一种喹唑啉荧光探针及其制备方法和应用
阅读：892发布：2023-12-21
专利汇可以提供一种喹唑啉荧光探针及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 属于 生物 医药的技术领域，尤其涉及一种喹唑啉 荧光 探针及其制备方法和应用。本申请提供了一种喹唑啉荧光探针，其化学式如式Ⅰ所示，其中，R1选自H或Cl；R2选自荧光分子；n为2-8的整数。本申请提供了一种喹唑啉荧光探针及其制备方法和应用，能排除生物体自发荧光的干扰，高效的、准确的在生物体中检测TSPO含量。，下面是一种喹唑啉荧光探针及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种喹唑啉荧光探针，其化学式如式Ⅰ所示，
其中，R1选自H或Cl；R2选自荧光分子；n为2-8的整数。
2.根据权利要求1所述的喹唑啉荧光探针，其特征在于，所述荧光分子选自罗丹明、花青素、香豆素
或中BODIPY的一种。
3.一种喹唑啉荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在1-羟基苯并三唑的有机溶剂存在的条件下，以式Ⅴ与式Ⅵ为原料，以4-二甲氨基吡啶为催化剂发生反应，获得式Ⅰ；
其中 ，所述式Ⅴ的化学式为 所述式Ⅵ的化学式为
R1选自H或Cl，R2选自荧光分子，n为2-8的整数。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述式Ⅴ的制备方法包括：
步骤1、在有机溶剂、联吡啶 和酸存在的条件下，以式Ⅱ与式Ⅲ为原料，以乙酸钯为催化剂发生反应，获得式Ⅳ；
步骤2、在有机溶剂和存在的条件下，所述式Ⅳ、铵根NH4+与 发生反应，获得式Ⅴ；R1选自H或Cl，n为2-8的整数；
其中，所述式Ⅱ的化学式为 所述式Ⅲ的化学式为 所
述式Ⅳ的化学式为
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述荧光分子选自
中的一种。
6.权利要求1或2所述的喹唑啉荧光探针或权利要求3-5任意一项所述的制备方法制得的喹唑啉荧光探针在细胞中检测TSPO的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1或2所述的喹唑啉荧光探针或权利要求3-5任意一项所述的制备方法制得的喹唑啉荧光探针与待测细胞溶液混合反应，检测得到反应产物的发光强度；
根据预定的标准曲线和所述反应产物的发光强度，得到待测细胞溶液中的TSPO含量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述喹唑啉荧光探针的检测浓度为1μM-5μ
4 4
M；所述待测细胞溶液的待测细胞密度为5×10/ml-50×10/ml。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述喹唑啉荧光探针的发射波长范围为
650-690nm；所述喹唑啉荧光探针的吸收波长范围为580-630nm。
10.权利要求1或2所述的喹唑啉荧光探针或权利要求3-5任意一项所述的制备方法制得的喹唑啉荧光探针在制备检测细胞中TSPO试剂盒中的应用。
一种喹唑啉荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 研究表明，神经炎症贯穿神经退行性疾病的整个发病过程，在正常的生理状态下，神经炎症有助于神经系统损伤的修复，而当炎症反应过度时则会造成细胞的损伤，加速神经退行性疾病的恶化。脑内神经炎症和中枢神经系统退行性疾病密切相关。
[0003] 线粒体18kDa转位分子蛋白(TSPO)即外周型苯二氮卓受体转运蛋白，是分子量为18kDa的疏水蛋白，广泛分布于外周组织的线粒体外膜，参与体内大量的生理过程，如类固醇产生、线粒体呼吸、免疫调节、卟啉转运、血红素生物合成及细胞的增殖、调亡等。TSPO在正常脑组织中表达水平很低，仅在脉络丛、室管膜及嗅球神经元有少量表达，目前认为TSP0在中枢神经系统中的主要作用是合成类固醇、运输氨基酸、调控线粒体膜电位。当神经炎症发生时，小胶质细胞异常活化，TSPO表达明显増加以参与神经炎症反应，TSP0是反映小胶质细胞激活敏感的生物指标。
