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使用N-甲基葡糖酰胺及其衍生物灭活病毒的方法

阅读：441发布：2020-05-08

专利汇可以提供使用N-甲基葡糖酰胺及其衍生物灭活病毒的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开内容涉及用于灭活病毒的方法。用N-甲基葡糖酰胺灭活病毒的方法适用于生物活性药物，例如蛋白质亚基、蛋白质(酶，因子等)、重组蛋白、抗体、疫苗或基因疗法产品的纯化过程。此方法中使用的去污剂基于多个N-甲基葡糖酰胺同系物，该同系物由通过酰胺键连接的亲水性葡萄糖部分和疏水性脂肪酸尾部组成。另外，这些基于糖的去污剂本质上是非离子的，其不破坏药物蛋白质、血浆生物制剂、非有包膜的病毒疫苗或腺相关病毒颗粒。纯化具有未鉴定的有包膜的病毒污染物的目标生物产物溶液的方法，包括将目标生物产物溶液与标准溶液一起温育，灭活步骤(a)的生物产物溶液中存在的任何潜在的有包膜的病毒污染物，测量步骤(b)的最终溶液中存在的灭活的病毒，将分开的目标生物产物溶液与N-甲基葡糖酰胺溶液一起温育，测量步骤(d)的最终溶液中存在的灭活的病毒，并比较步骤(c)和步骤(e)的最终溶液的结果。，下面是使用N-甲基葡糖酰胺及其衍生物灭活病毒的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.纯化具有未鉴定的有包膜的病毒污染物的目标生物产物溶液的方法，所述方法包括：
(a)将所述目标生物产物溶液与N-甲基葡糖酰胺溶液一起温育；
(b)灭活所述生物产物溶液中存在的任何潜在的有包膜的病毒污染物；并且(c)纯化所述生物产物溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述有包膜的病毒包含RNA或DNA病毒、单链或双链病毒。
3.如权利要求1所述的方法，其中有包膜的病毒已经掺入所述生物产物溶液中。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述病毒还包含逆转录病毒。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒属于选自下组的病毒科的一种或多种：逆转录病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、纤丝病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、杆状病毒科和痘病毒科。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述有包膜的病毒包括异向性白血病病毒、伪狂犬病病毒或牛病毒性腹泻病毒。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述N-甲基葡糖酰胺由通过酰胺键与无环亲水性葡萄糖糖部分连接的具有n(n≥3)的碳长度的脂肪酸疏水链构成。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述N-甲基葡糖酰胺选自下组：Mega8、Mega 9、Mega
10、Mega 11和Mega 12。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述生物产物选自下组：重组蛋白、抗体、细胞因子、血浆蛋白、疫苗溶液、核酸治疗剂和基因疗法产物。
10.如权利要求1所述的方法，其中从真核细胞产生所述生物产物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述真核细胞包括哺乳动物细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其中从原核细胞产生所述生物产物。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述N-甲基葡糖酰胺溶液的浓度在临界胶束浓度(CMC)的0.5至10.0倍的范围内。
14.如权利要求1所述的方法，其中在低温下完成所述温育步骤。
15.如权利要求8所述的方法，其中在1至37摄氏度的温度范围内进行所述温育步骤。
16.灭活有包膜的病毒溶液中的有包膜的病毒的方法，其包括：
(a)对所述有包膜的病毒溶液添加N-甲基葡糖酰胺溶液，并且
(b)灭活所述有包膜的病毒溶液中的所述有包膜的病毒。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述有包膜的病毒已经掺入所述生物产物溶液中。
18.纯化具有未鉴定的有包膜的病毒污染物的目标生物产物溶液的方法，其包括：
(a)将目标生物产物溶液与标准溶液一起温育；
(b)灭活步骤(a)的生物产物溶液中存在的任何潜在的有包膜的病毒污染物；
(c)测量步骤(b)的最终溶液中存在的经灭活的病毒；
(d)将分开的目标生物产物溶液与N-甲基葡糖酰胺溶液一起温育；
(e)测量步骤(d)的最终溶液中存在的经灭活的病毒；
(f)比较步骤(c)和步骤(e)的最终溶液的结果。

