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一种 磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用

阅读：836发布：2021-06-15

专利汇可以提供一种磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用，所述磁性纳米药物复合体包括四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体、所述聚吡咯纳米载体表面携载的药物DAPT以及携载药物DAPT的聚吡咯纳米载体表面吸附的透明质酸。本发明的磁性纳米药物复合体对DAPT药物载药量大，稳定性好，并且其粒径小，具有良好的穿透性且粒径均一，磁热控释效果明显，在体内具有长循环效果，没有明显的细胞毒性，长期毒性较低，生物相容性良好，对肿瘤干细胞具有明显的杀伤效果，特别是结合磁热治疗，效果更佳明显，并且其制备方法简单，条件温和，成本较低，易于推广和应用。，下面是一种磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种磁性纳米药物复合体，其特征在于，所述磁性纳米药物复合体包括四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体、所述聚吡咯纳米载体表面携载的药物DAPT以及携载药物DAPT的聚吡咯纳米载体表面吸附的透明质酸；所述磁性纳米药物复合体的粒径为60～
150nm；所述磁性纳米药物复合体的水合粒径为100～300nm；所述磁性纳米药物复合体中铁原子与聚吡咯的质量比为(52～92):100。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米药物复合体，其特征在于，所述四氧化三铁纳米粒子为壳聚糖季铵盐包裹四氧化三铁形成的纳米粒子，所述壳聚糖季铵盐具有式(I)所述结构：
其中n为17～290的整数。
3.根据权利要求1或2所述的磁性纳米药物复合体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备四氧化三铁纳米粒子，将四氧化三铁纳米粒子分散在分散溶液中，得到反应体系A；
(2)向反应体系A中加入吡咯单体，得到稳定的反应体系B；
(3)向反应体系B中加入氧化剂溶液，在冰浴中搅拌反应，磁倾析并洗涤得到四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体；
(4)将DAPT溶液与四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米粒子混合，搅拌过夜，离心并洗涤，得到携载药物DAPT的纳米粒子；
(5)将步骤(4)得到的携载药物DAPT的纳米粒子加入至透明质酸溶液中，离心并洗涤得到所述磁性纳米药物复合体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
①将壳聚糖季铵盐溶于去离子水，通入保护性气体，升温后，保温得到反应体系a；
②将三价铁盐和二价铁盐溶于强酸溶液中，得溶液b；
③将溶液b注入反应体系a中，调节pH至碱性，回流得到反应体系c；
④冷却反应体系c至室温，透析后得到所述四氧化三铁纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤①所述反应体系a中壳聚糖季铵盐的浓度为30～50g/L。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤①所述保护性气体为氮气和/或氩气。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤①所述保护性气体为氮气。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤①中持续通入保护性气体20～
40min。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤①所述保温温度为90～110℃。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤②所述三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2:(1～2)。
11.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤②所述三价铁盐为FeCl3·6H2O，步骤②所述二价铁盐为FeCl2·4H2O。
12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤②所述强酸溶液中，强酸的浓度为0.8～2moL/L。
13.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，相对于100mg三价铁盐，步骤②所述强酸溶液的用量为1-4mL。
14.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤③中所述调节pH所用试剂为氨水。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述氨水的质量分数为25～28％。
16.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤③中所述调节pH至碱性为调节pH至8～11。
17.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤③所述回流的时间为20～
60min。
18.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤④所述透析为用去离子水进行透析。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述透析的温度为20～35℃。
20.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分散溶液为聚乙烯醇溶液。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇溶液的质量体积浓度为1～4％。
22.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述吡咯单体与步骤(1)中所述四氧化三铁纳米粒子中四氧化三铁的质量比为1:(0.4～1.3)。
23.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述向反应体系A中加入吡咯单体后进行超声并搅拌，得到稳定的反应体系B。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述超声为水浴超声，所述超声的时间为10～50min。
25.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的时间为10～50min。
26.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述超声和搅拌在室温下进行。
27.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述氧化剂与步骤(2)所述吡咯单体的质量比为(5～10):1。
28.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述氧化剂为三氯化铁、过硫酸铵或碘中的任意一种或至少两种的组合。
29.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述反应的时间为4～12h。
30.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述洗涤利用50～70℃去离子水进行。
31.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述洗涤进行1～3次。
32.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述DAPT溶液的浓度为7～
10mg/mL。
33.根据权利要求32所述的制备方法，其特征在于，所述DAPT溶液为DAPT的甲醇溶液。
34.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述离心的转速为10000～
15000rpm。
35.根据权利要求34所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述离心的时间为10～
30min。
36.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述洗涤利用25℃的去离子水进行。
37.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述透明质酸溶液的浓度为
2～5mg/mL。
38.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述将携载药物DAPT的纳米粒子加入至透明质酸溶液中的方式为滴加。
39.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述将携载药物DAPT的纳米粒子加入至透明质酸溶液中是在超声下进行的。
40.根据权利要求39所述的制备方法，其特征在于，所述超声为探头超声，所述超声功率为45～180 W，所述超声时间为3～15min。
41.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述离心的转速为10000～
15000rpm。
42.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述离心的时间为10～
30min。
43.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述洗涤利用25℃的去离子水进行，所述洗涤进行3-5次。
44.根据权利要求1或2所述的磁性纳米药物复合体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