[0004] 现有的TSPO探针以核素探针为主，荧光探针较少，近红外荧光探针尚未见过报道。核素成像能通过分子和细胞的变化检测到疾病，如肿瘤在导致组织结构变化之前就可通过核素成像被检测到，但是也存在空间分辨率较低，结构信息不足，价格昂贵难以普及等问题。而荧光探针荧光探针成像的空间分辨率要比核素成像的分辨率高，能很好的解决这些问题，但是生物体内生物体内自发荧光集中在300-600nm，达到650nm的自发荧光很少，而一般的荧光探针的发射波长在300-650nm，因此，生物体内的自发荧光背景干扰较大，严重影响检测效果。
发明内容
发明内容
[0005] 有鉴于此，本申请提供了一种喹唑啉荧光探针及其制备方法和应用，能排除生物体自发荧光的干扰，高效的、准确的在生物体中检测TSPO含量。
[0006] 本申请提供了一种喹唑啉荧光探针，其化学式如式Ⅰ所示，
[0007]
[0008] 其中，R1选自H或Cl；R2选自荧光分子；n为2-8的整数。
[0009] 需要说明的是，荧光分子可以为现有常规的荧光分子。
[0010] 作为优选，所述荧光分子选自罗丹明、花青素、香豆素或中BODIPY中的一种。
[0011] 其中，所述荧光分子与氨基化合物反应，使得所述荧光分子连上氨基，然后通过酰化作用使得荧光分子与 连接。
[0012] 具体的，式Ⅰ与R2连接后的结构式分别如下：
[0013]n为2-8的整数。
[0014] 本申请公开了一种喹唑啉荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0016] 其中，所述式V的化学式为 所述式Ⅵ的化学式为R1选自H或Cl，R2选自荧光分子，n为2-8的整数。
[0017] 需要说明的是，所述式Ⅵ的制备方法包括：在强碱和乙二醇单甲醚存在的条件下，将荧光分子通过卤素与氨基反应，使得荧光分子接上胺链，得到式Ⅵ；或，在HOBT、DMAP和DMF存在的条件下，将荧光分子通过羧基与氨基反应，使得荧光分子接上胺链，得到式Ⅵ。
[0018] 作为优选，所述式V的制备方法包括：
[0019] 步骤1、在有机溶剂、联吡啶 和酸存在的条件下，以式Ⅱ与式III为原料，以乙酸钯为催化剂发生反应，获得式Ⅳ；
[0020] 步骤2、在有机溶剂存在的条件下，所述式Ⅳ、 和铵根NH4+发生反应，获得式V；R1选自H或Cl，n为2-8的整数；
[0021] 其中 ，所述式Ⅱ的化学式为 所述式III的化学式为所述式Ⅳ的化学式为
[0022] 具体的，步骤1的有机溶剂为THF；步骤1的酸为MsOH；步骤2的有机溶剂为无水乙醇。
[0023] 作为优选，所述荧光分子选自罗丹明、花青素、香豆素或中BODIPY的一种。
[0024] 本申请公开了所述喹唑啉荧光探针或所述制备方法制得的喹唑啉荧光探针在细胞中检测TSPO的应用。
[0025] 作为优选，包括以下步骤：
[0026] 将所述的喹唑啉荧光探针或所述的制备方法制得的喹唑啉荧光探针与待测细胞溶液混合反应，检测得到反应产物的发光强度；
[0027] 根据预定的标准曲线和所述反应产物的发光强度，得到待测细胞溶液中的TSPO含量。
[0028] 作为优选，所述喹唑啉荧光探针的检测浓度为1μM-5μM；所述待测细胞溶液的待测细胞密度为5×104/ml-50×104/ml。
[0029] 更为优选，所述喹唑啉荧光探针的检测浓度为5μM；所述待测细胞溶液的待测细胞密度为25×104/ml。
[0030] 作为优选，所述喹唑啉荧光探针的发射波长范围为650-690nm；所述喹唑啉荧光探针的吸收波长范围为580-630nm。
[0031] 更为优选，所述喹唑啉荧光探针的发射波长范围为680nm；所述喹唑啉荧光探针的吸收波长范围为610nm。
[0032] 具体的，所述喹唑啉荧光探针的吸光度范围为0.5-1.1，所述喹唑啉荧光探针的发射光强度范围为40000-45000。
