一种PY序列短肽及其在抑制hERG钾通道降解中的应用
阅读：239发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种PY序列短肽及其在抑制hERG钾通道降解中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种PY序列短肽及其在抑制hERG 钾 通道降解中的应用，所述短肽的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种上述PY序列短肽的衍 生物 ，其为所述PY序列短肽与细胞穿透肽连接所形成的嵌合肽。所述细胞穿透肽连接于所述PY序列短肽的C端或N端。所述细胞穿透肽的序列如SEQ ID NO.2所示。一种上述的PY序列短肽及其衍生物在抑制hERG钾通道降解中的应用。本发明根据Nedd4-2与hERG通道结合位点设计的PY序列短肽，可以在细胞和整体动物 水 平显著增大IKr 电流 ，该作用可以显著 预防 心肌肥厚所伴随的电生理重构，有望应用于对抗病理性心肌肥厚所致的 心律失常 。，下面是一种PY序列短肽及其在抑制hERG钾通道降解中的应用专利的具体信息内容。
一种PY序列短肽及其在抑制hERG钾通道降解中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 病理性心肌肥厚是高血压、心肌缺血、糖尿病心肌病等多种疾病的常见合并症，它是多种神经体液因素介导、多种细胞信号通路参与的复杂病理生理过程。组织学上的肥厚性重构（remodeling)在早期可代偿性增加心输出量，但不断发展可导致心脏收缩功能失代偿，最终发生心力衰竭。与肥厚性重构相伴的是心肌电生理重构，使得心律失常的发生率大大提高，由此导致的心源性猝死（Sudden cardiac death, SCD）约占心衰病人死亡的50%。而现有抗心律失常药物大多同时具有潜在的致心律失常风险而使用受限。因此，寻找肥厚所致电重构的新的防治靶点是近年心血管领域研究的重要课题。
[0003] 由各种实验动物模型及心衰病人心室细胞电生理记录发现，心肌电生理重构最突出的表现是心肌细胞复极化过程变慢而致动作电位时程（APD）延长，在体表心电图表现为QT间期的延长(属于获得性LQT综合症)。复极延迟易发生早后除极（EAD）引发触发电活动，加上复极离散度的增大导致兴奋折返而发生室性快速性心律失常。
[0004] 已知心肌细胞膜上存在各种电压门控性K+通道，包括瞬时外向K+通道（电流为Ito）、快、慢延迟整流K+通道（对应电流成分为IKr、IKs），是决定APD和动作电位形态的关键分子基础。其中Ito是包括人在内的大动物心脏快速复极1期的主要电流，而在啮齿类小动物则是整个复极期的主要电流成分；IK（r 通道孔区亚单位由hERG基因编码）和IK（s 通道由亚单位基因KCNQ1和β亚单位基因KCNE1编码）是大动物2相平台、3相复极的主要电流。过去的10-20年间，大量的实验研究发现，心肌肥厚导致APD延长的最为可能的原因是不同K+电流密度的减小。已在不同原因（包括心室快速起搏、后负荷过高）所致的多种心肌肥厚、心衰动物（包括小鼠、大鼠、兔、犬等）模型及心衰的人心室肌细胞观察到Ito密度减小；本课题组前期的实验也在病理性肥厚的豚鼠心脏中观察到IKr的减小。
[0005] 鉴于K+电流减小是心肌肥厚电重构的主要原因，人们尝试用通道开放剂增大K+电流来对抗病理性APD延长。多种IKr通道开放剂亦表现出同样的对抗病理性电重构的防治效果，我们的前期实验亦观察到，IKr开放剂在离体心脏可以有效预防APD延长所致的室速和室颤（VT/VF）。因此，使用K+通道开放剂可望成为治疗心肌肥厚电重构的新策略。然而，近年临床发现K+通道gain of function突变造成短QT（SQT）综合症具有引发室颤的危险，似乎又+提示这些K通道开放剂缩短QT间期可能具有潜在的致心律失常风险。我们最近观察到不同的IKr开放剂在离体灌流心脏引发VT/VF，动作电位钳下记录外向K+电流发现这些开放剂增大外向复极电流的同时改变电流形状，特别是早期复极电流增大，在APD和ECG参数中表现为相应的早期复极时间缩短，缩短程度与心律失常发生高度相关，这表明改变通道动力学+ +