说明书全文

一种磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米药物技术领域，涉及一种磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] DAPT((2S)-N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-2-苯基甘氨酸叔丁酯)作为一种新型的抗肿瘤药物，受到了广泛的关注。DAPT(GSI-IX)分子式为C23H26F2N2O4，分子量为432.46，是一种γ-分泌酶的抑制剂，它能选择性的抑制γ-分泌酶的功能，特异性的阻断Notch通路，从而达到肿瘤治疗的目的。最新的一些研究表明，DAPT阻断Notch通路能够减少肿瘤细胞中肿瘤干细胞的比例，从而达到肿瘤治疗的目的，因此DAPT也常常被用作肿瘤干细胞特异性的抑制剂。但是由于DAPT药物分子水溶性差，缺乏特异性的靶向，所以在应用中受到了很大的限制。

[0003] 纳米载药系统作为一种新型的控释系统，特别是它能改善传统药物水溶性、生物分布、特异靶向等性状正被广泛研究。利用纳米载体来改善DAPT的水溶性及靶向性的问题越来越受到关注。已经有科学家成功利用透明质酸来载带DAPT实现靶向治疗，Heo,R.等人(Hyaluronan Nanoparticles Bearing Gamma-Secretase Inhibitor:In Vivo Therapeutic Effects on Rheumatoid Arthritis.Journal of Controlled Release
2014,192,295-300.)以及Boecking,D等人(Mesoporous Silica Nanoparticle-Based Substrates for Cell Directed Delivery of Notch Signalling Modulators to
Control Myoblast Differentiation.Nanoscale 2014,6,1490-1498.)指出利用介孔硅纳米材料改善DAPT的水溶性。但是单一纳米载体很难实现多种缺陷同时克服，为此复合纳米载药体系有待于进一步开发。

[0004] Fe3O4纳米材料由于其具有超顺磁的特性，在生物医疗和生物分离等领域有着广泛的应用。在交变磁场存在的条件下，Fe3O4磁性纳米粒子由于磁矢量旋转和颗粒本身的物理旋转而产生热量，能够使癌变组织升温，达到杀灭癌细胞的效果，故临床上已经开始探索利用Fe3O4纳米材料介导的磁热治疗作为消除恶性肿瘤的一种治疗手段。并且由于磁场几乎没有阻碍的穿透性，磁场强度及施加位置可控，磁热治疗在肿瘤局部靶向以及治疗组织深处的病灶具有明显的优势。

[0005] 聚吡咯(PPr)是一种导电聚合物，聚吡咯具有独特的氧化还原性，离子交换性能，较高的表面自由能，良好的稳定性和生物相容性，因此，聚吡咯可用作药物控制释放载体。特别是聚吡咯材料在近红外区域对光有较强的吸收，已经被开发用作光热治疗和光声成像试剂。同时由于聚吡咯容易合成，能够与其它材料掺杂，形成复合纳米材料，因此聚吡咯纳米材料广泛用于复合纳米载药体系。

[0006] 透明质酸(HA)是一种具有良好水溶性的天然高分子，大量存在于脊椎动物和细菌中，如人关节组织的细胞外基质，关节滑液，皮肤真皮及眼睛的玻璃体内等。HA也是一种线性多聚糖分子，单体是由糖苷键链接(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰-D-葡糖胺构成的二糖单元；根据二糖单元的数目不同，相对分子量基本在1×105～5×106Da之间。而不同分子量的HA在生物体内有着不同的功能，如当相对分子量大于2×106时，HA具有很好的黏弹性、抑制炎性反应和润滑等功能；相对分子质量为(1～2)×106时，具有良好的保湿性和延缓药物释放作用；而分子量小于8×104时，具有抗肿瘤、促进血管生成和免疫调节等作用，可以用于肿瘤靶向治疗、促进血管修复与生成以及用于机体创伤修复。

[0007] CN103289400A公开了一种四氧化三铁/聚吡咯复合材料，其由四氧化三铁和聚吡咯组成，其中四氧化三铁/聚吡咯复合材料中Fe3O4粒子的粒径分布在5-30nm，四氧化三铁/聚吡咯复合材料的饱和磁化强度为30-70emu/g，电导率为5-20S/cm，然而该发明仅侧重于四氧化三铁/聚吡咯复合材料的磁性和导电性能。