[0034] 本申请的喹唑啉荧光探针能特异性地与TSPO结合，具有良好的亲和力，实验数据说明，本申请的喹唑啉荧光探针对细胞毒性较小，可用于细胞成像或活体成像，喹唑啉荧光探针能特异性地与TSPO结合后的荧光信号相应与TSPO含量在一定范围内呈线性关系，且本申请的喹唑啉荧光探针的发射波长的范围为650-690nm，达到近红外范围，生物体内生物体内自发荧光集中在300-600nm，达到650nm的自发荧光很少，因此，本申请的喹唑啉荧光探针能避免生物体的自发荧光干扰，更适合用于生物体的活体成像，有极其重要的应用价值。附图说明
[0036] 图1为本申请提供的喹唑啉荧光探针的化学式；
[0037] 图2为本申请提供的喹唑啉荧光探针的合成路线图；
[0038] 图3为本申请实施例的产物1在不同溶剂中的吸收光谱图；
[0039] 图4为本申请实施例的产物1在不同溶剂中的发射光谱图；
[0040] 图5为本申请实施例的产物1对细胞的MTT实验结果；
[0041] 图6为本申请实施例提供的细胞中TSPO的光学信号响应与产物1含量的关系图；
[0042] 图7为本申请的Mito-Tracker Green的波长下的细胞染色结果图；
[0043] 图8为本申请实施例1提供的产物1的波长下的细胞染色结果图；
[0044] 图9为图7和图8合并后的结果图；
[0045] 图10为本申请实施例提供的产物1与TSPO特异性配体PK11195的竞争性结果。
具体实施方式
[0047] 下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0048] 其中，请参阅图2，图2为本申请提供的喹唑啉荧光探针的合成路线图。根据文献报告的合成方法(Palladium-catalyzed direct addition of arylboronic acids to 2-aminobenzonitrile derivatives:synthesis,biological evaluation and in silico analysis of 2-aminobenzophenones,7-benzoyl-2-oxoindolines,and7-benzoylindoles.Org.Biomol.Chem.12.41(2014):8204-8211.)，(Milite,Ciro,et al.Exploiting the 4-Phenylquinazoline Scaffold for the Development of High Affinity Fluorescent Probes for the Translocator Protein(TSPO).Journal of Medicinal Chemistry(2017):acs.jmedchem.7b01031.)合成式V的化合物，通过含不同碳原子数目的胺链将式V的化合物与荧光分子R2连接起来，得到本申请的喹唑啉荧光探针。
[0049] 实施例1
[0050] 本申请实施例提供喹唑啉荧光探的合成方法，具体步骤如下：
[0051] 按照反应物1的合成路线 合成反应物1：
[0052] 将4.3g，31.35mmol的 (N,N-二甲基间氨基酚)加入到25ml浓盐酸和10ml水的混合溶液中，使温度保持在-5℃，并缓慢加入20ml亚硝酸钠(2.18g,31.60mmol)水溶液，机械搅拌2h，静置，抽滤得棕黄色固体。将粗产品用50ml饱和醋酸钠溶液洗涤，得到深红色固体粉末的反应物1(4.20g,81％)，反应物1的结构式为
[0053] 按照反应物2的合成路线 合成反应物2：
[0054] 将4.12g,19.90mmol的 (α-溴萘)和4.65g,40.02mmol的(1，6-己二胺)加入到含有40ml乙二醇单甲醚(CH3OCH2CH2OH)溶
液的100ml圆底烧瓶中，然后加入CuI(190.00mg,1.00mmol)和CsCO3(3.00g,15.55mmol)作催化剂。混合物在125℃加热回流反应24h，待冷却至室温后，过滤得浅黄色滤液，减压蒸出溶剂，将粗产品柱色谱分离，得到黄色油状粘稠液体反应物2，反应物2的结构式为(2.50g,52％)。