说明书全文

使用N-甲基葡糖酰胺及其衍生物灭活病毒的方法

[0001] 发明背景

[0002] 生物治疗剂是从涉及任何种类的生物学起源的原材料，即细胞系、细胞培养液和组织或体液的过程产生的分子。生物衍生的治疗剂的制造是复杂的过程，其需要许多纯化步骤以确保安全性。考虑到沿途的每个步骤或过程可能存在微生物污染，它是尤其重要的。在重组蛋白产生的情况下，生物治疗剂通常通过培养工程化的人或动物衍生的细胞[即，中国仓鼠卵巢(CHO)或幼仓鼠肾(BHK)细胞]或杂交瘤细胞(即NS0)，以及进行纯化过程的一系列单元操作来制备，所述人或动物衍生的细胞包含含有目的基因(GOI)的质粒DNA。公知的是，CHO和BHK(Chan,S.Y.,1994,Wang G.等人1999和Suzuki A.等人1982)细胞具有编码内源逆转录病毒样颗粒(ERVLP)的染色体整合的原病毒元件。从全血或血浆中制备生物治疗制剂面临着血源性病原体，即乙肝病毒(HBV)、丙肝(HCV)病毒等污染原材料的挑战。此外，偶发物质可以引入制造中间体中，这对生产带来了更多挑战。迄今为止，存在有许多关于生物反应器病毒污染事故的报道(Hsieh,W.T.等人2008,Qiu Y.等人,2013)。特别地，很多年来病毒的灭活和/或除去已困扰生物制品业。一些原因包括衍生病毒的来源的可变性以及小的尺寸。

[0003] 病毒分为有包膜的和非有包膜的组。内源逆转录病毒样颗粒是有包膜的并在CHO和BHK细胞及其相关培养液中发现，这对进一步纯化步骤、设施、仪器和环境产生污染的风险。尽管使用目前的方法尚未观察到传染性，但内源逆转录病毒样颗粒对患者和行业呈现潜在的风险。由于所有这些原因，从生产过程中快速且有效地灭活和/或除去这些污染物变得越来越重要。

[0004] 去污剂已经在多种阵列和测定法中作为灭活病毒中的重要工具使用。从二十世纪80年代开始，去污剂已经提高血液样本池的安全性，对于需要输血或血液成分，例如血浆衍生的治疗产品的患者和处理样本的实验室人员。最近，去污剂已被广泛用于具有潜在病毒感染风险的生物治疗剂和/或疫苗的生产过程中。在生物药物制造中，用于有包膜的病毒灭活的最充分表征且高度有效的去污剂是非离子去污剂，例如Polysorbate(Tween-20，Tween-80)、Triton X-100(也称为Octoxinol-10)和磷酸三正丁酯(TnBP，经常与
Polysorbate或Triton X-100一起用作溶剂)。Polysorbate在环境条件下但是在相对较高的浓度下高度有效，但是效力随温度降低而降低。因此，这些去污剂可能不是制造需要较低温度条件的生物材料的最佳选择，所述较低温度条件对于稳定生物活性和分子结构是重要的。

[0005] Triton X-100(也是Octoxinol、Octoxinol-3、Preceptin)是一种在灭活病毒中经典的、完善建立的有效去污剂。Triton X-100及其衍生物在非常低的温度下是高度有力的。已经表征了Triton-X 100的辛基酚成分与雌激素受体相互作用，导致暴露的动物的生殖影响。含有Triton X-100的生物过程废物会造成负面后果，特别是如果直接排放到环境中，对水生生命造成负面后果。从生物过程废物中处理或回收Triton X-100将是非常昂贵且麻烦的。寻求有效灭活病毒而不改变生物活性药物的新的环境友好的去污剂(或非生态毒性)一直是许多生物制药业的优先考虑。因此，发现有效、稳健且更加环境安全的去污剂一直是生物制药行业的高度优先。