[0008] 因此，在本领域中，期望得到一种能够将磁热治疗和药物治疗结合在一起的载药体系。

发明内容

[0009] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用。

[0010] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0011] 一方面，本发明提供一种磁性纳米药物复合体，所述磁性纳米药物复合体包括四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体、所述聚吡咯纳米载体表面携载的药物DAPT以及携载药物DAPT的聚吡咯纳米载体表面吸附的透明质酸(可以简单表示为Fe3O4@PPr@DAPT@HA)。

[0012] 在本发明中，利用四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米粒子作为药物载体并结合药物DAPT和透明质酸，一方面可以克服由于药物水溶性差难以到达靶标部位的缺陷，增加药物在体内循环的稳定性，具有长循环效果，且长期毒性较低；另一方面本发明的磁性纳米药物复合体使得药物具有缓释作用，并且能够靶向至肿瘤部位，在肿瘤的治疗中能够发挥药物治疗和磁热治疗相结合的治疗效果，增强对肿瘤的杀伤效果。

[0013] 优选地，所述四氧化三铁纳米粒子为壳聚糖季铵盐包裹四氧化三铁形成的纳米粒子，所述壳聚糖季铵盐具有式(I)所述结构：

[0014]

[0015] 其中n为17～290的整数，n的取值示例性的可以是32、33、34、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、
280、290、300、310或320等，若壳聚糖季铵盐的分子量过小，即聚合程度较低时，会降低溶液的黏度，不能起到阻隔四氧化三铁晶体生长的作用，不能制备出合适的四氧化三铁纳米粒子；若壳聚糖季铵盐的分子量过大，尤其是聚合单元n＞320时，由于过强的正电荷将使其在生理环境中不稳定，还会造成粘稠度过大，影响最终磁性纳米药物复合体的磁热效应；也会由于壳聚糖季铵盐的分子量过大或过小而影响本发明的磁性纳米药物复合体的粒径均一性。

[0016] 优选地，本发明所述磁性纳米药物复合体的粒径为60～150nm，例如60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。如果粒径大于150nm，纳米药物复合体的稳定性将会下降；如果粒径小于60nm，纳米药物复合体的载药量将会降低。

[0017] 优选地，所述磁性纳米药物复合体的水合粒径为100～300nm，例如100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、230nm、250nm、280nm或300nm。如果水合粒径大于300nm，纳米药物复合体的稳定性将会下降；如果粒径小于100nm，纳米药物复合体的载药量将会降低。

[0018] 优选地，所述磁性纳米药物复合体中铁原子与聚吡咯的质量比为(52～92):100，例如52:100、55:100、58:100、60:100、65:100、68:100、70:100、73:100、75:100、78:100、80:100、84:100、88:100、90:100或92:100。限定二者的质量比是为了保证纳米药物复合体同时具有较高的载药量和较好的磁热效果。如果铁原子比例过高(即四氧化三铁比例过高)，将会使纳米药物复合体的载药量下降。反之，如果聚吡咯比例过高，则将会影响纳米药物复合体的磁热效果。

[0019] 第二方面，本发明提供了如第一方面所述的磁性纳米药物复合体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

[0020] (1)制备四氧化三铁纳米粒子，将四氧化三铁纳米粒子分散在分散溶液中，得到反应体系A；

[0021] (2)向反应体系A中加入吡咯单体，得到稳定的反应体系B；

[0022] (3)向反应体系B中加入氧化剂溶液，在冰浴中搅拌反应，磁倾析并洗涤得到四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体；

[0023] (4)将DAPT溶液与四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米粒子混合，搅拌过夜，离心并洗涤，得到携载药物DAPT的纳米粒子；

[0024] (5)将步骤(4)得到的携载药物DAPT的纳米粒子加入至透明质酸溶液中，离心并洗涤得到所述磁性纳米药物复合体。

[0025] 在本发明所述制备方法中，所述四氧化三铁纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

[0026] ①将壳聚糖季铵盐溶于去离子水，通入保护性气体，升温后，保温得到反应体系a；

[0027] ②将三价铁盐和二价铁盐溶于强酸溶液中，得溶液b；

[0028] ③将溶液b注入反应体系a中，调节pH至碱性，回流得到反应体系c；

[0029] ④冷却反应体系c至室温，透析后得到所述四氧化三铁纳米粒子。

[0030] 优选地，步骤①所述反应体系a中壳聚糖季铵盐的浓度为30～50g/L，例如可以为30g/L、35g/L、40g/L、45g/L或50g/L等。

[0031] 优选地，步骤①所述保护性气体优选氮气和/或氩气，优选氮气。

[0032] 优选地，步骤①中持续通入保护性气体20～40min，例如23min、25min、28min、30min、33min、35min、38min或40min。

