白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法
阅读：521发布：2020-05-13
专利汇可以提供白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，尤其涉及 白藜芦醇 的用途及原始卵泡的体外激活 试剂 与方法。本发明以白藜芦醇处理卵巢皮质区组织，同时激活AKT和mTOR两个 信号 通路关键蛋白，对SIRT1 水 平也存在促进作用。卵巢皮质区组织在含白藜芦醇的激活培养液中培养，可体外唤醒休眠的原始卵泡，之后便可进行手术移植。白芦藜醇是一种葡萄酒等人类食物中富含的天然物质，其对 机体 的毒 副作用 未见报道，故用于IVA的可行性和安全性值得肯定甚至优于现有IVA药物；并且，白芦藜醇能够提高应用于原始卵泡IVA的效率，即体外激活时间缩短至三十分钟，且患者只需单次手术，从而大大降低了患者的痛苦和手术 费用 等。，下面是白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法专利的具体信息内容。
白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法
技术领域
背景技术
[0002] 在雌性哺乳动物中，卵泡是卵巢的基本功能单元，哺乳动物的卵泡是由位于卵泡中心的、被阻滞在第一次减数分裂前期的卵母细胞、包裹在其周围的颗粒细胞及最外层的膜细胞构成。哺乳动物在出生前后其原始卵泡库即建立完成。此后，原始卵泡数目不会再增加，且随着年龄的增加会周期性地减少，因此原始卵泡是一个不可再生资源。
[0003] 原始卵泡库建立之后，每次只有不到5％原始卵泡能够被激活并进入生长卵泡阶段，而卵巢中的绝大部分原始卵泡仍处于休眠状态。原始卵泡激活之后，进一步经历初级卵泡、次级卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡和排卵前卵泡阶段最终排卵，或者在发育过程中闭锁。在人类，最后一组原始卵泡大约在50岁左右被激活。目前，人们尚不清楚为什么一些原始卵泡能启动生长，而其邻近的卵泡却能保持静止的原因。目前有关原始卵泡细胞中激素受体未见报道，故原始卵泡的起始募集可能不受内分泌激素的调控，而受卵巢自身分泌的旁分泌因子调控。目前认为自分泌、旁分泌因素以及卵母细胞和前颗粒细胞之间相互作用参与调节原始卵泡的生长启动。
[0004] 原始卵泡的激活包括颗粒细胞的生长分化和卵母细胞的生长两部分。原始卵泡的激活是前体颗粒细胞和卵母细胞之间精密协调互作的过程。研究表明：原始卵泡的激活起始于前体颗粒细胞，当激活前体颗粒细胞mTOR后，可促进其胞内KitL蛋白的表达，KitL分泌到胞外后与卵母细胞膜上的受体Kit结合，继而激活卵母细胞内的PI3K信号通路，最终促进了原始卵泡的激活。已有研究证明，卵母细胞中存在的PTEN-PI3K-AKT-FOXO3A和TSC1/TSC2-mTOR两条信号通路在原始卵泡激活过程中均发挥重要作用。
[0005] 近年来，以目前已知的原始卵泡激活机制中的重要蛋白为靶标，人们已将其应用于相关的临床治疗。目前，将卵巢皮质区原始卵泡在体外用相应药物处理后，唤醒休眠的原始卵泡，被称为原始卵泡体外激活(in vitro activation primordial follicle,IVA)。将体外激活的原始卵泡移植回体内，待其发育成熟后，取出卵母细胞，经体外受精之后再将胚胎移植回母体，即能够促使胚胎正常发育，最终得到出生后健康发育的婴儿。这种治疗方法为因各种原因导致卵巢早衰(如提前做过卵巢冷冻的临床癌症治疗患者)实现生育提供了可能。目前已公开的关于原始卵泡IVA的技术主要是利用AKT、mTOR激动剂或者是两种激动剂联合使用，在体外处理卵巢皮质组织，促进原始卵泡激活，其缺点是均需要一种或两种药物，并且体外组织处理时间需要24小时，这就造成患者需要经历两次手术才能完成原始卵泡的IVA过程。
