一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法
阅读：133发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法，包括以下步骤：取麝香通心滴丸破 薄膜 衣，加甲醇超声处理，取续滤液作为供试品溶液；取 丹酚酸 B对照品，加甲醇制成对照品溶液；将供试品溶液进行高效液相色谱分析，并根据与对照品的相对保留时间确定共有峰，采用标准品对照指证特征峰的化学成分，建立麝香通心滴丸的高效液相色谱特征图谱；根据标准品，计算待测成分的含量。本发明提供了一种能同时检测麝香通心滴丸中10个药效成分的特征图谱构建方法，并能对主要药效成分进行定量检测，稳定可靠、重现性好、精 密度 高，满足“一测多评”需求，弥补了麝香通心滴丸现有 质量 控制方法的不足。，下面是一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法专利的具体信息内容。
1.一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品的制备：取麝香通心滴丸10～50丸压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，加入3～
15mL甲醇，称重，超声处理，放冷后再次称重，用甲醇补足，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品的制备：取丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；
(3)将供试品溶液进行高效液相色谱分析，得到高效液相色谱特征图谱，根据与对照品的相对保留时间确定共有峰，利用标准品对照确定特征峰，建立麝香通心滴丸的高效液相色谱特征图谱；
所述高效液相色谱分析的条件为：
色谱柱为SynergiTM Hydro-RP(4.6×250mm，4μm)；
流动相为0.005～0.05％磷酸乙腈(A)与0.005～0.05％磷酸水(B)；
梯度洗脱：按照体积分数计，如表1所示：
表1流动相洗脱梯度
柱温为29～31℃；检测波长为198～206nm；流速为1.28～1.32mL/min。
2.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，还可以在步骤(3)后增加步骤(4)根据标准品，计算供试品溶液中各成分的含量。
3.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(1)中供试品制备为取滴丸40丸压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，加入10mL甲醇，称重，超声处理
30min，放冷后再次称重，用甲醇补足，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(3)中流动相为0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)。
5.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(3)中梯度洗脱按照体积分数计为0～5min，5％A；5～13min，5→20％A；13～40min，20→22％A；40～
60min，22→45％A；60～75min，45→70％A。
6.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(3)中的检测波长为203nm。
7.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(3)中的流速为1.30mL/min。
8.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于，步骤(3)中的柱温为30℃。
9.根据权利要求1所述的一种复方中药特征图谱构建方法，其特征在于：步骤(3)中所述特征峰为10个，其中峰1为丹参素钠，相对保留时间为0.237；峰2为原儿茶醛，相对保留时间为0.366；峰3为丹酚酸D，相对保留时间为0.608；峰4为人参皂苷Rg1，相对保留时间为
0.918；峰5为人参皂苷Re，相对保留时间为0.943；峰6为丹酚酸B，相对保留时间为1.000；峰
7为沙蟾毒精，相对保留时间为1.082；峰8为蟾毒灵，相对保留时间为1.723；峰9为华蟾酥毒基，相对保留时间为1.830；峰10为脂蟾毒配基，相对保留时间为1.858。
10.利用如权利要求1～9任一项方法构建的复方中药特征图谱进行麝香通心滴丸鉴别的方法，其特征在于，取麝香通心滴丸样品，按权利要求1～8任一项同法操作，得到麝香通心滴丸样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对所述样品特征图谱和权利要求9所述的复方中药特征图谱进行分析，相似度大于0.9为合格产品。
一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法
技术领域
背景技术
[0002] 麝香通心滴丸依据古方“至宝丹”、“六神丸”化裁而来，由人工麝香、蟾酥、人参茎叶总皂苷、丹 参、人工牛黄、熊胆粉、冰片，七味名贵药物组成。组方中君药人工麝香、蟾酥，芳香通脉、缓急止痛； 臣药人参茎叶总皂苷、丹参，补益心气、活血化瘀；佐药人工牛黄、熊胆粉，清脉凉开、化痰逐瘀；使药 冰片开窍醒神、直达病灶。诸药合用芳香益气通脉，活血化瘀止痛，对冠心病稳定型劳累性心绞痛具有很 好的疗效，成为《胸痹(不稳定性心绞痛)中医临床诊疗指南》、《急性心肌梗死中医临床诊疗指南》和《急 性心肌梗死中西医结合诊疗指南》推荐用药。
[0003] 目前麝香通心滴丸现行2015版药典标准，除性状检查外，对人工麝香、人参皂苷、丹参、蟾酥、冰 片和熊胆粉分别进行定性鉴别，此外还对蟾酥中的脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、人参茎叶总皂苷进行高效液 相色谱法(通则0512)定量检测。脂蟾毒配基、华蟾酥毒基的高效液相色谱法定量检测以十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂，0.5％磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH＝3.2)-乙腈(50:50)为流动相，检测波长296nm，柱 温40℃；每丸含蟾酥以脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的总量计，应为35～70μg。