리보핵산 및 천녀목란 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition Comprising Ribonucleic acid and Extract of Magnolia sieboldii as active ingredient}

본 발명은 리보핵산 및 천녀목란 추출물을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 천녀목란 추출물을 리보핵산과 함께 포함시킴으로써, 리보핵산의 분해를 촉진하는 리보핵산 분해효소의 활성을 억제할 수 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

리보핵산(Ribonucleic acid) 또는 RNA는 디옥시리보스를 베이스로 갖는 디옥시리보핵산(DNA)와 달리 리보스를 기반으로 뉴클레오타이드를 이루는 핵산의 한 종류이다. 하나의 나선이 길게 꼬여 있는 구조를 지니며 분자 내부에서 상보적 염기쌍을 형성하여 부분적으로 이중 나선 구조를 갖기도 한다. 디옥시리보핵산과 달리 티민(Thymin) 대신 우라실(Uracil)이 아데닌(Adenine)과 염기쌍을 이루며, 리보핵산은 단백질을 합성하는 과정에 작용하며 일부 바이러스는 디옥시리보핵산 대신 리보핵산을 유전물질로 갖기도 한다. 리보핵산은 기능과 구조에 따라 리보좀을 구성하는 리보좀 리보핵산 (rRNA), 디옥시리보핵산으로부터 전달받은 단백질 합성에 대한 유전정보를 가지고 있는 전령 리보핵산 (mRNA), 전령 리보핵산의 코돈에 대응되는 아미노산을 전달하는 운반 리보핵산(tRNA)로 나눌 수 있다.

모든 생명체는 여러 종류의 리보핵산 분해효소을 지니고 있다. 리보핵산 분해효소(RNase)는 리보핵산의 분해를 촉진하는 효소로서, 더 이상 필요하지 않은 리보핵산을 제거할 때 또는 다양한 세포 내 과정 중 전령 리보핵산(mRNA), 비번역 리보핵산(non-coding RNA)등의 리보핵산의 성숙과정에 중요한 역할을 한다. 리보핵산 분해효소는 신생혈관생성 억제, 식물에서 자가불화합성(self-incompatibility)과 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 수행한다. 또한 리보핵산 분해 시스템은 리보핵산 바이러스에 대한 첫 번째 방어기작으로 리보핵산 간섭(RNA interference)과 같은 세포내 면역기작에 중요한 역할을 한다. 리보핵산 분해효소는 작용 기작에 따라 엔도 리보핵산 분해효소(endoribonuclease)와 엑소 리보핵산 분해효소 (exoribonuclease)로 나뉜다. 엔도 리보핵산 분해효소는 한 가닥의 RNA의 특정 염기서열을 인지하여 잘라내며 다양한 종류가 발견되었다. RNase A, RNase H, RNase I, RNase III, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V1, RNase V 등이 있다. exoribonuclease는 RNA를 끝단에서부터 염기를 5'에서 3' 또는 3'에서 5' 방향으로 제거하는 효소로서 polynucleotide Phospholyase(PNPase), RNase PH, RNase II, RNAse R, RNase D, RNase T, oligoribonuclease, Exoribonuclease I, Exoribonuclease II 등이 있다.

모든 세포내의 리보핵산은 5'말단 캡(5'end capping), 3' 말단 폴리아데닐레이션(3'end polyadenylation), 리보핵산-단백질 복합체 (RNA-protein complex) 내에서의 접힘 등의 다양한 기작에 의해 리보핵산 분해효소로부터 보호를 받는다. 또 다른 보호 기작은 리보핵산 분해효소 억제제에 의한 것으로, 리보핵산 분해효소 억제제는 리보핵산 분해효소의 활성을 저해하여 리보핵산이 분해되는 것을 방지한다.