增大K复极电流与阻断通道减小K电流的药物一样存在致心律失常风险。因此，如何另辟新径来增大K+电流成为本领域的重要研究课题。
增大K复极电流与阻断通道减小K电流的药物一样存在致心律失常风险。因此，如何另辟新径来增大K+电流成为本领域的重要研究课题。
发明内容
[0006] 本发明的目的就是提供一种PY序列短肽及其在抑制hERG钾通道降解中的应用，以解决现有K+通道开放剂潜在的致心律失常风险问题，为增大K+电流提供一种新途径。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种PY序列短肽，所述短肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008] 一种上述PY序列短肽的衍生物，所述衍生物为所述PY序列短肽与细胞穿透肽连接所形成的嵌合肽。
[0009] 进一步地，所述细胞穿透肽连接于所述PY序列短肽的C端或N端。
[0010] 更进一步地，所述细胞穿透肽的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 一种上述的PY序列短肽在抑制hERG钾通道降解中的应用。
[0012] 一种上述的衍生物在抑制hERG钾通道降解中的应用。
[0013] 心肌细胞膜K+通道电流的大小取决于通道动力学和细胞膜上功能通道的数量，后者除受基因转录、蛋白合成调控外，细胞膜通道蛋白的转运也是影响IKr通道细胞膜表达量的关键因素，细胞膜通道蛋白数量取决于两个反方向转运过程：一是正向转运，通道蛋白在内质网（ER）合成经转运囊泡到高尔基体转运至细胞膜上（上膜）；二是膜上的通道蛋白内化（internalization）进入早期内体（early endosome），部分可以再循环到细胞膜上，另外一部分进入晚期内体(late endosome)，经蛋白酶体或溶酶体途径降解。而泛素化是通道膜蛋白内化的第一步，通过实验表明，E3泛素连接酶成员Nedd4-2是启动此反应的关键分子，它与目标蛋白的PY序列呈特异结合使其泛素(Ub)化。电压门控性K+通道中hERG的C末端便具有PY序列，Nedd4-2可以将其泛素化而进入早期内体。因此，抑制Nedd4-2的功能可望抑制通道泛素化降解过程，从而增多膜通道数量而增大IKr电流。
[0014] 基于上述原理，本发明设计了序列为MTLVPPAYSAVT的氨基酸短肽链，其能够与Nedd4-2特异性结合，从而可以与靶通道竞争性的结合Nedd4-2，达到抑制Nedd4-2功能的目的。同时我们委托试剂公司合成了具有上述序列的短肽，并在其一端加上了序列为Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg的细胞穿透肽，便于短肽进入细胞。通过观察合成的PY序列短肽在稳转hERG通道的细胞水平和豚鼠整体水平对Nedd4-2所致hERG通道降解的预防作用，表明其可以显著增大IKr电流，从而显著预防心肌肥厚所伴随的电生理重构，有望应用于对抗病理性心肌肥厚所致的心律失常。附图说明
[0015] 图1为转染不同量Nedd4-2质粒对hERG蛋白表达的影响。其中A为典型Westernblot图；B为以内参GAPDH标化后的各组条带灰度值的统计结果。n=4,*P<0.05 vs CON,#P<0.05 vs 500ng group。
[0016] 图2为转染不同量Nedd4-2质粒对hERG电流的影响。其中A为膜片钳记录的典型hERG电流图；B为尾电流密度-电压关系曲线和最大电压下的电流密度统计图。n=15-20, *P<0.05 vs CON。
[0017] 图3为PY序列短肽预防Nedd4-2下调hERG蛋白的作用结果图。其中A为对照组(CON)，典型Westernblot图；B为以内参GAPDH标化后的各组条带灰度值的统计结果。n=5, *P<0.05 vs CON, #P<0.05 vs 单独转染Nedd4-2质粒组。
[0018] 图4为PY序列短肽预防Nedd4-2减小hERG电流的作用结果图。其中A为尾电流密度-电压关系曲线；B为最大电压下的电流密度统计图。
[0019] 图5为PY序列短肽预防血管紧张素II（Ang II）所致豚鼠猝死百分率的结果图。
[0020] 图6为PY序列短肽对各组豚鼠心电图QT间期的影响结果图。其中，A：各组豚鼠在第0天和第14天体表心电图记录典型图。B：各组豚鼠在不同天数QT间期统计结果(n=4, **P <