对人参茎叶总皂苷的含量测 定，其供试品溶液的制备：取本品40丸，精密称定，压破薄膜衣，置索氏提取器中，加入三氯甲烷适量， 加热回流7h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50mL， 称定重量，密塞，放置过夜，超声处理(功率500W，频率40kHz)60min，取出，放冷，再称定重量， 用水饱和正丁醇补足减失的重量，摇匀，离心(4000rpm)20min，滤过，精密量取续滤液25mL，置蒸发 皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心(5000rpm)10min， 滤过，取续滤液，即得。高效液相色谱法定量检测：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A， 水为流动相B，按以下条件进行梯度洗脱：0～25min，20％A；25～40min，20→26％A；40～45min， 26→37％A；45～62min，37→41％A；柱温为30℃，检测波长为203nm；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re 和人参皂苷Rd的总量计，每丸不得少于0.060mg；对冰片采用气相色谱法(通则0512)定量检测，每丸 含冰片0.30～0.60mg。药典方法存在每次只能检测一种目标成分，操作繁琐，费时费力成本高，且对制剂 中其他药效成分缺乏有效的控制等问题。
[0004] 目前未见麝香通心滴丸或者相关组方的特征图谱及其构建方法报道，仅有部分药材如蟾酥、人工牛黄、 人工麝香、丹参、蟾酥和熊胆粉的指纹图谱已有报道。在蟾酥的指纹图谱报道中，朱玲英等在《蟾酥药材HPLC指纹图谱研究》(中成药，2008，30(5)：625～628)一文中采用反相Alhima C18柱(250mm×4.6mm， 5μm)；流动相为乙腈(A)-0.5％磷酸二氢钾溶液(B)，梯度洗脱；检测波长296nm；柱温30℃；流速 1.0mL/min构建了色谱条件，确定了10个峰构成蟾酥药材的指纹特征，并指认了化合物脂蟾毒配基、华 蟾酥毒基、蟾毒灵、去乙酰基蟾毒它灵以及华蟾毒精的特征峰。王腾飞等在《基于特征图谱和一测多评法 的蟾酥药材质量控制研究》(中国中药杂志，2018，43(14)：2863～2871)采用Alltima C18色谱柱(4.6 mm×250mm，5μm)，流动相乙腈(A)-0.3％乙酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15min，28％→54％A；15～35min， 54％A)，流速0.6mL/min，检测波长296nm，柱温30℃；确定了18个共有峰，分别鉴定为五羟色胺、 N-甲基五羟色胺、N,N-二甲基五羟色胺、N,N,N-三甲基五羟色胺、日蟾毒它灵、异沙蟾毒精、沙蟾毒精、 嚏根草配基、19-羟基蟾毒灵、远华蟾毒精、去乙酰华蟾酥毒精、蟾毒它灵、脂蟾毒精、华蟾毒它灵、南美 蟾毒精、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基。
[0005] 在人工麝香的指纹图谱报道中，于娟在《不同麝香的气相色谱指纹图谱》(中国实验方剂学杂志，2019， 6：175～182)采用气相色谱法建立了不同品种麝香的气相指纹图谱，确定了养殖麝香17个共有化合物， 天然麝香10个共有化合物及人工麝香8个共有化合物。敖艳霖等在《天然麝香ATR-FTIR红外指纹图谱的 比较》(东北林业大学学报，2018，64(2)：
98～104)中采用衰减全反射红外光谱技术(ATR-FTIR)，获得 源自林麝、原麝、马麝3个物种的22份天然麝香样本的红外指纹图谱；对图谱的基本特征进行分析，林 麝与原麝麝香之间的共有峰率在42.4～70.4％之间，原麝与马麝麝香之间的共有峰率在45.2～66.7％之间， 林麝与马麝麝香之间的共有峰率在43.8～100％之间，麝香品种不同时，变异峰率较高，差异较大。
98～104)中采用衰减全反射红外光谱技术(ATR-FTIR)，获得 源自林麝、原麝、马麝3个物种的22份天然麝香样本的红外指纹图谱；对图谱的基本特征进行分析，林 麝与原麝麝香之间的共有峰率在42.4～70.4％之间，原麝与马麝麝香之间的共有峰率在45.2～66.7％之间， 林麝与马麝麝香之间的共有峰率在43.8～100％之间，麝香品种不同时，变异峰率较高，差异较大。
[0006] 在人工牛黄的指纹图谱报道中，胡晓茹等在《牛黄及代用品中胆汁酸类成分指纹图谱及含量测定研究》 (药物分析杂志，2018，4：648～656)一文采用HPLC-ELSD联用技术，使用SymmetryshieldTM C18色谱 柱(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸水溶液(含10mmol·L-1醋酸铵)为流动相B， 梯度洗脱(0～5min，2％A→35％A；5～12min，35％A→37％A；12～23min，37％A；23～45min， 37％A→50％A)，流速1.0mL·min-1，ELSD漂移管温度102℃，氮气1.9mL·min-1，建立了牛黄及代用品的 HPLC-ELSD指纹图谱，并指认了甘氨胆酸、牛磺胆酸、胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、猪去氧 胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸8个特征峰。
[0007] 在丹参的指纹图谱报道中，李佩等在《丹参饮片高效液相指纹图谱及其分级研究》(湖北中医药大学 学报，2015，17(5)：50～54)中运用戴安U3000-DAD-HPLC色谱仪，采用依利特C-18BP(4.6mm×250mm， 5μm)柱，以0.8％冰乙酸的甲醇溶液-0.8％冰乙酸水溶液梯度洗脱，检测波长270nm，柱温30℃。24批丹 参饮片获得15个特征峰，未归属特征峰。柳阳在《丹参等八味常用中药饮片质量控制研究》(湖北中医药 大学，2019)中采用Symmetry C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸 水溶液，梯度洗脱(0～15min，10％A→17％A；15～18min，17％A→25％A；18～36min，25％A→30％A； 36～39min，30％A→
57％A；39～48min，57％A→61％A；48～53min，61％A→70％A；53～58min，70％A→75％A；58-1
～65min，75％A→90％A；65～70min，90％A)，流速1.0mL·min ，柱温25℃，检测 波长
270nm，进样量10μL，共得到26个共有峰，归属了迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、 丹参酮I、丹参酮IIA。
57％A；39～48min，57％A→61％A；48～53min，61％A→70％A；53～58min，70％A→75％A；58-1