[0006] 发明概述

[0007] 本方法的实施方案包括纯化具有未鉴定的有包膜的病毒污染物的目标生物产物溶液，包括将所述目标生物产物溶液与N-甲基葡糖酰胺溶液一起温育，灭活所述生物产物溶液中存在的任何潜在的有包膜的病毒污染物，并纯化生物产物溶液。

[0008] 纯化具有未鉴定的有包膜的病毒污染物的目标生物产物溶液的方法，包括将目标生物产物溶液与标准溶液一起温育，灭活步骤(a)的生物制物溶液中存在的任何潜在的有包膜的病毒污染物，测量步骤(b)最终溶液中存在的经灭活的病毒，将分开的目标生物产物溶液与N-甲基葡糖酰胺溶液一起温育，测量步骤(d)最终溶液中存在的经灭活的病毒，并比较步骤(c)和步骤(e)的最终溶液的结果。

[0009] 附图简述

[0010] 技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图不意图以任何方式限制本教导或权利要求书的范围。

[0011] 图1显示了用于有包膜的病毒的去污剂破坏的理论通用机理。有包膜的病毒诸如逆转录病毒具有二十面体形的核壳体，其被源自宿主细胞和病毒的病毒包膜保护。每个去污剂分子具有亲水性头部和疏水性尾部，从而导致其两亲性结构。两个部分决定了临界胶束浓度(CMC)，其是每种去污剂的特异性特性。去污剂单体可以在规定CMC下插入病毒包膜内，并且可以干扰或不干扰病毒对宿主的附着。相反，在CMC或以上的浓度，较多的去污剂单体可以插入包膜中并引起包膜的破坏，从而使病毒无法与其宿主细胞表面上的受体结合。

[0012] 图2显示了N-甲基葡糖酰胺去污剂的疏水(非极性)和亲水(极性)区域。

[0013] 图3显示了N-甲基葡糖酰胺去污剂同系物的二维(2D)和三维(3D)结构。类似地，每种化合物由通过与无环亲水性葡萄糖糖部分进行酰胺键合连接的由8-10或12个碳组成的疏水性脂肪酸链构成。

[0014] 图4显示了当将重组FVIII(rFVIII)个别与0.5x、1x、2x CMC的Mega 8、Mega 9、Mega 10和Mega 12一起温育时在室温在30分钟内完全灭活X-MuLV。

[0015] 图5显示了当将重组FVIII(rFVIII)分别与1x和2x CMC的每种去污剂(Mega 8、Mega 9、Mega 10和Mega 12)一起温育时在2.0℃在30分钟内完全灭活X-MuLV。

[0016] 图6显示了当在2.0℃在重组FVIII(rFVIII)中温育30分钟时，通过0.3％(w/v)Mega 10和0.3％(w/v)Triton X-100实现X-MuLV完全灭活，证明了两种去污剂的类似的效力。

[0017] 图7显示了重组FVIII(rFVIII)即使与水或Mega 10于2.0℃温育2小时后仍维持其活性。

[0018] 图8显示了在2.0℃与X-MuLV和增加浓度的Mega 10一起温育30分钟的重组FVIII(rFVIII)的剂量响应。剂量响应曲线显示了随着糖去污剂浓度增加，X-MuLV的效价成反比下降至检测不到病毒的检测限(LOD)。rFVIII对照(Ctrl)虚线对应于仅与X-MuLV一起温育的rFVIII的效价。

[0019] 图9显示了在2.0℃与X-MuLV和0.3％(w/v)Mega 10温育0、5、15、30、60和120分钟的重组FVIII(rFVIII)的动力学。Mega 10处理导致病毒效价立即下降(完全灭活)，达到检测不到病毒的检测限(LOD)，这与仅rFVIII和仅培养基的对照相反。