0.01 vs 第0天)。
0.01 vs 第0天)。
[0021] 图7为PY序列短肽对豚鼠左室细胞动作电位时程的影响结果图。其中，A：0.5Hz频率刺激下记录各组左室细胞动作电位时程的典型图。B：APD30，APD50和APD90的统计结果图(n=8-10,细胞来自4个不同心脏，*P<0.05 vs对照组，#P<0.05 vs模型组)。
[0022] 图8 为PY序列短肽对各组豚鼠左室细胞IKr电流的影响结果图。其中，A：各组左室细胞IKr尾电流典型记录曲线。B：尾电流密度-电压关系曲线和最大电压下的电流密度统计图(n=11-17, 细胞来自4个不同心脏，*P<0.05 vs对照组, #P<0.05 vs模型组)。
具体实施方式
[0023] 下面结合具体的实施例对本发明的技术效果进行详细阐述。本发明中未提及的实验方法和实验条件均为本领域技术人员公知的常规实验操作。
[0024] 实施例1 稳转hERG钾通道的细胞水平实验（1）观察Nedd4-2对hERG蛋白的下调作用：
在稳转的hERG- HEK293细胞上导入三个浓度的Nedd4-2质粒，观察其对hERG蛋白的影响。结果如图1所示，转染Nedd4-2质粒(500 ng、1000 ng、2000 ng)均显著降低膜上成熟的hERG蛋白(155 kDa而非135 kDa)的表达。
在稳转的hERG- HEK293细胞上导入三个浓度的Nedd4-2质粒，观察其对hERG蛋白的影响。结果如图1所示，转染Nedd4-2质粒(500 ng、1000 ng、2000 ng)均显著降低膜上成熟的hERG蛋白(155 kDa而非135 kDa)的表达。
[0025] 图1表明，和对照组(CON)相比，转染Nedd4-2质粒500ng、1000ng和2000ng分别使成熟型的hERG蛋白(155kD)减少至对照水平的63.14%、49.64%和51.57%。而非成熟型hERG蛋白(135kD)在各组间无明显差异。
[0026] （2）观察Nedd4-2对hERG电流的影响：全细胞膜片钳结果如图2所示，不同浓度的Nedd4-2质粒均明显减小hERG电流(电压为+
50mV时，CON: 55.83±6.56 pA/pF, 500ng: 24.85±2.14 pA/pF, 1000ng: 25.55±2.02 pA/pF, 2000ng: 29.55±2.22 pA/pF, P< 0.001 vs CON)。其中，转染1000ng Nedd4-2与
2000ng对hERG蛋白的下调和hERG电流的减小没有明显差异，所以后续实验采用1000ng Nedd4-2质粒转染。
50mV时，CON: 55.83±6.56 pA/pF, 500ng: 24.85±2.14 pA/pF, 1000ng: 25.55±2.02 pA/pF, 2000ng: 29.55±2.22 pA/pF, P< 0.001 vs CON)。其中，转染1000ng Nedd4-2与
2000ng对hERG蛋白的下调和hERG电流的减小没有明显差异，所以后续实验采用1000ng Nedd4-2质粒转染。
[0027] 图2表明，与对照组相比，三个浓度Nedd4-2质粒均显著减小hERG电流。
[0028] （3）PY序列短肽对Nedd4-2下调hERG蛋白的影响：图3的Western blot结果显示，不同浓度的PY短肽均可以显著预防Nedd4-2引发的成熟hERG蛋白下调，使hERG蛋白恢复至对照组水平，而随机打乱氨基酸排列顺序的乱码肽则无此作用。
[0029] （4）PY序列短肽对Nedd4-2减小hERG电流的影响：图4的全细胞膜片钳结果显示，三个浓度PY短肽均显著恢复hERG电流至对照水平，乱码肽则无明显作用(电压为+50mV时, CON: 55.83 ± 4.55 pA/pF,Nedd4-2:21.92±1.67 pA/pF, 乱码肽(500 nM): 22.71 ± 2.06 pA/pF, PY短肽(100 nM): 45.31 ± 3.63 pA/pF, PY短肽(200 nM): 45.75± 2.55 pA/pF, PY短肽(500 nM): 50.95 ± 3.06 pA/pF)。