～65min，75％A→90％A；65～70min，90％A)，流速1.0mL·min ，柱温25℃，检测 波长
270nm，进样量10μL，共得到26个共有峰，归属了迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、 丹参酮I、丹参酮IIA。
[0008] 在熊胆粉的指纹图谱报道中，沈丽娟等在《注射用熊胆粉及其原料熊胆粉指纹图谱研究》(药物研究， 2004，13(9)：23～24)一文中采用反相高效液相色谱法，色谱柱用Shim-packVPC18柱(4.0mm×150mm， 5μm)，流动相为甲醇-0.03mol/L磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱；检测波长210nm，建立10个特征峰，其中 峰6归属为牛磺熊去氧胆酸，峰9为牛磺鹅去氧胆酸。简龙海等在《痰热清注射液中熊胆粉部分指纹图谱 和成分测定》(中成药，2013，35(1)：109～113)一文中建立HPLC-UV法测定痰热清注射液中熊胆粉部 分的指纹图谱，采用Waters Atlantis C18色谱柱(4.6mm×15cm，5μm)，流动相为乙腈-0.1％磷酸，梯度洗 脱，测定波长为203nm。结果痰热清注射液中熊胆粉部分具4个共有峰，包括熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸等。
[0009] 上述检测方法都是以单味药材为目标，虽然部分方法检测指标较多，但大部分检测的是同一大类成分， 其理化性质较为接近；分析各个检测方法，有液相色谱和气相色谱，即使检测方法为液相色谱，检测波长、 流动相及流速，洗脱条件等多不相同。麝香通心滴丸由7味药材组成，其组方中各药材成分种类繁多，而 且部分药材投药量较少，在制剂中含量较低，但也发挥着相关中药的药理药效作用，故有必要对相关的药 效成分进行质量控制，保证临床用药安全、有效。目前未见麝香通心滴丸特征图谱及其构建方法报道，也 无法采用上述文献报道的特征图谱构建方法来实现麝香通心滴丸特征图谱的构建。
[0010] 因此，建立一种能充分反映麝香通心滴丸质量特征图谱的分析方法，全面检测麝香通心滴丸，可实现 定量检测药效成分，实现“一测多评”目标，达到质量可控，有效保证药品临床疗效。
发明内容
[0011] 针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法。该方法能满足 “一测多评”需求，稳定可靠、重现性好、精密度高，弥补了麝香通心滴丸现有质量控制方法的不足，对 该品种的质量检测和评价具有指导意义。
[0012] 本发明所采取的技术方案为：
[0013] 一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法，包括以下步骤：
[0014] (1)供试品的制备：取麝香通心滴丸10～50丸压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，加入3～15mL甲醇， 称重，超声处理，放冷后再次称重，用甲醇补足，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0015] 优选为，取麝香通心滴丸40丸压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，加入10mL甲醇，称重，超声处理30min， 放冷后再次称重，用甲醇补足，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0016] (2)对照品的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成对照品溶液；
[0017] (3)将供试品溶液进行高效液相色谱分析，得到HPLC特征图谱，根据与对照品的相对保留时间确 定共有峰，利用标准品对照确定特征峰，建立麝香通心滴丸的HPLC特征图谱，所述HPLC分析的条件为：
[0018] 色谱柱为SynergiTM Hydro-RP(4.6×250mm，4μm)；
[0019] 流动相为0.005～0.05％磷酸乙腈(A)与0.005～0.05％磷酸水(B)；优选为，流动相0.02％磷酸乙腈 (A)-0.02％磷酸水(B)；
[0020] 柱温为29～31℃，优选为30℃；
[0021] 检测波长为198～206nm，优选为203nm；
[0022] 流速为1.28～1.32mL/min，优选为1.30mL/min；
[0023] 梯度洗脱：按照体积分数计，如表1所示：
[0024] 表1流动相洗脱梯度
[0025]
[0026] 优选流动相洗脱梯度如表2所示：
[0027] 表2优选流动相洗脱梯度
[0028]
[0029] 进一步，发明人在步骤(3)中确定的10个特征峰，分别以丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、人参皂 苷Rg1、人参皂苷Re、丹酚酸B、沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基为参照物确定麝香通心滴 丸的HPLC特征图谱。取麝香通心滴丸15批次，按“步骤(1)供试品的制备”方法制备供试品，进样， 记录色谱图。将麝香通心滴丸色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)，选定丹酚酸 B为参照峰，并根据相对保留时间确定了10个特征指纹峰，分别指认出峰1为丹参素钠，相对保留时间 为0.237；峰2为原儿茶醛，相对保留时间为0.366；峰3为丹酚酸D，相对保留时间为0.608；峰4为人 参皂苷Rg1，相对保留时间为0.918；峰5为人参皂苷Re，相对保留时间为0.943；峰6为丹酚酸B，相对 保留时间为1.000；
峰7为沙蟾毒精，相对保留时间为1.082；峰8为蟾毒灵，相对保留时间为1.723；峰9 为华蟾酥毒基，相对保留时间为1.830；峰10为脂蟾毒配基，相对保留时间为1.858。
峰7为沙蟾毒精，相对保留时间为1.082；峰8为蟾毒灵，相对保留时间为1.723；峰9 为华蟾酥毒基，相对保留时间为1.830；峰10为脂蟾毒配基，相对保留时间为1.858。
[0030] (4)根据标准品，计算待测成分的含量。
[0031] 利用特征图谱进行麝香通心滴丸的鉴别，取麝香通心滴丸样品，按本发明方法操作，得到麝香通心滴 丸样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对所述样品特征图谱和本发明获得的复方中 药特征图谱进行分析，相似度大于0.9为合格产品。通过标准品、样品的色谱峰面积与浓度比值计算，获 得样品中成分含量。