리보핵산 분해효소 억제제(RNase inhibitor)는 450개 가량의 아미노산 잔기로 구성된 커다란 단백질로서 다른 단백질에 비해 시스테인과 루이신이 많은 것이 특징이다. 세포 단백질 중 무게로서 0.1%를 차지할 정도로 주요한 세포내 단백질로서 RNA의 수명을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 알파나선(α-helix)과 베타병풍(β-sheet) 구조가 교차적으로 리보핵산 분해효소 억제제를 구성하며 리보핵산 분해효소에 대한 리보핵산 분해효소 억제제의 결합력은 매우 강한데 이들 간의 해리상수는 생리학적 조건하에서 약 20fM 정도이다. 리보핵산 분해효소에 대한 리보핵산 분해효소 억제제의 결합력은 매우 중요한 역할을 하는데 이는 리보핵산 분해효소가 특히 암세포에 대해 세포독성을 보이기 때문이다. 리보핵산 분해효소의 활성은 유지하면서 단백질 구조에 변화를 주어 리보핵산 분해효소 억제제와의 결합력을 약화시키려는 연구가 진행되고 있다. 따라서 리보핵산 분해효소는 새로운 항암제 연구의 타겟이 되고 있으며 리보핵산 분해효소 억제제의 활성을 피하는 것이 중요한 과제이다.

또한, 21세기에 새로운 생체조절 물질로 급부상하고 있는 마이크로 리보핵산(miRNA)은 약 21 뉴클레오티드로 구성된 매우 작지만, mRNA와 상보적으로 결합해 세포의 모든 유전자 발현을 매우 선택적으로 조절하여, 세포의 성장, 분화, 노화, 활성 등 모든 세포반응에 관여하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 miR-125b가 FGRF2를 조절하여 건선에 관여한다는 것과, Let-7 miRNA는 진피섬유아세포의 콜라겐 타입1의 발현을 간접적으로 증가시킨다는 것, miR-152 및 mir-181a는 세포외 기질(Extracellular maxtrix)를 조절하여 피부진피세포의 노화를 조절하며, miR-434-5p는 피부세포의 미백에 관여한다는 보고가 알려지며 마이크로 리보핵산의 피부노화에서의 새로운 역할에 대한 관심이 증가하고 있다. 따라서 탄력, 미백, 보습 등 피부의 노화를 억제할 수 있는 마이크로 리보핵산을 화장품에 적용하면 새로운 카테고리의 항노화 제품을 만들 수 있다.

그러나 리보핵산 분해효소는 인체의 손, 땀, 타액 등에 많이 존재하므로 피부에 도포하는 화장품의 특성상 도포 후 리보핵산의 안정성에 문제가 있을 수 있어 피부에 대한 효능이 나타나기 어려울 수 있다. 따라서 화장품에서 리보핵산 분해효소의 활성을 억제하고 리보핵산의 안정성을 높여줄 수 있는 방안이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 여러 천연물들에 대하여 리보핵산과 관련된 활성을 연구하였다.

이에, 본 발명자들은 여러 천연물들 중, 목련과 식물인 천녀목란을 선정하고, 이로부터 추출물을 제조하여 리보핵산 분해효소 활성 저해효과를 측정하였다. 그 결과, 천녀목란 추출물이 리보핵산 분해효소 활성 저해효과가 매우 우수하므로 리보핵산 분해효소 저해제 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명의 목적은 천녀목란 추출물을 함유하여 피부에 유익한 리보핵산의 안정성을 높여줌으로써 그 효능을 유지시켜주는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 천녀목란 추출물을 효능을 극대화하기 위해 초임계, 초음파, 발효추출물을 제조하고 정제과정을 거쳐 우수한 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

따라서, 상기와 같은 본 발명의 목적은 리보핵산 및 천녀목란 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 리보핵산 분해효소 활성을 억제하여 항노화 효과 및 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 리보핵산은 운반 리보핵산(tRNA), 전령 리보핵산(mRNA), 리보솜 리보핵산(rRNA), 마이크로 리보핵산(miRNA), 작은 간섭 리보핵산(siRNA) 및 비번역 리보핵산(non-coding RNA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

바람직하게는, 상기 천녀목란 추출물이 리보핵산의 안정성을 높여준다.