液的100ml圆底烧瓶中，然后加入CuI(190.00mg,1.00mmol)和CsCO3(3.00g,15.55mmol)作催化剂。混合物在125℃加热回流反应24h，待冷却至室温后，过滤得浅黄色滤液，减压蒸出溶剂，将粗产品柱色谱分离，得到黄色油状粘稠液体反应物2，反应物2的结构式为(2.50g,52％)。
[0055] 按照反应物3的合成路线合成反应物3，合成路线如下所示：
[0056]
[0057] 将反应物1(528.4mg,3.18mmol)和反应物2(770.00mg,3.18mmol)加入到20ml无水乙醇溶液中，于冰浴条件下滴加1ml浓盐酸，揽拌10min后撤除冰浴。混合物在90℃回流反应2.5h，待反应结束后蒸出溶剂，然后在乙醇中重结晶，粗产品经色谱柱分离得到蓝紫色固体粉末的反应物3，反应物3的结构式为 (441.00mg,49％)。
[0058] 按照 的合成路线合成 合成路线如下所示：
[0059]
[0060] 在四氢呋喃THF、联吡啶 和甲磺酸MsOH的条件下，以为原料，以乙酸钯为催化剂发生反应，获得
将 和铵根NH4+存在的条件下反应，获得
将 和铵根NH4+存在的条件下反应，获得
[0061] 按照产物1的合成路线
[0062] 合成产物1：
[0063] 将 (61.68mg,0.246mmol)、(80mg,0.205mmol)、1-羟基苯并三唑HOBT(41.63mg,0.308mmol)、二氯乙烷EDC(58.95mg,
0.308mmol)、4-二甲氨基吡啶DMAP(27.59mg,0.226mmol)一起加入到10ml无水N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，室温反应24h，蒸出溶剂，柱层析提纯，得到蓝紫色金属光泽固体产物1(21.00mg,17％)。
0.308mmol)、4-二甲氨基吡啶DMAP(27.59mg,0.226mmol)一起加入到10ml无水N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，室温反应24h，蒸出溶剂，柱层析提纯，得到蓝紫色金属光泽固体产物1(21.00mg,17％)。
[0064] 对产物1进行核磁氢谱检测，核磁氢谱说明本申请实施例成功制备化合物。
[0065] 按照上述类似方法，即在强碱和乙二醇单甲醚存在的条件下，将荧光分子通过卤素与氨基反应，使得荧光分子接上胺链，或在HOBT、DMAP和DMF存在的条件下，将荧光分子通过羧基与氨基反应，使得荧光分子接上胺链，制得
[0066] 实施例2
[0067] 本申请实施例将产物1进行光谱测定，具体步骤如下：
[0068] 将实施例1制得的产物1配成不同的浓度(分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM和0μM)分别溶解在乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、甲醇、乙腈、1,4-二氧己环、水或DMEM中，用酶标仪全波长扫描吸收光谱，找出最大吸收波长，再用最大吸收波长做激发波长，测得最大发射波长，结果如图3-4所示，图3为本申请实施例的产物1在不同溶剂中的吸收光谱图，图4为本申请实施例的产物1在不同溶剂中的发射光谱图，可见，产物1的最大发射均到达近红外区域。图4说明，200uM的产物1分别溶解在水和DMEM时，产物1的最大发射波长为680nm，产物1溶解在水的最大发射强度达到1400000，产物1溶解在DMEM的最大发射达到800000。
[0069] 实施例3
[0070] 本申请实施例将产物1进行细胞毒性实验，具体步骤如下：
[0071] 本实验选用噻唑蓝MTT法，以细胞的存活率来评估产物1对细胞的毒性大小。将BV24