[0032] 本发明对单味药材液相指纹图谱中常用的流动相乙腈(A)-0.3％乙酸水(B)、乙腈(A)-0.2％甲酸 水(B)、乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)在表2所述梯度条件，在初定检测波长203nm下进行麝香通心滴 丸特征图谱构建考察时发现，乙腈(A)-0.3％乙酸水(B)、乙腈(A)-0.2％甲酸水(B)条件下出现倒峰， 且甲酸和乙酸有紫外吸收本底，203nm下色谱峰没有响应。流动相为乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)条件下 的特征峰华蟾酥毒基与脂蟾毒配基相邻，且保留时间靠后，两个色谱峰分离度(R值)为0.25，不满足药 典标准(R≥1.5)的要求，分析发现其原因为流动相为乙腈(A)-0.2％磷酸水(B)，其存在一个明显的杂 峰脂蟾毒精，该物质与华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的化合物极性相近，故造成液相条件下R值小于1.5。
[0033]
[0034] 本发明人发现在流动相为0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)，表2所述梯度条件，在初定检测 波长203nm下，麝香通心滴丸特征图谱各色谱峰峰形尖锐、响应值高、基线平稳、分离度好，华蟾酥毒 基与脂蟾毒配基R值为3.71，满足药典要求。此外还检测出人参皂苷Rg1和人参皂苷Re色谱峰，该液相 条件可实现多药材成分同步检测。检测结果如表3所示。
[0035] 表3不同流动相下华蟾酥毒基与脂蟾毒配基分离度情况
[0036]
[0037] 注：R值为华蟾酥毒基与脂蟾毒配基分离度，R≥1.5时满足药典要求。
[0038] 对乙腈中加入的低浓度酸进行优化，甲酸和乙酸有紫外吸收本底，203nm下色谱峰没有响应，于是调 整波长，在DAD检测器等吸收线图中发现280nm下峰响应较高，所以调整波长至280nm。检测结果表 明，在280nm下0.02％甲酸乙腈(A)-0.02％甲酸水(B)和0.02％乙酸乙腈(A)-0.02％乙酸水(B)未 实现脂蟾毒配基与华蟾酥毒基色谱峰的分离，说明在乙腈中加入磷酸实现脂蟾毒配基与华蟾酥毒基色谱峰 分离具有专属性，但在280nm下无法检测出人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，无法实现多药材同步检测。说 明人参皂苷的吸收波长范围较窄，同时满足人参皂苷Rg1和人参皂苷Re检测、华蟾酥毒基与脂蟾毒配基 色谱峰有效分离的液相条件具有专属性。
[0039] 经流动相、检测波长、柱温等优化后发现，流动相0.005～0.05％磷酸乙腈(A)-0.005～0.05％磷酸水 (B)在表1所述梯度条件，检测波长198～206nm，柱温29～31℃，流速
1.28～1.32mL/min下均能实现 华蟾酥毒基与脂蟾毒配基色谱峰的有效分离(R值≥1.5)，且均能检测出人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，峰 形尖锐、响应值与出峰率高、基线平稳。优选流动相为0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)，表2所 述梯度条件，检测波长203nm，柱温
30℃，流速1.30mL/min条件下，色谱峰主峰出峰量多，杂峰少，分 离度更好，基线更平稳，满足特征图谱的构建要求。本发明液相条件与现有技术《丹参等八味常用中药饮 片质量控制研究》的液相条件同时检测麝香通心滴丸成分。结果表明，该现有技术液相条件下无法检测出 人参皂苷，同时在20min～30min和40min～50min无法实现色谱峰有效分离，单味饮片的液相条件不适合 麝香通心滴丸成分的检测。本发明提供的检测波长、流动相、洗脱梯度等组合形成的麝香通心滴丸液相色 谱条件解决了现有技术中人参皂苷、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基无法同时检测和分离的问题。
1.28～1.32mL/min下均能实现 华蟾酥毒基与脂蟾毒配基色谱峰的有效分离(R值≥1.5)，且均能检测出人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，峰 形尖锐、响应值与出峰率高、基线平稳。优选流动相为0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)，表2所 述梯度条件，检测波长203nm，柱温
30℃，流速1.30mL/min条件下，色谱峰主峰出峰量多，杂峰少，分 离度更好，基线更平稳，满足特征图谱的构建要求。本发明液相条件与现有技术《丹参等八味常用中药饮 片质量控制研究》的液相条件同时检测麝香通心滴丸成分。结果表明，该现有技术液相条件下无法检测出 人参皂苷，同时在20min～30min和40min～50min无法实现色谱峰有效分离，单味饮片的液相条件不适合 麝香通心滴丸成分的检测。本发明提供的检测波长、流动相、洗脱梯度等组合形成的麝香通心滴丸液相色 谱条件解决了现有技术中人参皂苷、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基无法同时检测和分离的问题。
[0040] 此外，发明人利用标准品对照归属丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、丹 酚酸B、沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基特征峰，建立麝香通心滴丸的HPLC特征图谱。
[0041] 相比现有技术，本发明取得如下有益效果：
[0042] 目前麝香通心滴丸的质量标准收载于2015版《中国药典》，其对于药材需要建立各自的检测方法，如 依次采用高效液相色谱法测定蟾酥的华蟾酥毒基、脂蟾毒配基含量；采用气相色谱法测定冰片含量；采用 高效液相色谱法测定人参茎叶总皂苷含量，且其供试品溶液的制备采用三氯甲烷加热回流提取，费时费力， 有待改进。
[0043] 本发明提供了一种构建麝香通心滴丸特征图谱方法，该方法实现了各类主要药效成分的鉴别及含量测 定。首先，本品组方复杂，相关成分特别多，不仅在各类波长下的吸光度差异大，而且有诸多成分的理化 性质较为接近，出峰存在严重干扰。本发明改变了药典方法中人参茎叶总皂苷繁复费时的供试品制备方法， 建立了一种简单可行的供试品制备方法；并建立了一种可实现同步定量检测丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸 D、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、丹酚酸B、沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基共10个药效 成分的方法，实现“一测多评”目标。此外，通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对比样品特征图 谱与本发明特征图谱，相似度大于0.9可判断样品质量合格。附图说明