또한, 바람직하게는, 상기 천녀목란 추출물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유되고, 상기 리보핵산은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.000001 ~ 30.0 중량% 함유될 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 천녀목란 추출물은 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용한 용매 추출법, (b) 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법 또는 (d) 발효추출법에 의해 추출되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 천녀목란 추출물은 리보핵산 분해효소 활성 억제효과 효과(실험예 1), 마이크로 리보핵산 분해효소 활성 억제효과(실험예 2), 화장품 제형 내에서 리보핵산 분해효소 활성 억제효과(실험예3)를 갖고, 화장품 제형 내에서 마이크로리보핵산과 함께 미백효과를 증진시킨다(실험예 4).

또한, 본 발명에 따르면, 천녀목란 추출물을 효능을 극대화하기 위해 초음파, 초임계추출 및 발효공정을 통해 추출한 결과, 천녀목란 추출물은 더욱 향상된 리보핵산 분해효소 활성 억제효과를 갖는다.

도 1은 본 발명에 따른 천녀목란 추출물의 리보핵산분해효소 활성 억제율을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 천녀목란 추출물의 마이크로 리보핵산에 대한 리보핵산 분해효소의 활성 억제효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 천녀목란 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 리보핵산분해효소 활성 억제율을 나타낸 것이다.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분인 천녀목란은 목련과의 낙엽 활엽 소 교목인 함박꽃 나무( Magnolia sieboldii )이며, 함백이꽃, 함박꽃 나무, 함박이, 옥란, 천녀목란, 천녀화라고도 하며 산골짜기의 숲속에서 자라며, 한국 각지와 일본, 중국 등지에 분포한다. 높이 7m로 원줄기와 함께 옆에서 많은 줄기가 올라와 군생하며 가지는 잿빛과 노란빛이 도는 갈색이며 어린가지와 겨울눈에 눈털이 있다. 꽃은 5~6월에 흰색의 양성으로 피고 잎이 난 다음 밑을 향하여 달리며 향기가 있다. 열매는 타원형 골돌과로 길이 3~4cm로 9월에 익으면 실에 매달린 종자가 나온다. 민간요법에서는 뿌리, 줄기 속껍질은 습진 술독, 변비에 효과가 있으며, 꽃봉오리는 혈압개선, 갑상선, 기침, 가래, 생리통에 효과가 있으며, 꽃은 소화불량, 기침에 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 천녀목란은 티로시나아제 활성 억제 및 멜라노사이트의 멜라닌 합성 억제 효과가 있어 피부 미백 개선효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 천녀목란 추출물은 천녀목란의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 종자 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 가지 또는 뿌리로부터 얻은 추출물이고, 가장 바람직하게는 가지로부터 얻은 추출물을 의미한다.

또한, 본 발명의 천녀목란 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다.

본 발명에서는 바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용하였다.

본 발명에서 천녀목란 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다.

한편, 본 발명의 천녀목란 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 천녀목란 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결 건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미한다. 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있다. 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205).

이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다.

지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다.

본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다.

이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

또한 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다.

초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 천녀목란 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함하는데, 천녀목란의 발효추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 천녀목란을 100~500 메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모균주 또는 유산균등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 천녀목란 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 천녀목란 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 리보핵산 분해효소 활성 억제 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 리보핵산 분해 효소 활성 억제 효과의 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

본 발명에 따르면, 리보핵산은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여, 0.000001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.00001 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.000001 중량% 미만인 경우에는 항노화 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 항노화 효과의 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

본 발명에서 리보핵산은 운반 리보핵산(tRNA), 전령 리보핵산(mRNA), 리보솜 리보핵산(rRNA), 마이크로 리보핵산(miRNA), 작은 간섭 리보핵산(siRNA)을 포함하는 것으로서, 바람직하게는 마이크로 리보핵산일 수 있다.

따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 항노화 활성이 우수한 리보핵산과, 리보핵산 분해효소 활성 억제효과가 우수한 천녀목란 추출물을 함유함으로서, 상기 성분을 각각 포함하는 경우보다 더욱 향상된 항노화 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 언급되는 리보핵산 분해효소는 엔도리보핵산 분해효소 또는 엑소 리보핵산 분해효소이다.

상기 엔도 리보핵산 분해효소로서, 구체적으로는 RNase A, RNase I, RNase III, RNase H, RNase L, RNase P, RNase PhyM, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase V1 및 RNase V를 포함한다.