[0033] 优选地，步骤①所述保温温度优选为90～110℃，例如可以是90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃、102℃、104℃、106℃、108℃或110℃等。合适的温度范围内能得到粒径均一的四氧化三铁纳米颗粒，否则会造成粒径不均一，影响最终磁性纳米药物复合体的稳定性及其性能的发挥。

[0034] 优选地，步骤②所述三价铁盐与二价铁盐的摩尔比为2:(1～2)，例如2:1、2:1.1、2:1.2、2:1.3、2:1.4、2:1.5、2:1.6、2:1.7、2:1.8、2:1.9或2:2。

[0035] 优选地，步骤②所述三价铁盐为FeCl3·6H2O，二价铁盐为FeCl2·4H2O。

[0036] 优选地，步骤②所述强酸溶液中，强酸的浓度为0.8～2moL/L，例如0.8moL/L、0.9moL/L、1moL/L、1.1moL/L、1.2moL/L、1.5moL/L、1.8moL/L或2moL/L。

[0037] 优选地，相对于100mg三价铁盐，步骤②所述强酸溶液的用量为1-4mL，例如1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL或5mL。

[0038] 优选地，步骤③中所述调节pH所用试剂为氨水，进一步优选质量分数为25～28％的氨水，例如25％、26％、27％或28％。

[0039] 优选地，步骤③中所述调节pH至碱性为调节pH至8～11，例如可以是8、8.3、8.5、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、9.9、10、10.5或11等。

[0040] 优选地，步骤③所述回流的时间为20～60min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等。

[0041] 优选地，步骤④所述透析为用去离子水进行透析。

[0042] 优选地，所述透析的温度为20～35℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃或35℃等；所述透析的时间为12-72h，例如可以是12h、15h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、40h、44h、48h、50h、55h、58h、64h或72h。

[0043] 优选地，步骤(1)所述分散溶液为聚乙烯醇溶液。

[0044] 优选地，所述聚乙烯醇溶液的质量体积浓度为1～4％，例如1％、1.3％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.3％、3.5％、3.8％或4％。所述浓度即为反应时所加入的聚乙烯醇的浓度，浓度过大或过小会造成最终形成的纳米药物复合体的粒径过大或过小，从而影响其稳定性、载药量以及磁热效果。

[0045] 优选地，步骤(2)中所述吡咯单体与步骤(1)中所述四氧化三铁纳米粒子中四氧化三铁的质量比为1:(0.4～1.3)，例如1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2或1:1.3；如果四氧化三铁比例过高，将会使纳米药物复合体的载药量下降。反之，如果四氧化三铁比例过低，则将会影响纳米药物复合体的磁热效果。

[0046] 优选地，步骤(2)所述向反应体系A中加入吡咯单体后进行超声并搅拌，得到稳定的反应体系B。

[0047] 优选地，所述超声为水浴超声，所述超声的时间为10～50min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min。

[0048] 优选地，所述搅拌的时间为10～50min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min。

[0049] 优选地，所述超声和搅拌在室温下进行。

[0050] 优选地，步骤(3)所述氧化剂与步骤(2)所述吡咯单体的质量比为(5～10):1，例如5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。如果氧化剂的比例过低，将使吡咯聚合不完全。

[0051] 优选地，步骤(3)所述氧化剂为三氯化铁、过硫酸铵或碘中的任意一种或至少两种的组合。

[0052] 优选地，步骤(3)所述反应的时间为4～12h，例如5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、10h、11h或12h。

[0053] 优选地，步骤(3)所述洗涤利用50～70℃去离子水进行，例如50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃或70℃的去离子水。使用50～70℃的热水进行洗涤可以去除多余的聚乙烯醇和其他试剂。

[0054] 优选地，步骤(3)所述洗涤进行1～3次。

[0055] 优选地，步骤(3)经过洗涤得到四氧化三铁掺杂的聚吡咯纳米粒子后，用去离子水复溶，保存于4℃。复溶后保存在4℃可使纳米粒子免于染菌，保存时间更长。

[0056] 优选地，步骤(4)所述DAPT溶液的浓度为7～10mg/mL，例如7mg/mL、7.3mg/mL、7.5mg/mL、7.8mg/mL、8mg/mL、8.5mg/mL、8.8mg/mL、9mg/mL、9.3mg/mL、9.5mg/mL、9.8mg/mL或10mg/mL。如果DAPT的浓度过高，将会使纳米药物复合体的包封率过低，造成药物浪费，而如果DAPT浓度过低，将会使纳米药物复合体的载药量过低，使材料无法发挥最大功效。

[0057] 优选地，所述DAPT溶液为DAPT的甲醇溶液。

[0058] 优选地，步骤(4)所述离心的转速为10000～15000rpm，例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm，优选12000rpm。

[0059] 优选地，步骤(4)所述离心的时间为10～30min，例如10min、13min、15min、18min、20min、23min、25min、28min或30min。