[0044] 图1为麝香通心滴丸HPLC流动相选择结果，图1-1为流动相乙腈(A)-0.3％乙酸水溶液(B)，图1-2 为流动相乙腈(A)-0.2％甲酸水(B)，图1-3为流动相乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)，图1-4为流动 相0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)。其中①为人参皂苷Rg1色谱峰，②为人参皂苷Re色谱峰， ③为华蟾酥毒基色谱峰，④为脂蟾毒配基色谱峰，⑤为脂蟾毒精色谱峰，A部及其局部放大图表明在③和 ④之间存在杂峰⑤。
[0045] 图2为麝香通心滴丸HPLC流动相中低浓度酸优化结果，图2-1为0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水 (B)，图2-2为0.02％乙酸乙腈(A)-0.02％乙酸水(B)，图2-3为0.02％甲酸乙腈(A)-0.02％甲酸水(B)， 其中③为华蟾酥毒基色谱峰，④为脂蟾毒配基色谱峰。
[0046] 图3为麝香通心滴丸HPLC流动相优化结果，图3-1为0.005％磷酸乙腈(A)-0.005％磷酸水(B)， 图3-2为0.01％磷酸乙腈(A)-0.01％磷酸水(B)，图3-3为0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)，图 3-4为0.05％磷酸乙腈(A)-0.05％磷酸水(B)。其中①为人参皂苷Rg1色谱峰，②为人参皂苷Re色谱峰， ③为华蟾酥毒基色谱峰，④为脂蟾毒配基色谱峰。
[0047] 图4为麝香通心滴丸HPLC波长优化结果，图4-1为波长194nm，图4-2为波长198nm，图4-3为波 长203nm，图4-4为波长206nm，图4-5为波长210nm。其中①为人参皂苷Rg1色谱峰，②为人参皂苷 Re色谱峰，③为华蟾酥毒基色谱峰，④为脂蟾毒配基色谱峰。
[0048] 图5为麝香通心滴丸HPLC流动相洗脱梯度优化结果，图5-1为梯度1，图5-2为梯度2，图5-3为梯 度3，图5-4为梯度4。其中①为人参皂苷Rg1色谱峰，②为人参皂苷Re色谱峰，③为华蟾酥毒基色谱峰， ④为脂蟾毒配基色谱峰。
[0049] 图6为麝香通心滴丸HPLC条件确定结果，其中①为人参皂苷Rg1色谱峰，②为人参皂苷Re色谱峰， ③为华蟾酥毒基色谱峰，④为脂蟾毒配基色谱峰，⑥为丹酚酸B色谱峰。
[0050] 图7为麝香通心滴丸HPLC条件与现有技术对比结果，图7-1为优化条件液相图谱，图7-2为现有技 术液相图谱。其中①为人参皂苷Rg1色谱峰，②为人参皂苷Re色谱峰，③为华蟾酥毒基色谱峰，④为脂 蟾毒配基色谱峰。
[0051] 图8为麝香通心滴丸HPLC特征图谱筛选结果，图8-1为15批次色谱图共有峰，图8-2为麝香通心滴 丸HPLC特征图谱。其中1为丹参素钠色谱峰，2为原儿茶醛色谱峰，3为丹酚酸D色谱峰，4为人参皂 苷Rg1，5为人参皂苷Re，6为丹酚酸B色谱峰((s)代表该峰作为参照峰)，7为沙蟾毒精色谱峰，8为 蟾毒灵色谱峰，9为华蟾酥毒基色谱峰，10为脂蟾毒配基色谱峰。
[0052] 图9麝香通心滴丸特征图谱的专属性考察结果，图9-1为麝香通心滴丸辅料液相图，图9-2为麝香通 心滴丸液相图。其中1为丹参素钠色谱峰，2为原儿茶醛色谱峰，3为丹酚酸D色谱峰，4为人参皂苷Rg1， 5为人参皂苷Re，6为丹酚酸B色谱峰((s)代表该峰作为参照峰)，7为沙蟾毒精色谱峰，8为蟾毒灵色 谱峰，9为华蟾酥毒基色谱峰，10为脂蟾毒配基色谱峰。
具体实施方式
[0053] 下面结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来 限定本发明的保护范围。
[0054] 麝香通心滴丸(15批样品批号：160301、160702、160804、161003、170302、170405、170503、170902、 171203、180109、180202、180302、180607、180704、180709，用于样品测定)，均由内蒙古康恩贝药业 有限公司圣龙分公司提供；人参皂苷Rg1对照品(110703-
201933)、人参皂苷Re对照品(11818-201302)、 华蟾酥毒基对照品(110803-201406)、脂蟾毒配基对照品(110718-201809)、丹酚酸B对照品(111562-201716) 由中国食品药品检定研究院提供。
201933)、人参皂苷Re对照品(11818-201302)、 华蟾酥毒基对照品(110803-201406)、脂蟾毒配基对照品(110718-201809)、丹酚酸B对照品(111562-201716) 由中国食品药品检定研究院提供。
[0055] 实施例1：流动相选择-1
[0056] 采用二极管阵列检测器在190～400nm进行麝香通心滴丸供试品DAD全波长扫描，综合考虑到各药 材色谱峰信息，发现在203nm处，色谱峰信息丰富且特征峰响应强度较大，能获取更多色谱组分信息， 故初步选择203nm作为检测波长，并在此基础上进行优化。
[0057] 1、供试品的制备：取麝香通心滴丸40丸，精密称定，压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 10mL，称重，超声处理30分钟，取出，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液， 即得。
[0058] 2、对照品的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品适量，精密称定， 加甲醇制成对照品溶液；
[0059] 3、色谱条件：色谱柱为SynergiTM Hydro-RP，4.6×250mm，4μm；
[0060] 分别设置不同流动相和检测波长，流动相为如表4所示：
[0061] 表4流动相设置
[0062]
[0063] 梯度洗脱：按照体积分数计，0～5min，5％A；5～10min，5→20％A；10～35min，20→22％A；35～ 60min，22→45％A；60～75min，45→70％A；
[0064] 柱温为30℃，流速为1.30mL/min。
[0065] 4、操作步骤：
[0066] 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。根据色谱图 分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分离度R，重复5次计算R平均值。
[0067] 分离度(R)计算公式：R＝2(tR2-tR1)/(W1+W2)，
[0068] 其中；tR2：脂蟾毒配基的保留时间；
[0069] tR1：华蟾酥毒基的保留时间；
[0070] W1：华蟾酥毒基的峰宽；