상기 엑소리보핵산 분해효소로서, 구체적으로는 polynucleotide Phospholyase (PNPase), RNase PH, RNase D, RNase II, RNAse R, RNase T, oligoribonuclease, Exoribonuclease I 및 Exoribonuclease II 를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1. 천녀목란 추출물 제조

세절하여 음건한 천녀목란의 가지를 70% (V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하였다.

제조예 2~3. 초임계 유체 추출물 및 초음파 추출물 제조

통상적인 초임계 추출법(약 60℃의 온도에서 약 300 기압의 압력 하에 초임계 상태에서 공용매로서 에탄올을 이용하여 추출함)으로 추출하여 초임계 추출물을 얻었다(제조예 2). 초음파(슈퍼소닉 초음파기기를 이용하여 25KHz의 강도로 30℃에서 약 2시간 동안 추출)를 이용한 추출을 통해 추출물을 얻었다(제조예 3). 단, 제조예 3의 경우에는 공용매로 에탄올을 사용하였다.

제조예 4. 천녀목란 발효 추출물 제조

세절하여 음건한 천녀목란 가지를 100~500메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모균주 또는 유산균등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 발효 추출물을 얻었다(제조예 4).

실험예 1. 천녀목란 추출물의 리보핵산 분해효소 저해효과

본 실험예 1은 제조예 1 내지 4에서 수득한 천녀목란 추출물이 리보핵산 분해효소의 활성을 억제하는 효과를 측정하였다.

본 발명에서 사용된 전체 리보핵산은 GenElute ^TM Mammalian Total RNA Miniprep Kit(sigma aldrich, 미국)를 이용하여 인간 정상 피부 세포인 섬유아세포 (한국 세포주 은행, 대한민국, 1x10 ⁶ cells/rxn)로부터 추출하였다. 전체적인 리보핵산의 추출과정을 간략히 설명하면 다음과 같다. 먼저 수집된 섬유아세포(1x10 ⁶ cells)에 2-머캡토에탄올을 넣은 용출 버퍼(lysis buffer) 250μl를 넣고 vortexer로 잘 섞어 세포를 파쇄한다. GenElute filtration column으로 옮긴 뒤 12,000 - 16,000g로 2분간 원심분리한다. 70% 에탄올을 250μl 첨가한 뒤 용출물/에탄올(lysate/ethanol)를 GenElute Binding Column으로 옮긴 뒤 잘 섞어준 뒤 12,000 - 16,000g로 15초간 원심분리하여 상등액은 버린다. 500μl의 세척액(Wash solution) I을 넣고 12,000 - 16,000g로 15초간 원심분리하여 상등액은 버린다. Binding column을 새로운 수집 튜브(Collection tube)로 옮긴 뒤 500μl의 세척액(Wash solution) II를 넣고 12,000 - 16,000g로 2분간 원심분리한 후 상층액은 버린다. Binding column을 새로운 수집 튜브(Collection tube)로 옮긴 뒤 50μl의 용출액(elution solution)을 첨가한 뒤 1분간 원심분리하여 전체 리보핵산(RNA)을 추출한다.

추출된 리보핵산은 nano-drop 장비를 이용하여 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하고 전체 수율과 순도를 확인하였다.

일반적으로 사람의 경우, 혈청 1ml 당 120 unit 정도의 리보핵산 분해효소들이 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 사람 혈청 내에 존재하는 다양한 엔도 리보핵산분해효소들에 대해 높은 활성 억제력을 갖는 천연물을 스크리닝하기 위해 Pooled Human Normal Serum(Innovative Research, 미국)을 구매하였고, 멸균된 PBS 버퍼를 이용하여 1/10으로 희석한 뒤 실험에 사용하였다.