细胞以5×10 /ml的密度种于96孔板，每孔添加细胞溶液为100μL，24h后，细胞贴壁，吸走上清液，将产物1溶解在DMEM中，浓度分为200μM、100μM、50μM、25μM、5μM和3μM孵育，每孔添加产物1的DMEM溶液100μL，24h后，吸走上清液，加入MTT溶液(500μg/ml)100μL每孔，继续孵育
4h后，在酶标仪上测570nm处的OD值。细胞存活率＝(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)。结果如图5所示，图5为本申请实施例的产物1对细胞的MTT实验结果，从图5可知，产物1的浓度为3μM-10μM对细胞抑制作用较低。
细胞以5×10 /ml的密度种于96孔板，每孔添加细胞溶液为100μL，24h后，细胞贴壁，吸走上清液，将产物1溶解在DMEM中，浓度分为200μM、100μM、50μM、25μM、5μM和3μM孵育，每孔添加产物1的DMEM溶液100μL，24h后，吸走上清液，加入MTT溶液(500μg/ml)100μL每孔，继续孵育
4h后，在酶标仪上测570nm处的OD值。细胞存活率＝(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)。结果如图5所示，图5为本申请实施例的产物1对细胞的MTT实验结果，从图5可知，产物1的浓度为3μM-10μM对细胞抑制作用较低。
[0072] 实施例4
[0073] 本申请实施例为产物1与细胞浓度关系实验，具体步骤如下：
[0074] 将U87细胞以3×105/ml的密度种于6孔板，每孔3ml，孵育24h，吸走上清液，每孔加入200μL细胞裂解液，再加入含5μM的产物1的DMEM，梯度稀释，保持产物1的浓度为5μM不变，梯度稀释细胞浓度，得到产物1与细胞的混合液，对产物1与细胞的混合液测最大吸收波长和发射波长处的OD值。以横坐标为细胞浓度，纵坐标为产物1与细胞的混合液的OD值，结果如图6所示，图6为本申请实施例6提供的细胞中TSPO的光学信号响应与产物1含量的关系图，图6说明了本申请的喹唑啉荧光探针与不同细胞密度具有良好的线性关系。
[0075] 实施例5
[0076] 本申请实施例的产物1与线粒体染料共定位实验，具体步骤如下：
[0077] 将实施例1制得的产物1与DMEM混合制成5μM的产物1溶液。线粒体染料为Mito-Tracker Green，将其配制成100nM的线粒体染料溶液；将U87细胞以10万/孔的密度种于六孔板，贴壁后同时加入产物1溶液和线粒体染料溶液，共孵育24h，荧光倒置显微镜成像。结果如图7-9所示，图7为本申请的Mito-Tracker Green的波长下的细胞染色结果图；图8为本申请实施例1提供的产物1的波长下的细胞染色结果图；图9为图7和图8合并后的结果图。从图7-9可见，TSPO定位于线粒体外膜，先用线粒体染料Mito-Tracker Green和本申请实施例1的产物1共定位，表明产物1定位于线粒体，产物1和线粒体染料定位基本一致。
[0078] 实施例6
[0079] 本申请实施例的产物1与TSPO特异性配体PK11195的竞争性实验，具体步骤如下：
[0080] 将BV2细胞以50万/ml的密度种于96孔板，每孔100μL，细胞贴壁后，加入100ng/ml的LPS诱导24h后，同时加入产物1和不同浓度的TSPO特异性配体PK11195(PK11195的浓度分别为0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM)，然后，使用酶标仪测产物1的吸光度的变化，结果如图10所示，图10为本申请实施例提供的产物1与TSPO特异性配体PK11195的竞争性结果。图10可知，产物1的吸光度随着PK11195用量的增加而减弱，PK11195拮抗产物1和TSPO的结合，因此，表明产物1结合位点是TSPO。
[0081] 以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
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