[0060] 优选地，步骤(4)所述洗涤利用25℃的去离子水进行，目的是去除没有被装载的药物。

[0061] 优选地，步骤(5)所述透明质酸溶液的浓度为2～5mg/mL，例如2.3mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或4.8mg/mL。如果透明质酸浓度太低，将不能起到很好的分散效果，而如果透明质酸浓度太高，将使后续的离心纯化麻烦。

[0062] 优选地，步骤(5)所述将携载药物DAPT的纳米粒子加入至透明质酸溶液中的方式为滴加。

[0063] 优选地，步骤(5)所述将携载药物DAPT的纳米粒子加入至透明质酸溶液中是在超声下进行的。

[0064] 优选地，所述超声为探头超声，功率为45～180W，例如可以是45W、50W、60W、70W、80W、90W、100W、110W、120W、135W、145W、160W、170W、或180W；超声时间为3～15min，例如可以是3min、5min、7min、9min、11min、13min或15min。如果超声功率太小，时间太短，纳米粒子分散不好。

[0065] 优选地，步骤(5)所述离心的转速为10000～15000rpm，例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm。

[0066] 优选地，步骤(5)所述离心的时间为10～30min，例如10min、13min、15min、18min、20min、23min、25min、28min或30min。

[0067] 优选地，步骤(5)所述洗涤利用25℃的去离子水进行，洗涤3-5次，目的是去除多余的透明质酸。

[0068] 优选地，将步骤(5)经过洗涤得到磁性纳米药物复合体后，用去离子水复溶，保存于4℃。复溶后保存在4℃可使磁性纳米药物复合体免于长菌，保存时间更长。

[0069] 在本发明中，吡咯单体在带正电荷的四氧化三铁纳米粒子存在的聚乙烯醇水溶液中均匀分散后，在氧化剂作用下进行原位聚合反应形成四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体(Fe3O4@PPr)，通过π-π相互作用，将DAPT药物负载到聚吡咯壳层的表面，实现药物的携载；而后利用Fe3O4@PPr纳米粒子表面的正电荷吸附透明质酸作为水溶性的稳定剂和靶向剂。本发明的磁性纳米药物复合体具有良好的稳定性，靶向性，对肿瘤干细胞具有明显的抑制作用。

[0070] 四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体吸附了透明质酸后，由于透明质酸带有羧基，因此使得整个纳米粒子表面电荷为负电荷。负电荷能够增加纳米粒子在血液中的稳定性，并具有长循环的效果。

[0071] 另一方面，本发明提供了如上所述的磁性纳米药物复合体在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明所述的磁性纳米药物复合体可用于肿瘤靶向治疗，并结合磁热治疗效果，使得治疗效果更佳。

[0072] 相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

[0073] 本发明的磁性纳米药物复合体对DAPT药物载药量大，稳定性好，并且其粒径小，具有良好的穿透性且粒径均一，易于纯化，粒子表面为负电荷，在血液中的稳定性，并具有长循环的效果。本发明的磁性纳米药物复合体的磁热控释效果明显，没有明显的细胞毒性，长期毒性较低，生物相容性良好，对肿瘤干细胞具有明显的杀伤效果，特别是结合磁热治疗，效果更佳明显。本发明磁性纳米药物复合体制备方法简单，条件温和，成本较低，易于推广和应用。附图说明

[0074] 图1为实施例1得到的磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA的透射电镜图，其中A图中标尺为0.5μm，B图中标尺为20nm。

[0075] 图2A为实施例1得到的四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体Fe3O4@PPr的水合粒径分布图。

[0076] 图2B为实施例1得到的磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA的水合粒径分布图。

[0077] 图3为实施例1得到的磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA的紫外-可见-近红外吸收光谱。

[0078] 图4为实施例1得到的磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA的磁化率随外加磁场的变化图。

[0079] 图5为实施例1得到的磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA在交变磁场下的升温曲线图。

[0080] 图6为实施例5中磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA的载药量和包封率随药物浓度变化的曲线图。

[0081] 图7为实施例5中磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA在模拟的生理溶液中的药物释放情况。

[0082] 图8为实施例5中磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA在交变磁场中药物的控释情况。

[0083] 图9为实施例6中磁性纳米药物复合体处理4T1乳腺癌细胞后，ALDH阳性的肿瘤干细胞比例变化情况。

[0084] 图10A为实施例6中磁性纳米药物复合体处理4T1乳腺癌细胞后，肿瘤干细胞的球囊形成后的形态图片；

[0085] 图10B为实施例6中磁性纳米药物复合体处理4T1乳腺癌细胞后，肿瘤干细胞的球囊离心消化后，球囊细胞的统计计数结果图。

具体实施方式

[0086] 下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

[0087] 以下实施例中测量粒径所用的仪器为动态光散射仪(Malvern,Zetasizer NanoZS)；观测粒子形态用透射电镜(FEI,Tecnai G2 20S-TWIN，200kV)；铁浓度采用电感耦合光谱测定(Perkin Elmer,PE8000)；材料的紫外吸收采用紫外分光光度计(Perkin Elmer,Lambda 850)；材料的升温能力使用高频电磁感应加热设备(Shuangping,SPG-10AB-II)和近红外成像仪(FLIR Systems Inc,TG165)测定；材料的饱和磁化率使用物性测量仪(Quantum Design,PPMS-9)测定；DAPT药物的载带以及释放使用高效液相色谱HPLC
(Waters,2796-2996)检测；细胞相关指标使用倒置显微镜(Olympus,IX71)和流式细胞仪(BD,FACSCalibur)测定。