제조예 1 내지 4의 천녀목란 추출물 20μl와 사람혈청 50μl를 버퍼와 함께 최종 0.5ml 부피로 혼합하여 넣고 22℃에서 15분간 반응시킨다. 이때 시험에 사용한 천녀목란 추출물의 농도는 각각 2,500ppm, 12,500ppm, 25,000ppm으로 제조한 뒤 20μl를 반응시킴으로써 각각 최종 100ppm, 500ppm, 1000ppm이 되도록 하였다. 여기에 100μg의 사람의 전체 리보핵산을 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨다. 반응을 종료하고 큰 분자량의 리보핵산을 침전시키기 위해 10% TCA 0.5ml을 넣어준 뒤 침전된 리보핵산을 회수하여 260nm에서 리보핵산의 양을 측정하였다. 대조군으로 천녀목란 추출물과 사람혈청을 함유하지 않고 실험하였으며, 음성대조군으로 사람혈청을 함유하였고, 양성대조군으로는 천녀목란 추출물 대신 리보핵산분해효소 억제제인 RiboLock™ RNase Inhibitor 5μl(500U/ml, Thermo Scientific, 미국)와 사람혈청을 함유하여 실험하였다.

리보핵산 분해효소 활성 억제율(%)을 수학식 1을 이용하여 계산하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 보면, 본 발명의 천녀목란 추출물은 농도 의존적으로 리보핵산분해효소의 활성을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 리보핵산분해효소의 활성을 억제하는 리보핵산분해효소 억제제(RiboLock™)와 비교하면, 천녀목란 추출물은 이와 유사한 정도의 리보핵산 분해효소 활성 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 반면 천녀목란 추출물과 리보핵산 분해효소 모두 포함하지 않는 음성대조군의 경우 대부분의 리보핵산이 분해됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 천녀목란 추출물의 마이크로 리보핵산 분해효소 활성 억제효과

실험예 2에서는 제조예 1에서 수득한 천녀목란 추출물이 리보핵산 분해효소의 활성을 억제하는 효과를 측정하였다.

본 발명에서 사용된 마이크로 리보핵산은 (주)제놀루션에서 10 nmole로 합성한 것을 사용하였다. 사람 혈청 내에 존재하는 다양한 엔도 리보핵산분해효소들에 대해 높은 활성 억제력을 갖는 천연물을 스크리닝 하기 위해 Pooled Human Normal Serum(Innovative Research, 미국)을 구매하였고, 멸균된 PBS buffer를 이용하여 1/10으로 희석한 뒤 실험에 사용하였다. 합성한 마이크로 리보핵산은 miR-434-5p로 타이로시네이즈의 활성을 억제함으로써 미백효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그 염기서열은 5'- GCU CGA CUC AUG GUU UGA ACC A -3'이다.

천녀목란 추출물의 리보핵산 분해효소 활성 억제 효과를 확인하기 위해, 10 nmole의 마이크로 리보핵산에 RNase free water을 가하여 10mg/ml로 희석 시켰다. 10㎕의 희석한 마이크로 리보핵산, 500μg의 제조예1, 50㎕의 사람 혈청을 혼합하여 최종 500㎕ 부피로 상온에서 15분간 반응을 시켰다.

대조군으로 천녀목란 추출물과 사람혈청을 함유하지 않고 실험하였으며, 양성대조군으로는 천녀목란 추출물 대신 리보핵산분해효소 억제제인 RiboLock™ RNase Inhibitor 5μl(500U/ml, Thermo Scientific, 미국)를 이용하여 실험하였다.반응을 종료시킨 후, 2% TBE 아가로스 겔에 120V로 1시간 동안 전기영동하여 천녀목란 추출물의 리보핵산 분해효소 활성을 확인하였다.

천녀목란 추출물의 마이크로 리보핵산에 대한 리보핵산분해효소 활성 억제효과는 도 2에 나타내었다.

제형예 1 내지 4. 천녀목란 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조

천녀목란 추출물을 포함하는 화장료는 제조예 1 내지 4의 천녀목란 추출물을 각각 포함하도록 제조하였으며, 효능의 비교를 위해 천녀목란 추출물 대신에 리보핵산분해효소 활성억제제로서 RNA 분해효소 억제제(비교제형예 1) 및 추출물과 RNA 분해효소 억제제를 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 2)을 하기 표 1에 나타내었다.