[0071] W2：脂蟾毒配基的峰宽。
[0072] R值越大分离度越好，其中R<1.5为不完全分离，R≥1.5为完全分离《，中国药典》规定R应大于等于 1.5。
[0073] 5、试验结果：
[0074] 试验结果如图1所示，其中R值如表5所示：
[0075] 表5流动相对应试验结果
[0076]
[0077] 其中试验组一～试验组三为检测单味药材的流动相条件用于检测麝香通心滴丸。结果表明，试验组一 与试验组二出现倒峰，原因可能是供试品提取溶剂与流动相体系差异较大；此外，在该流动相体系下进行 梯度洗脱，203nm不是合适的吸收波长；试验组三各色谱峰相互干扰严重，华蟾酥毒基与脂蟾毒配基色谱 峰R值小于1.5，为不完全分离。
[0078] 通过LC-MS进行试验组三中脂蟾毒配基与华蟾酥毒基色谱峰分析。质谱条件：采用电喷雾离子源正 离子、负离子扫描模式，扫描范围m/z 100～3000，毛细管电压35000V，干燥温度350℃，干燥气流速10 L/min，雾化器压力35psig；碰撞能量20.00V。分析结果发现脂蟾毒配基与华蟾酥毒基色谱峰中存在分子 离子峰[M+H+]399.2166，MS/MS碎片离子峰为335.1978，175.0747，107.0845。经文献检索确认该化合物 为脂蟾毒精(惹斯蟾蜍精)C24H30O5。华蟾酥毒基、脂蟾毒精和脂蟾毒配基的化学结构式如下所示：
[0079]
[0080] 以上三个化合物极性相近，采用试验组四0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)流动相可能影响华 蟾酥毒基、脂蟾毒精和脂蟾毒配基的性质，造成保留时间和峰型的改变，提高分离度。经标准品对比，图 1-4中⑤为脂蟾毒精。故采用0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)流动相比乙腈(A)-0.02％磷酸水(B) 能更好的实现这三种化合物的分离。此外，在试验组四条件下检测出人参皂苷Rg1和人参皂苷Re色谱峰， 流动相A中加入磷酸能更好地分离杂峰与响应值小的皂苷峰，防止其与杂峰合并(乙腈(A)-0.2％磷酸水 (B)条件下，人参皂苷峰与杂峰合并，未检测出峰)，因此实现同步检测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、 华蟾酥毒基和脂蟾毒配基。
[0081] 实施例2：流动相中低浓度酸优化
[0082] 对乙腈中加入的低浓度酸进行优化，甲酸和乙酸有紫外吸收本底，203nm下色谱峰没有响应，于是调 整波长，在DAD检测器等吸收线图中发现280nm下峰响应较高，所以调整波长至280nm。
[0083] 1、按照实施例1的方法完成供试品的制备、对照品的制备。色谱条件：色谱柱为SynergiTM Hydro-RP，4.6×250mm，4μm；流动相为如表6所示：
[0084] 表6流动相中低浓度酸优化
[0085]
[0086] 洗脱梯度、柱温、流速和操作步骤按实施例1的方法进行。
[0087] 2、试验结果
[0088] 试验结果如图2所示，其中R值如表7所示：
[0089] 表7流动相对应试验结果
[0090]
[0091] 结果表明，试验组一采用0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)为流动相时，R值远大于1.5，华 蟾酥毒基与脂蟾毒配基色谱峰完全分离。试验组二～试验组三分别采用0.02％乙酸乙腈(A)-0.02％乙酸 水(B)、0.02％甲酸乙腈(A)-0.02％甲酸水(B)为流动相，相比于203nm下有更多的特征峰，但华蟾 酥毒基与脂蟾毒配基色谱峰R值均小于1.5，未完全分离。经LC-MS分析，试验组二和试验组三中的华蟾 酥毒基与脂蟾毒配基色谱峰检测出脂蟾毒精分子离子峰和MS/MS碎片离子峰。
[0092] 在流动相乙腈(A)-水(B)中加入0.02％磷酸可能改变了华蟾酥毒基、脂蟾毒精和脂蟾毒配基的解 离程度，造成保留时间和峰型的改变，提高分离度，实现了华蟾酥毒基、脂蟾毒精和脂蟾毒配基色谱峰的 分离。由此可见，0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)流动相对于解决华蟾酥毒基与脂蟾毒配基色谱 峰小于1.5的问题具有专属性。
[0093] 此外，0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)流动相在280nm下无法检测出人参皂苷Rg1和人参 皂苷Re，说明人参皂苷的吸收波长范围较窄。同时满足人参皂苷Rg1和Re检测、华蟾酥毒基与脂蟾毒配 基有效分离的液相条件具有专属性。
[0094] 实施例3：流动相优化
[0095] 根据实施例1的流动相0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)，对磷酸比例进行优化。
[0096] 1、供试品的制备：取麝香通心滴丸10丸，精密称定，压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 3mL，称重，超声处理30min，取出，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液， 即得；
[0097] 2、对照品的制备：按照实施例1的方法制得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 对照品；
[0098] 3、色谱条件：色谱柱为SynergiTM Hydro-RP，4.6×250mm，4μm；流动相为如表8所示：
[0099] 表8流动相优化设置
[0100]
[0101] 梯度洗脱：按照实施例1洗脱程序进行梯度洗脱；
[0102] 检测波长为203nm，柱温为30℃，流速为1.30mL/min。
[0103] 4、操作步骤
[0104] 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。根据色谱图 分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分离度R，重复5次计算R平均值。
[0105] 5、试验结果：
[0106] 试验结果如图3所示，其中R值如表9所示。
[0107] 表9流动相优化试验结果
[0108]
[0109] 其中试验组一～试验组四均满足R≥1.5，即华蟾酥毒基和脂蟾毒配基色谱峰分离度较好，其中试验组 三0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)的R平均值为3.85，分离效果较好，各色谱峰峰形尖锐，杂峰 干扰较小，响应值高，基线平稳。