[0088] 实施例1

[0089] 在本实施例中，磁性纳米药物复合体由以下方法制备，具体包括以下步骤：

[0090] (1)①将2g的分子量为100,000Da的式(I)所示壳聚糖季铵盐溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气30min，油浴升温至102℃，得到反应体系a；

[0091] ②取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.071g的FeCl2·4H2O溶于2mL浓度为1mol/L的盐酸溶液中，得到溶液b；

[0092] ③将溶液B注入到步骤(1)中的反应体系a，缓慢滴加浓氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流40min，得反应体系c；

[0093] ④等步骤(3)中的反应体系c冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到四氧化三铁纳米粒子；

[0094] ⑤将得到的四氧化三铁纳米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反应体系A；

[0095] (2)在反应体系A中加入5μL吡咯单体，先超声30min，再搅拌30min后得到反应体系B；

[0096] (3)在反应体系B中逐滴加入三氯化铁溶液(1mL，44.4mg/mL)，冰浴中搅拌反应4小时，磁倾析并用80℃去离子水洗涤三次得到四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体(Fe3O4@PPr)；

[0097] (4)将10mg/mL的DAPT甲醇溶液与Fe3O4@PPr纳米粒子混合，37℃搅拌过夜，12000rpm离心20min，并用去离子水洗涤三次得到携载药物DAPT的纳米粒子(Fe3O4@PPr@DAPT)；

[0098] (5)将15mg透明质酸溶于5ml去离子水中得到透明质酸溶液，在90W的超声功率下，将纳米粒子Fe3O4@PPr@DAPT溶液(1mL，2mg/mL)滴入透明质酸溶液中，12000rpm离心20min，并用去离子水洗涤三次得到所述磁性纳米药物复合体(Fe3O4@PPr@DAPT@HA)。

[0099] 通过透射电镜观察，利用本法制备的纳米药物复合体的粒子为球形，水合粒径的峰值为169nm左右，通过ICP-OES测得铁原子与聚吡咯的质量比为73:100(与投料相比，吡咯的量有所减少，是因为部分吡咯未结合四氧化三铁纳米粒子，密度比较小，离心时被去除)。

[0100] 取实施例1制备的纳米药物复合体进行形貌分析，观察所制备的纳米粒子Fe3O4@PPr@DAPT@HA的透射电镜图1A可以看出，纳米粒子为均一的球形，分散性良好。透射电镜图1B显示了四氧化三铁颗粒参杂聚吡咯的结构。

[0101] 随后，对实施例1制备的纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA的水合粒径分布进行测试，结果如图2所示。结果显示，纳米粒子Fe3O4@PPr的水合粒径的多分散指数较小，表示水合粒径分布均一，而纳米粒子表面的正电荷有利于下一步吸附透明质酸；图2B是纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA的水合粒径分布图，从图中可以看出纳米粒子粒径均一，而表面的负电荷则说明透明质酸被成功的吸附在纳米粒子表面。图3为实施例1制备的纳米粒子Fe3O4@PPr@DAPT@HA的吸收光谱，从图中可以看出纳米粒子在近红外区(700-900nm)是宽吸收。图4为实施例1制备的粒子的磁化率曲线，该图说明所合成的纳米药物复合体是超顺磁纳米粒子。图5为实施例1制备的纳米药物复合体在635kHz、30A交变磁场下的升温曲线图，可以看出，粒子在该交变磁场下，就有强的升温能力，最高温度超过60℃。

[0102] 实施例2

[0103] 在本实施例中，磁性纳米药物复合体由以下方法制备，具体包括以下步骤：

[0104] (1)①将2g的分子量为100,000Da的式(I)所示壳聚糖季铵盐溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气30min，油浴升温至102℃，得到反应体系a；

[0105] ②取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.071g的FeCl2·4H2O溶于2mL浓度为1mol/L的盐酸溶液中，得到溶液B；

[0106] ③将溶液b注入到步骤(1)中的反应体系a，缓慢滴加浓氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流40min，得反应体系c；

[0107] ④等步骤(3)中的反应体系c冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到四氧化三铁纳米粒子；