[0006] 白藜芦醇(Resveratrol)化学名称为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯，是一种多酚类化合物，又称为芪三酚。近年来的研究表明白藜芦醇具有广泛的生物活性，但目前尚未见关于白藜芦醇对原始卵泡体外激活的作用。
发明内容
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法，经验证，白藜芦醇作为原始卵泡的体外激动剂，激活时间短，安全性更高。
[0008] 白藜芦醇在制备mTOR激动剂中的应用。
[0009] 本发明提供了白藜芦醇在制备卵巢中mTOR激动剂中的应用。
[0010] mTOR(mammalian target of rapamycin)是一种保守的酪氨酸激酶，在调节细胞增殖、生长、存活、分裂、运动和血管生成中起到关键作用。本发明研究表明，白藜芦醇处理能够提高小鼠卵巢中磷酸化mTOR的水平和总mTOR水平。即本发明提供了白藜芦醇在制备提高磷酸化mTOR的水平和/或总mTOR水平的制剂中的应用。
[0011] 白藜芦醇在制备AKT激动剂中的应用。
[0012] 本发明提供了白藜芦醇在制备卵巢中AKT激动剂中的应用。
[0013] AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对细胞代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等多种生物学过程进行调控。本发明研究表明，白藜芦醇处理能够提高小鼠卵巢中磷酸化AKT的水平和总AKT水平。即本发明提供了白藜芦醇在制备提高磷酸化AKT的水平和/或总AKT水平的制剂中的应用。
[0014] 白藜芦醇在制备提高SIRT1水平的制剂中的应用。
[0015] 本发明提供了白藜芦醇在制备提高卵巢中SIRT1水平的制剂中的应用。
[0016] SIRT1在成熟组织中广泛的表达，在生殖细胞中含量丰富，与众多基因的转录调控、能量代谢及细胞衰老的过程的调节有关，也是内源性的凋亡抑制因子。本发明研究表明，白藜芦醇处理能够提高卵巢中SIRT1水平。
[0017] 本发明验证白芦藜醇功能的模型为小鼠和人的卵巢组织体外培养，所述卵巢具体为卵巢皮质区组织。所述小鼠为5日龄和35日龄C57BL/6J小鼠，人卵巢组织为28-35周岁多囊卵巢综合症患者卵巢皮质区。本发明研究表明，在体外培养条件下，白藜芦醇对卵巢中mTOR和AKT存在激动作用。
[0018] 白藜芦醇在制备原始卵泡的体外激活试剂中的应用。
[0019] 本发明实验表明，白藜芦醇处理能够在体外唤醒休眠的原始卵泡，之后便可进行手术移植，让激活培养液处理后的卵泡进一步生长发育。
[0020] 本发明还提供了一种原始卵泡的体外激活试剂，其包括白藜芦醇。
[0021] 本发明中，所述白藜芦醇的工作浓度为35μmol/L～45μmol/L。
[0022] 本发明实施例中，所述白藜芦醇的浓度为40μmol/L。
[0023] 本发明中，还包括DMEM-F12培养基。
[0024] 本发明提还提供了一种原始卵泡的体外激活试剂盒，包括白藜芦醇溶液、DMEM-F12培养基和PBS溶液。
[0025] 所述DMEM-F12培养基的配方为：
[0026]
[0027] 本发明提供的原始卵泡的体外激活方法，将卵巢皮质区组织于所述的体外激活试剂中培养。所述培养的条件为37℃，30min。
[0028] 所述卵巢皮质区组织在培养前经无菌PBS溶液清洗。
[0029] 所述培养后，将卵巢皮质区组织再置于DMEM-F12培养基中培养12h。
[0030] 本发明以白藜芦醇处理卵巢皮质区组织，同时激活AKT和mTOR两个信号通路关键蛋白。卵巢皮质区组织在37℃的含有白藜芦醇的激活培养液中培养30分钟，即可体外唤醒休眠的原始卵泡，之后便可进行手术移植，让激活培养液处理后的卵泡进一步生长发育。白芦藜醇是一种葡萄酒等人类食物中富含的天然物质，其对机体的毒副作用未见报道，故用于IVA的可行性和安全性值得肯定甚至优于现有IVA药物；并且，白芦藜醇能够提高应用于原始卵泡IVA的效率，即体外激活时间缩短至三十分钟，这样患者只需单次手术，从而大大降低了患者的痛苦和手术费用等。附图说明
