑制剂中，血根碱在病毒吸附前添加时，其抑制病毒的感染效果最好，病毒半数抑制浓度为162±14μg/ml，在病毒吸附后添加白屈菜红碱、原阿片碱、别隐品碱和白藜芦醇时，均可有效抑制冠状病毒的感染。具体结果见表2
表2.各抑制剂对冠状病毒感染半数抑制浓度(IC50 )
综合实施例2和3的实验结果发现：本发明所提供的组合物配方制剂的细胞毒性不高于已经获得安全许可的对照样品利巴韦林，较为安全。在安全的使用浓度下，预防性使用本发明所提供的组合物复合配方制剂，可以有效的抑制冠状病毒的感染。本发明所提供的复合配方制剂具有进一步研发为新型冠状病毒感染抑制剂的商业价值。
[0033] 实施例四、人工智能模拟药物分子Covid-19冠状病毒蛋白靶点虚拟筛选试验虚拟筛选试验的目标药物分子包括：临床常用药物利托那韦、洛匹那韦、孟鲁司特、辛那西林、雷米昔韦、虎杖苷6种，血根碱、白藜芦醇等植物化合物7种。
[0034] 试验方法：利用薛定谔的Glide程序和opls3力场制备的受体网格进行了分子对接模拟。在侧长为20Å的同源模拟络合物中，网格中心被设置为配体的质心。配体以SP（标准
精度）模式对接，所有其他参数设置为Glide对接过程的默认值。
[0035] 具体结果见表3表3. 三个Covid-19目标靶蛋白实体，结合Glide对接得分和MMGBSA自由能计算。
[0036] 虚拟筛选实验结果表明：本发明所提供的苄基异喹啉类生物碱与白藜芦醇组合物对三个Covid-19目标靶蛋白实体具有明显的结合活性，其中血根碱Sanguinarine表现最为突出，相比常用的阳性对照药物分子瑞德西韦Remdesivir而言，血根碱Sanguinarine与Covid-19冠状病毒RNA合成酶（RdRp）结合所需的自由能明显更低，提示血根碱Sanguinarine对病毒RNA合成酶（RdRp）的抑制可能具有更突出的表现。
[0037] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