[0108] ⑤将得到的四氧化三铁纳米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反应体系A；

[0109] (2)在反应体系A中加入2.5μL吡咯单体，先超声30min，再搅拌30min后得到反应体系B；

[0110] (3)在反应体系B中逐滴加入三氯化铁溶液(1mL，36mg/mL)，冰浴中搅拌反应8小时，磁倾析并用80℃去离子水洗涤三次得到四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体(Fe3O4@PPr)；

[0111] (4)将10mg/mL的DAPT甲醇溶液与Fe3O4@PPr纳米粒子混合，37℃搅拌过夜，12000rpm离心20min，并用去离子水洗涤三次得到携载药物DAPT的纳米粒子(Fe3O4@PPr@DAPT)；

[0112] (5)将15mg透明质酸溶于5ml去离子水中得到透明质酸溶液，在120W的超声功率下，将纳米粒子Fe3O4@PPr@DAPT溶液(1mL，2mg/mL)滴入透明质酸溶液中，12000rpm离心20min，并用去离子水洗涤三次得到所述磁性纳米药物复合体(Fe3O4@PPr@DAPT@HA)。

[0113] 通过透射电镜观察，利用本法制备的纳米药物复合体的粒子为球形，水合粒径的峰值为150nm左右，通过ICP-OES测得铁原子与聚吡咯的质量比为85:100。

[0114] 实施例3

[0115] 在本实施例中，磁性纳米药物复合体由以下方法制备，具体包括以下步骤：

[0116] (1)①将1.5g的分子量为100,000Da的式(I)所示壳聚糖季铵盐溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气20min，油浴升温至110℃，得到反应体系a；

[0117] ②取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.1075g的FeCl2·4H2O溶于4mL浓度为1mol/L的盐酸溶液中，得到溶液b；

[0118] ③将溶液b注入到步骤(1)中的反应体系a，缓慢滴加浓氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流30min，得反应体系c；

[0119] ④等步骤(3)中的反应体系c冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析24h后，即可得到四氧化三铁纳米粒子；

[0120] ⑤将得到的四氧化三铁纳米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反应体系A；

[0121] (2)在反应体系A中加入2.7μL吡咯单体，先超声50min，再搅拌20min后得到反应体系B；

[0122] (3)在反应体系B中逐滴加入三氯化铁溶液(1mL，36mg/mL)，冰浴中搅拌反应8小时，磁倾析并用80℃去离子水洗涤三次得到四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体(Fe3O4@PPr)；

[0123] (4)将10mg/mL的DAPT甲醇溶液与Fe3O4@PPr纳米粒子混合，37℃搅拌过夜，12000rpm离心20min，并用去离子水洗涤三次得到携载药物DAPT的纳米粒子(Fe3O4@PPr@DAPT)；

[0124] (5)将10mg透明质酸溶于5ml去离子水中得到透明质酸溶液，在180W的超声功率下，将纳米粒子Fe3O4@PPr@DAPT溶液(1mL，2mg/mL)滴入透明质酸溶液中，15000rpm离心10min，并用去离子水洗涤三次得到所述磁性纳米药物复合体(Fe3O4@PPr@DAPT@HA)。

[0125] 通过透射电镜观察，利用本法制备的纳米药物复合体的粒子为球形，水合粒径的峰值为120nm左右，通过ICP-OES测得铁原子与聚吡咯的质量比为75:100。

[0126] 实施例4

[0127] 在本实施例中，磁性纳米药物复合体由以下方法制备，具体包括以下步骤：

[0128] (1)①将2.5g的分子量为100,000Da的式(I)所示壳聚糖季铵盐溶于50mL去离子水中，放置于三口烧瓶中，反应体系通氮气20min，油浴升温至90℃，得到反应体系a；

[0129] ②取0.1459g的FeCl3·6H2O与0.071g的FeCl2·4H2O溶于3mL浓度为1mol/L的盐酸溶液中，得到溶液b；

[0130] ③将溶液b注入到步骤(1)中的反应体系a，缓慢滴加浓氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流60min，得反应体系c；

[0131] ④等步骤(3)中的反应体系c冷却至室温后，将所有反应液移至透析袋中，用去离子水在20℃～35℃透析48h后，即可得到四氧化三铁纳米粒子；

[0132] ⑤将得到的四氧化三铁纳米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反应体系A；

[0133] (2)在反应体系A中加入3.7μL吡咯单体，先超声30min，再搅拌30min后得到反应体系B；

[0134] (3)在反应体系B中逐滴加入三氯化铁溶液(1mL，36mg/mL)，冰浴中搅拌反应8小时，磁倾析并用80℃去离子水洗涤三次得到四氧化三铁纳米粒子掺杂的聚吡咯纳米载体(Fe3O4@PPr)；

[0135] (4)将10mg/mL的DAPT甲醇溶液与Fe3O4@PPr纳米粒子混合，37℃搅拌过夜，12000rpm离心20min，并用去离子水洗涤三次得到携载药物DAPT的纳米粒子(Fe3O4@PPr@DAPT)；