[0030] 实施例2 整体动物水平实验血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种内源性的激素，与血管紧张素受体结合，具有强烈的缩血管功能而增加心脏的负荷，慢性给药可用于诱导病理性心肌肥厚。本课题组前期的实验显示，AngⅡ诱导的病理性心肌肥厚模型中IKr电流明显减小，而Nedd4-2的激活导致hERG通道泛素化降解增多是主要原因。在本实施例中仍然使用AngⅡ制备豚鼠病理性心肌肥厚的模型。实验选用SPF级成年雄性豚鼠，体重300g左右（购自北京维通利华动物实验中心）随机分为对照组(CON，n=4)、心肌肥厚模型组(AngⅡ，n=7)和实验组(AngⅡ+PY短肽，n=5)。其中，模型组通过颈背部皮下置入渗透泵的方式持续给予Ang II (0.6 mg/kg/d)两周造成豚鼠心肌肥厚，而实验组在给予Ang II的同时，趾间静脉注射PY短肽(0.231mg/kg/2d)。实验开始前(第0天)将三组豚鼠进行体表心电图记录，实验结束后(第14天)再次进行体表心电图记
0.601
录，测量心率（HR），RR间期，QT间期，通过Bozzat公式QT×(333/RR) 校正后求平均值，得校正后的QT间期（QTc），记录豚鼠心电图QT间期的改变；观察并记录实验过程中豚鼠发生猝死的比例；实验结束后采用Langendorff离体灌流酶解法分离豚鼠左室心肌细胞进行动作单位时程(APD)和IKr电流记录。实验结果如图5 图8所示。
~
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录，测量心率（HR），RR间期，QT间期，通过Bozzat公式QT×(333/RR) 校正后求平均值，得校正后的QT间期（QTc），记录豚鼠心电图QT间期的改变；观察并记录实验过程中豚鼠发生猝死的比例；实验结束后采用Langendorff离体灌流酶解法分离豚鼠左室心肌细胞进行动作单位时程(APD)和IKr电流记录。实验结果如图5 图8所示。
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[0031] 由图5可知，模型组(AngⅡ)7只豚鼠猝死3只，猝死率为42.9%；而实验组(AngⅡ+PY 短肽)5只豚鼠猝死1只，猝死率为20%，表明PY短肽可以明显减少心肌肥厚模型鼠猝死的比例。
[0032] 体表ECG结果显示(图6)，与实验前相比，实验结束时CON组豚鼠QTc间期没有明显变化(10.92±0.27,10.23±0.39)，AngⅡ组豚鼠QTc间期明显延长(10.44±0.14，12.35±0.72，P<0.01)，而PY短肽可以有效对抗这种QT间期的延长(10.05±0.38，10.59±0.21)。
[0033] 分离豚鼠心肌细胞记录APD，并统计相关参数(APD30, APD50, APD90)。结果如图7所示，与对照组相比(CON: 217.76±85.54ms，572.03±53.21ms，667.86±44.69ms)，模型组左室心肌细胞动作电位APD30、APD50与APD90均显著延长 (AngⅡ: 659.21±88.16ms，939.67±68.74ms，1003.01±55.11ms)，而注射PY短肽则可以明显使APD50与APD90恢复至对照水平(AngⅡ+PY短肽: 398.5963±84.20ms，653.0837±79.14ms，708.39±77.29ms)。
[0034] 分离左室心肌细胞记录IKr电流，结果如图8所示，与对照组相比(电压为+60mV时，CON: 0.512±0.051 pA/pF)，模型组IKr尾电流明显减小(电压为+60mV时，Ang II: 0.22±0.015 pA/pF)，而注射PY短肽则可以显著增大IKr尾电流(电压为+60mV时，Ang II+PY短肽:
0.4±0.048 pA/pF)。
0.4±0.048 pA/pF)。
[0035] 综合以上所有结果可知，本发明根据Nedd4-2与hERG通道结合位点设计的PY序列短肽，可以在细胞和整体动物水平显著增大IKr电流，该作用可以显著预防病理性心肌肥厚所伴随的电生理重构，有望应用于对抗病理性心肌肥厚所致的心律失常。
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