[0020] 图10显示了于2.0℃与高效价的X-MuLV储液及0.02％、0.10％或0.20％(w/v)Mega 10温育0、5、30、60和120分钟的重组FVIII(rFVIII)的动力学。0.10％(w/v)的Mega 10导致病毒效价降低，而0.20％(w/v)导致病毒效价的立即降低(完全灭活)，在5分钟内达到检测不到病毒的检测限(LOD)，与观测不到病毒灭活的0.02％(w/v)的Mega 10，rFVIII和仅培养基的对照样品相反。

[0021] 图11显示了不同的制造的Mega 10分子产生相似且可再现的剂量响应结果。

[0022] 图12显示了当在重组FVIII(rFVIII)中在2.0℃在15分钟内温育时通过0.2和0.3(w/v)Mega 10将猪伪狂犬病病毒(PRV)灭活至检测限。

[0023] 图13显示了当在重组FVIII(rFVIII)中在2.0℃温育30分钟时通过0.2、0.3和0.4(w/v)Mega 10和1.0％(w/v)Mega 9将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)完全灭活至检测限。

[0024] 图14显示了当在2.0℃与人免疫球蛋白G(IgG)和人血浆蛋白溶液中的0.2、0.3和0.4％(w/v)Mega 10温育30分钟时将X-MuLV完全灭活到检测限。制备这两种蛋白质溶液，使得每种具有30mg/mL的终浓度。

[0025] 图15显示了用单独的Mega 10(M10)、单独的Tween 20(Tw20)和Mega 10与Tw20混合物以浓度0.05％(w/v)、0.10％(w/v)或0.30％(w/v)，Mega 10与或不与0.01％(w/v)、0.02％(w/v)或0.06％(w/v)Tw20的X-MuLV的灭活。在0.30％(w/v)单独的M10或0.30％(w/v)M10+0.06％(w/v)Tw20混合物的浓度下，在30分钟内完全灭活X-MuLV。

[0026] 图16显示了以浓度0.05％(w/v)或0.30％(w/v)用单独的Mega 10(M10)、单独的磷酸三正丁酯(TnBP)和Megan 10与TnBP混合物(1:1)的X-MuLV灭活。在0.30％(w/v)单独的M10或0.30％(w/v)M10+0.30％(w/v)TnBP混合物的浓度下，在30分钟内完全灭活X-MuLV。令人感兴趣的是，0.05％(w/v)M10+0.05％(w/v)TnBP的病毒效价降低(但未完全灭活)，指示Mega 10和TnBP之间可以具有协同效应。剩余的去污剂处理未产生病毒灭活，因为病毒效价与rFVIII对照(无去污剂)相当。

[0027] 图17显示了在含或不含550mM NaCl的情况下用0.06％(w/v)、0.10％(w/v)或0.20％(w/v)Mega 10或0.30％(w/v)、0.51％(w/v)或0.71％(w/v)的Mega9的X-MuLV灭活。
在0.20％(w/v)的单独的Mega 10、0.20％(w/v)的Mega 10+NaCl和0.71％(w/v)的含和不含
500mM NaCl的Mega 9的浓度，显著灭活X-MuLV。0.10％(w/v)Mega 10+550mM NaCl和0.51％(w/v)Mega 9+500mM NaCl的病毒效价降低，指示Mega 10或Mega 9和NaCl之间可以有一些协同作用。剩余的去污剂处理未产生病毒灭活，因为病毒效价与rFVIII对照(无去污剂)和NaCl对照(无去污剂)相当。

[0028] 发明详述

[0029] 本公开内容提供了与病毒灭活有关的方法和组合物。

[0030] 定义

[0031] 为了解释本说明书，将适用以下定义。若下文列出的任何定义与任何其它文献(包括通过引用并入本文的任何文献)中该文字的用法矛盾，则为了解释本说明书及其相关的权利要求书，应当以下文列出的定义为准，除非清楚意指相反意义(例如在最初使用术语的文献中)。