[0110] 此外，试验组一～试验组四均检测出人参皂苷Rg1和人参皂苷Re色谱峰，说明0.005％～0.05％磷酸乙 腈(A)-0.005％～0.05％磷酸水(B)液相条件下均能实现人参皂苷Rg1、Re和华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的 同步检测，综合峰型、分离度等因素，判断0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)为优选。
[0111] 实施例4：波长选择
[0112] 选择实施例2优化的流动相0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％磷酸水(B)，对检测波长进行优化。
[0113] 1、供试品的制备：取麝香通心滴丸50丸，精密称定，压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 15mL，称重，超声处理30分钟，取出，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液， 即得；
[0114] 2、对照品的制备：按照实施例1的方法制得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基 对照品；
[0115] 3、色谱条件：色谱柱为SynergiTM Hydro-RP，4.6×250mm，4μm；流动相0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％ 磷酸水(B)，按照实施例1洗脱程序进行梯度洗脱，采用194nm、198nm、203nm、206nm、210nm波 长，分别进行检测。
[0116] 4、操作步骤
[0117] 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。根据色谱图 分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分离度R，重复5次计算R平均值。
[0118] 5、试验结果：
[0119] 试验结果如图4所示，其中R值如表10所示。
[0120] 表10流动相优化试验结果
[0121]
[0122] 试验结果表明，在波长为194nm～210nm下，R平均值均大于3.0，满足分离度要求，但从液相图出 峰量可以发现，194nm波长下液相色谱基线漂移严重，因此舍去；210nm波长下，特征峰人参皂苷Rg1 相应值较小，作为特征图谱建立条件无法实现样品中人参皂苷Rg1的准确检测，因此舍去；波长为198～ 206nm时，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re均能出峰并有效分离，其中203nm下综合色谱峰效应值高、基 线平稳。综合R值、响应值、基线平稳程度，判断得出198～206nm下为特征图谱建立波长范围，203nm 为优选。
[0123] 实施例5：液相梯度选择
[0124] 根据实施例1～4的优选条件，对液相梯度进行优化。
[0125] 1、供试品的制备：按照实施例1的方法制得麝香通心滴丸供试品；
[0126] 2、对照品的制备：按照实施例1的方法制得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、华蟾酥毒基对照品和脂蟾 毒配基对照品；
[0127] 3、色谱条件：色谱柱为SynergiTM Hydro-RP，4.6×250mm，4μm；流动相0.02％磷酸乙腈(A)-0.02％ 磷酸水(B)，波长203nm，柱温为30℃，流速为1.30mL/min。
[0128] 梯度洗脱：按照体积分数计，如表11所示：
[0129] 表11梯度洗脱设置
[0130]
[0131] 4、操作步骤
[0132] 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。根据色谱图 分别计算华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分离度R，重复5次计算R平均值。
[0133] 5、试验结果：
[0134] 试验结果如图5所示，其中R值如表12所示。
[0135] 表12流动相优化试验结果
[0136]
[0137] 试验结果表明，在梯度1～4的洗脱条件下，R平均值均大于1.5，其中梯度4相比于其他三组，分离 度更好，基线更平稳，而且在保留时间50～60min的杂峰相应值更低，对检测结果影响更少，为优选流动 相梯度。
[0138] 实施例6：液相条件确定
[0139] 1、色谱条件
[0140] 色谱柱为SynergiTM Hydro-RP，4.6×250mm，4μm；以0.02％磷酸乙腈为流动相A，0.02％磷酸水为流 动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为
203nm；流柱温为30℃，流速为1.30 mL/min。
203nm；流柱温为30℃，流速为1.30 mL/min。
[0141] 表2流动相梯度
[0142]
[0143] 2、供试品溶液的制备
[0144] 取本品40丸，精密称定，压破薄膜衣，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，超声处理30min， 取出，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
[0145] 3、对照品溶液的制备
[0146] 取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、丹酚酸B、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品加甲醇制成对照品溶液， 进行定性研究。
[0147] 4、测定法
[0148] 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。
[0149] 5、实验结果
[0150] 实验结果如图6所示，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、丹酚酸B、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基峰形尖锐， 分离度好，具备构建特征图谱的分离度和出峰数条件。
[0151] 实施例7：优化液相条件与单味药材液相条件检测麝香通心滴丸成分对比[0152] 1、供试品制备、对照品制备：按照实施例6的方法制备。
[0153] 2、试验方法：采用现有技术柳阳在《丹参等八味常用中药饮片质量控制研究》(湖北中医药大学，2019) 中采用的液相条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱(0～15min，10％A→17％A； 15～18min，17％A→25％A；18～36min，25％A→30％A；36～39min，30％A→57％A；39～48min， 57％A→61％A；48～53min，61％A→70％A；53～