[0136] (5)将15mg透明质酸溶于5ml去离子水中得到透明质酸溶液，在120W的超声功率下，将纳米粒子Fe3O4@PPr@DAPT溶液(1mL，2mg/mL)滴入透明质酸溶液中，12000rpm离心20min，并用去离子水洗涤三次得到所述磁性纳米药物复合体(Fe3O4@PPr@DAPT@HA)。

[0137] 通过透射电镜观察，利用本法制备的纳米药物复合体的粒子为球形，水合粒径的峰值为150nm左右，通过ICP-OES测得铁原子与聚吡咯的质量比为70:100。

[0138] 实施例5

[0139] 在本实施例中，考察磁性纳米药物复合体的载药以及药物释放情况：

[0140] 将DAPT含量不同的甲醇溶液(如DAPT含量为0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg和0.5mg)与Fe3O4@PPr纳米材料混合后，37℃反应过夜，12000rpm离心20min，去离子水洗涤三次后，收集上清液，使用高效液相色谱HPLC检测载药情况。从图6中可以看出，随着DAPT投入量的增大，纳米药物复合体的载药量逐渐增加但是包封率逐渐降低，这说明比较适合的投药量在0.3mg左右。

[0141] 纳米药物复合体在模拟生理条件下的药物释放实验中，使用pH＝7.0和pH＝5.0的PBS溶液，另外加入透明质酸酶，分别在1h、2h、4h、6h、12h和24h取样品，使用HPLC检测实施例1制备得到的磁性纳米药物复合体Fe3O4@PPr@DAPT@HA药物的药物释放情况。从图7可以看出，纳米药物复合体在微酸性环境(pH＝5.0)，特别是透明质酸酶存在的情况下，药物释放较快，24h的时候，在微酸性和透明质酸酶存在的条件下，药物累积释放率能达到40％。

[0142] 纳米药物的磁控释药是在交变磁场存在的情况下，每隔5分钟取一次样品，持续1h，最后使用HPLC检测药物释放情况。高效液相色谱检测条件如下：分离柱：Waters X Bridge，3μm，3mm×100mm；溶剂A：含0.1％磷酸的乙腈；溶剂B：含0.1％磷酸的三次水；流速：
1mL/min；检测波长：220nm；体积：20μL；温：25℃；洗脱条件如下表：

[0143]时间(min) A(％) B(％)
0.0 10 90
3.5 95 5
8.0 95 5
9.0 10 90
10.0 10 90
10.0 停止停止

[0144] 从图8可以看出，在外加磁场的作用下，特别是在微酸性条件下(pH＝5.0)，药物释放明显加快，在一个小时内的释放量能达到25％。

[0145] 实施例6

[0146] 在本实施例中，考察磁性纳米药物复合体对肿瘤干细胞的杀伤效果，方法如下：

[0147] 将1×105个4T1细胞接种到6孔板中，在CO2培养箱中培养12h后，设置不同组别：对照组(以Ctrl表示)、加入Fe3O4@PPr@HA载体组、加入Fe3O4@PPr@DAPT@HA纳米复合体组、加入Fe3O4@PPr@HA并且外加磁场组、加入Fe3O4@PPr@DAPT@HA并且外加磁场组。材料浓度为50μg/mL，磁场加热时间为15min，处理完成后，使用ALDH(Stem CellTM Technologies)试剂盒染色，通过流式细胞仪检测细胞中ALDH阳性细胞比例。

[0148] 从图9可以看出，纳米载体本身对肿瘤干细胞不会有显著影响，但是携载DAPT的纳米药物复合体能够减少ALDH阳性的肿瘤干细胞比例，药物载体在外加磁场的作用下也能够显著减少肿瘤干细胞的比例，当两者结合的时候，ALDH阳性的肿瘤干细胞减少的最多，能够减少到10％左右。

[0149] 将经过如上不同处理后的各组细胞继续培养24h后，洗去死亡细胞，然后进行细胞计数，重悬到球囊培养基(DMEM/F12，B27，20ng/mL EFG，20ng/mL bFGF，5μg/mL胰岛素，0.4％BSA)中。接种到超低吸附6孔培养板中，每孔接种5000个细胞。培养一周后，观察球囊的形成情况。将球囊离心后，用胰酶消化，然后进行细胞计数，统计每组球囊细胞数目。

[0150] 从图10A可以看出，经过DAPT药物或者磁热处理过的球囊体积明显变小，特别是药物效应与磁热效应协同作用，球囊体积最小，通过图10B所示消化后统计的球囊细胞数目也可以看出，通过磁热协同DAPT药物来消除肿瘤干细胞的效果最好。

[0151] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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一种磁性纳米药物复合体及其制备方法和应用

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