[0032] 只要适用，单数形式的术语也应包括复数形式，且反之亦然。除非另有说明或者在使用“一个或多个”显然不合适的情况下，否则本文使用“一个”表示“一个或多个”。除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。“包含”、“包括”的使用是可互换的，并且不是限制性的。术语“诸如”、“例如”和“如”也并不意图是限制性的。例如，术语“包括”应表示“包括但不限于”。

[0033] 如本文所用，术语“约”是指所提供的单位值的+/-10％。

[0034] 如本文所用，术语“基本上”是指表现出目标特征或特性的整体或近似程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，由于许多影响生物学和化学成分和材料的测试、生产和储存的变量，且由于用于测试、生产和储存生物学和化学成分和材料的仪器和设备的固有误差，生物学和化学现象很少(如果有的话)获得或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。

[0035] 自二十世纪80年代以来，去污剂已经用作灭活从血液供体收集的合并血液中的病毒的必需工具。该过程对于接受血液、血浆或血液/血浆衍生的成分，例如血浆衍生的凝血因子VIII(pdFVIII)的患者的安全性是重要的。另外，此纯化措施为直接参与临床实验室或血浆衍生的生物产品(PDBP)制造设施中血液处理的人员增加安全性。最近，对于包括动物衍生的材料的生物治疗剂或疫苗的生物制药制造工艺，该实践也已变得不可或缺。动物衍生的材料(即哺乳动物细胞中产生的血液、血浆、组织和蛋白质)可携带内源性病毒，或容易被外来病毒污染。因此，药物制造过程包括一系列有效的病毒灭活(即溶剂去污剂、低pH值和热处理)和除去技术(即病毒过滤)，以确保患者接受无病毒治疗。这些过程对于生物学衍生的治疗剂或疫苗产品的安全公开推广是至关重要的。非常需要提高这些产品的效率、稳健性和最重要地总体安全性的新颖方法。为了满足这些需求，在本公开内容中表征了使用生态友好的基于N-甲基葡糖酰胺基的去污剂的新方法。

[0036] 去污剂是由亲水(极性)头基和疏水(非极性)尾基组成的两亲性分子。此种通用结构允许在水溶液中去污剂与其他分子，最值得注意的是蛋白质或有包膜的病毒的相互作用。在基础科学和应用技术中，去污剂可用作增溶剂或稳定剂，以防止生物分子聚集或增溶来自细胞培养物或组织悬浮液的膜蛋白。当用于增溶蛋白质时，以下特性使某些去污剂比其他去污剂更可取：1)缺乏电荷的去污剂(非离子去污剂)有助于保留目标蛋白质的结构和活性，2)具有低临界胶束浓度(CMC)的去污剂允许通过透析容易除去去污剂；3)去污剂是澄清的，因此不影响蛋白质吸收性读数；和4)去污剂是高纯度的，减少实验与实验的变异性。类似地，在选择用于病毒灭活的去污剂候选物时，这些特性中的大多数都适用，因为有必要不破坏蛋白质药物、检测蛋白质浓度而不受去污剂的干扰，并确保去污剂是高纯度的，从而始终发生病毒灭活。

[0037] 通常，有包膜的病毒的灭活取决于特定去污剂的两亲性结构和临界胶束浓度(CMC)。CMC是指去污剂单体聚集形成胶束结构的浓度。在水溶液中，随着较多去污剂单体接触，亲水性头部可以邻接，从而使疏水性尾部遮蔽水溶液，最终组织成胶束结构。CMC可能与特定条件下给定去污剂发生病毒灭活的浓度联系。病毒灭活的理论机制是在去污剂CMC下单体插入病毒包膜中，这可能对病毒有害。一旦浓度达到或高于CMC，膜中存在的这些去污剂单体形成胶束，其可以破坏完整性或完全剥夺病毒包膜。在没有病毒包膜的情况下，病毒无法与其宿主细胞质膜上的受体结合并促进其复制和传播。