58min，70％A→75％A；58～65min，75％A→90％A； 65～70min，90％A)，流速1.0mL·min-1，柱温25℃，检测波长270nm。采用SynergiTM Hydro-RP(250mm×4.6 mm，5μm)色谱柱。
58min，70％A→75％A；58～65min，75％A→90％A； 65～70min，90％A)，流速1.0mL·min-1，柱温25℃，检测波长270nm。采用SynergiTM Hydro-RP(250mm×4.6 mm，5μm)色谱柱。
[0154] 采用实施例6条件下的液相条件，进行对照。
[0155] 3、试验结果
[0156] 试验结果如图7所示。结果表明，该现有技术液相条件下无法检测出人参皂苷，同时在20min～30min 和40min～50min无法实现色谱峰有效分离，单味饮片的液相条件不适合麝香通心滴丸成分的检测，本发 明提供的检测波长、流动相、洗脱梯度等组合形成的麝香通心滴丸液相色谱条件解决了现有技术中人参皂 苷、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基色谱峰无法同时检测和分离的问题。
[0157] 实施例:8：麝香通心滴丸特征图谱特征峰确定
[0158] 取麝香通心滴丸15批次，均来自内蒙古康恩贝制药圣龙分公司。按实施例6的液相条件进行供试品、 对照品准备和液相条件准备。
[0159] 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图，得到麝香通心滴丸 的HPLC特征图谱。15批次色谱图共有峰如图8-1所示，15批次的麝香通心滴丸共有的10个色谱峰，确 定了以6号峰丹酚酸B为参照峰，并进一步计算了各批次各个特征峰与参照峰(丹酚酸B，峰6)的相对 保留时间，如表13。
[0160] 表13 10个色谱峰的相对保留时间
[0161]
[0162] 采用标准品对照对最主要色谱峰进行鉴别，采用15批次麝香通心滴丸相对保留时间，相对保留时间 应在规定值的±5％以内。峰1～峰10的化合物归属如表14所示，特征图谱如图8-2所示。
[0163] 表14麝香通心滴丸相对保留时间平均值
[0164]
[0165] 采用色谱峰面积与浓度对比计算待测样品浓度，计算公式如下：
[0166] 成分含量(μg/丸)＝对照品浓度*样品峰面积*对照进样量/(对照峰面积*样品进样量)*定容体积/丸 数。部分计算结果如表15所示。
[0167] 表15麝香通心滴丸部分定量成分计算结果
[0168]
[0169] 该液相条件获得的特征图谱归属了10个特征峰，包括丹参、人参茎叶总皂苷和蟾酥的有效成分，实 现了组方中多味药材的同步定量检测，尤其是同步检测了丸剂中含量较少的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re， 完成华蟾酥毒基与脂蟾毒配基的有效分离。对药典中有定量要求人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，以及华蟾 酥毒基和脂蟾毒配基进行的定量检测，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和在35～70μg/丸范围内，满足药 典要求。
[0170] 实施例9：麝香通心滴丸特征图谱的方法学考察
[0171] 1、专属性考察
[0172] 取麝香通心滴丸辅料，按实施例6的供试品制备法制备；称取40丸麝香通心滴丸，按实施例6的方 式进行供试品、对照品制备，按其液相条件进行测定，记录色谱图。
[0173] 试验结果如图9所示，辅料并未对样品色谱峰有干扰，说明该特征图谱专属性好。
[0174] 2、精密度试验
[0175] 取麝香通心滴丸，按实施例6的方式进行供试品、对照品制备，按其液相条件进行测定，连续进样6 次，记录色谱图。以6号峰(丹酚酸B)为参照峰，计算各特征峰与参照峰(丹酚酸B)的相对保留时间 的RSD，结果各特征峰的相对保留时间，RSD均小于2％，见表16。试验结果表明，该特征图谱的方法精 密度高。
[0176] 3、稳定性试验
[0177] 取麝香通心滴丸，按实施例6的方式进行供试品、对照品制备，按其液相条件，分别于0h、3h、6h、 12h、24h和36h进样测定，记录色谱图。以6号峰(丹酚酸B)为参照峰，计算各特征峰与参照峰(丹 酚酸B)的相对保留时间。结果表明，各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％，见表16。试验结果表明 该特征图谱的方法稳定性好。
[0178] 表16精密度、稳定性试验
[0179]
[0180] 4、重复性试验
[0181] 取同一批次麝香通心滴丸，按实施例6的方式制备6份供试品，进样测定，记录色谱图。以6号峰(丹 酚酸B)为参照峰，计算各特征峰与参照峰(丹酚酸B，峰6)的相对保留时间。结果表明，各特征峰的 相对保留时间RSD均小于3％，见表17。试验结果表明，该特征图谱的方法重复性好。
[0182] 表17重复性试验
[0183]
[0184] 5、耐用性试验
[0185] 5.1柱温考察
[0186] 取麝香通心滴丸，按实施例6的方式制备6份供试品，按实施例6液相条件在柱温29℃、30℃和31℃ 分别进样测定，记录色谱图。以6号峰(丹酚酸B)为参照峰，计算各特征峰与参照峰(丹酚酸B)的相 对保留时间，结果表明各特征峰的相对保留时间的RAD均小于3％，见表18。试验结果表明，柱温29℃ ～31℃满足特征图谱的构建要求。
[0187] 表18不同柱温下的相对保留时间
[0188]
[0189] 5.2流速考察
[0190] 取麝香通心滴丸，按实施例6的方式制备6份供试品，按实施例6液相条件在1.28mL/min、1.3mL/min、 1.32mL/min流速下分别进样测定，记录色谱图。以6号峰(丹酚酸B)为参照峰，计算各特征峰与参照峰 (丹酚酸B)的相对保留时间，结果各特征峰的相对保留时间的RAD均小于1％，见表19。试验结果表明， 流速1.28mL/min～1.32mL/min满足特征图谱的构建要求。
[0191] 表19不同流速下相对保留时间
[0192]
[0193] 实施例9：不同批次麝香通心滴丸的特征图谱相似度评价
[0194] 利用特征图谱进行麝香通心滴丸的质量监控，具体方法包括以下步骤：
[0195] 1、取15批麝香通心滴丸样品按实施例6的方法制备供试品溶液并构建待测麝香通心滴丸样品的特征 图谱；
[0196] 2、将图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件，以实施例8特征图谱共有模式为对照， 计算各批次样品相似度。
[0197] 实验结果表明，15批麝香通心滴丸与实施例8特征图谱相似度均在0.90以上，说明各批次麝香通心 滴丸质量稳定。
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