실험예 3. 천녀목란 추출물의 제형내에서 리보핵산 분해효소 활성 저해효과

상기 제형예 1, 2, 3, 4 의 화장료 조성물에 대한 리보핵산분해효소 활성 억제 효과를 다음과 같이 측정하였다. 사람혈청과 전체 사람 리보핵산을 제형에 함께 함유시킨 뒤, 제조예 1 내지 4의 천녀목란 추출물이 리보핵산을 보호하는지를 확인하고자 하였다. 제형예 1 내지 4를 제조하고, 8시간 뒤에 제형예 1 내지 4에 남아있는 리보핵산을 분리하여 260nm에서 리보핵산의 양을 측정하였다. 또한 천녀목란 추출물 대신에 RNA 분해효소 억제제를 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 1) 및 천녀목란 추출물 또는 RNA 분해효소 억제제를 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 2)에서 리보핵산을 분리하여 260nm에서 리보핵산의 양을 측정하였다. 실험 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3을 보면, 제조예 1 내지 4의 천녀목란 추출물을 포함하는 제형예들에서 RNA가 거의 분해되지 않은 것을 확인할 수 있다.

제형예 5 내지 10 : 천녀목란 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조

천녀목란 추출물을 포함하는 화장료는 제조예 1, 3 및 4의 천녀목란 추출물을 각각 포함하는 화장료(제형예 5-10)를 제조하였다. 효능의 비교를 위해 천녀목란 추출물 대신에 미백성분으로서 나이아신아마이드를 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 3), 마이크로 리보핵산(miR-434-5p)만 넣은 화장료 조성물(비교제형예 4), 마이크로 리보핵산(miR-434-5p)과 리보핵산분해효소 억제제를 넣은 화장료 조성물(비교제형예 5), 천녀목란 추출물과 마이크로 리보핵산 (miR-434-5p) 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 6),천녀목란 추출물과 마이크로 리보핵산 (miR-434-5p) 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 6)을 하기 표 2에 나타내었다.

실험예 4. 마이크로 리보핵산과 천녀목란 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 미백 효과 실험

19-40세의 특히 피부가 검은 한국 여성 20명을 대상으로 본 발명의 마이크로 리보핵산과 천녀목란 추출물이 함유된 화장료 조성물의 미백 효과 실험을 실시하였다. 측정 부위는 팔의 10곳을 가로 세로 1 cm씩 표시하고, 자외선 조사기를 사용하여 피부의 색소 침착을 야기했다. 색소 침착이 된 팔에 상기 제형예 5 내지 10과 대조군으로는 비교제형예 3 내지 6의 화장료를 매일 아침, 저녁 2회씩 세정 후 적당량을 8주간 연속적으로 바르게 하였다. 8주 후에 Minolta CR 300을 이용하여 피부색(L 값)을 측정한 후 피부색의 변화도(△L)를 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 8주 후의 피부색의 변화도(△L) 값을 보면, 천녀목란 추출물과 마이크로 리보핵산을 모두 함유하는 화장료 제형예(제형예 5, 7, 9)에서의 미백효과가 천녀목란 추출물만을 함유하는 화장료 제형예 (제형예 6, 8, 10)에 비해 우수함을 확인할 수 있다. 이는 천녀목란 추출물의 미백효과에 마이크로 리보핵산 miR-434-5p이 시너지 효과를 내어 더 증진 시킨 결과로 보인다. 반면 마이크로 리보핵산만 함유하는 화장료 제형예(비교제형예4)는 미백효과가 있긴 하지만 천녀목란 추출물과 함께 있는 것에 비해 그 효과가 떨어진다. 그러나 마이크로 리보핵산과 리보핵산 분해효소 저해제를 함께 함유하는 화장료 제형(비교제형예 5)는 미백효과가 우수함을 확인하였다. 이는 피검자의 팔에 존재하는 리보핵산 분해효소에 의해 마이크로 리보핵산이 분해되어 미백효과를 나타내지 못한 것으로 보인다. 따라서 본 발명의 천녀목란 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 마이크로 리보핵산을 리보핵산 분해효소로부터 보호하여 안정화시킴으로써 마이크로 리보핵산의 미백효과를 더욱 배가시키는 효과를 갖고 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.