[0031] 图1示白芦藜醇处理出生后(5dpp)小鼠卵巢30分钟后，在空白培养基培养12h，磷酸化形式和总的mTOR、AKT以及SIRT1的影响；
[0032] 图2示白芦藜醇处理35dpp小鼠卵巢30分钟后，在空白培养基培养12h，磷酸化形式和总的mTOR、AKT以及SIRT1的影响；
[0033] 图3示白芦藜醇处理人卵巢30分钟后，在空白培养基培养12h，磷酸化形式和总的mTOR、AKT以及SIRT1的影响；
[0034] 图4和图5示白芦藜醇处理5dpp小鼠卵巢30分钟后，肾被膜移植14天，结果显示白芦藜醇处理明显促进原始卵泡的发育；
[0035] 图6和图7示白芦藜醇处理35dpp小鼠卵巢30分钟后，肾被膜移植14天后，结果显示白芦藜醇处理明显促进原始卵泡的发育；
[0036] 图8示白芦藜醇处理35dpp小鼠卵巢30分钟后，肾被膜移植14天后，结果显示白芦藜醇处理明显促进原始卵泡的发育。
具体实施方式
[0037] 本发明提供了白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0038] 本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0039] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0040] 实施例1
[0041] 实验材料：
[0042] 5日龄C57BL/6J雌鼠、35日龄C57BL/6J雌鼠，各20只。人卵巢组织20块。
[0043] 实验试剂：
[0044] 试剂A：卵巢基础培养基
[0045] 试剂B：40mM白芦藜醇
[0046] 试剂C：无菌PBS
[0047] 实验方法
[0048] 1.在6孔板中加入1.2mL试剂A，加入1.2μL试剂B，另设仅添加试剂A的空白对照。各组试剂皆置于37℃预热10分钟；
[0049] 2.将相应卵巢皮质区组织在试剂C中切成1mm3小块后放于上述预热好的6孔板，再放入细胞培养箱培养30分钟，培养条件为37℃，5％CO2。
[0050] 3、步骤2后，以无菌PBS洗涤后，各组组织以试剂A继续培养12h，检测SIRT1水平，磷酸化形式的mTOR、AKT，以及总mTOR、AKT水平(结果如图1～图3)，将步骤2后的卵巢组织移植到免疫缺陷鼠肾被膜下，14天后，切片观察各级卵泡发育情况并统计卵泡数目(结果如表1和图4～图8)。
[0051] 表1不同级别卵泡统计数目
[0052] 对照 白藜芦醇
原始卵泡 40.63±5.24 25.33±4.08
初级卵泡 30.05±4.32 40.31±4.55
次级卵泡 16.57±1.08 20.21±1.34
有腔卵泡 12.75±1.75 14.15±1.51
原始卵泡 40.63±5.24 25.33±4.08
初级卵泡 30.05±4.32 40.31±4.55
次级卵泡 16.57±1.08 20.21±1.34
有腔卵泡 12.75±1.75 14.15±1.51
[0053] 综合以上显示，白芦藜醇能够显著提高SIRT1水平，磷酸化形式的mTOR、AKT，以及总mTOR、AKT水平；且肾被膜移植14天后，对照组与白藜芦醇处理组相比，总的卵泡数量差异不大，说明，白芦藜醇处理对总的卵泡数量并不产生影响。而经白藜芦醇处理后，相对于对照组原始卵泡的数量减少，而初级卵泡的数量相对于对照组而言则显著增多(p<0.05)，说明白藜芦醇处理能够促进原始卵泡的发育，且对卵泡没有毒副作用。
[0054] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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