[0038] 迄今为止，生物治疗制造业已使用许多去污剂来灭活有包膜的病毒。流行的非离子型去污剂之一Triton X-100在灭活有包膜的病毒而不破坏蛋白药物方面非常有效。在生物制药制造过程中使用Triton X-100后，将其丢弃到废水处理厂中或直接释放到水生环境中(Madsen et al,1996,JAOCS,73:929-933)。不幸的是，Triton X-100副产物包含辛基酚，其可模仿雌激素受体底物，并可以负面影响动物(尤其是水生生命)的生殖系统。因此，该去污剂被许多国家视为对环境有毒的化学物质，这些国家开始禁止其使用。许多生物制药行业一直致力于寻找与Triton X-100具有相当功效的环境更安全的去污剂。例如，Biogen,Inc.和Genentech,Inc.分别观察了月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)和烷基葡糖苷(Conley等人,2014,美国专利#W02014025771A2；Conley等人,2016,Biotechnol.Bioeng.,Epub提前印刷；Fisher等人,2016,美国专利#20160333046A1)。尽管这些公司已经能够区分不同类别的新型去污剂，但是在有包膜的病毒的灭活中，本实施方案定义了一种完全新的且高度有效的非离子去污剂类别，N-甲基葡糖酰胺(也称为脂肪酸糖)。

[0039] 基于糖的去污剂具有出色的物理性能，可高度生物降解且无毒，这有助于其安全性概况，特别对于水生环境(Bogdan，2007；Stalmans等人，1993)。因此，公开的实施方案聚焦于使用基于糖的去污剂N-甲基葡糖酰胺作为在生物活性药物制备中灭活病毒的新方法。

[0040] N-甲基葡糖酰胺是非离子型去污剂，其由通过酰胺键连接的高度亲水性葡萄糖部分和疏水性脂肪酸链构成。这些去污剂是生态友好的，因为已知它们是高度生物可降解的，具有约95％的可再生碳指数，并且认为尤其对水生生命无毒(Stalmans等人，1993，SOFW,119:794-808)。由于其提高的安全性概况和优异的物理特性，这些去污剂对于基础科学技术中的用途以及对于洗发水和洗碗皂中的用途引起了极大兴趣。同样，这些去污剂可以是生物衍生药物产品进行病毒灭活的主要候选物。

[0041] 大多数重组蛋白是通过遗传工程化哺乳动物细胞(即CHO和BHK)的发酵产生的。已知这些细胞具有染色体整合的逆转录病毒原病毒基因或元件，它们产生内源性逆转录病毒样颗粒(ERVLP)，其是缺乏确认的传染性的有包膜的病毒颗粒。为了证明ERVLP的灭活，使用X-MuLV作为内源性逆转录病毒的特定模型，并且当前用作实验室工具，以通过掺入样品来评估制造纯化过程，所述样品通过给出的单元操作进行任何灭活或除去。因此，公开的实施方案将使用此种新的使用N-甲基葡糖酰胺来灭活有包膜的病毒如X-MuLV的方法。基于X-MuLV模型，所有其他有包膜的病毒都应易于N-甲基葡糖酰胺灭活影响，包括疱疹病毒、黄病毒、丝状病毒等。此外，此新方法适用于整个药物纯化过程中的任何步骤，其可以涉及去污剂除去步骤，例如透析或柱层析。

[0042] 通常，用此种新类别的去污剂进行病毒灭活涉及用N-甲基葡糖酰胺测试掺入蛋白质样品(即重组凝血因子VIII、人IgG抗体和血浆成分)中的X-MuLV实验室菌株，并在2-8℃温育样品30分钟，然后在指定的细胞系(即PG-4、Vero或EBTr细胞系)上对反应管进行实验以观察病毒感染。测试N-甲基葡糖酰胺的系统方法开始于在各种条件下进行初步筛选，然后进行蛋白质活性评估、剂量响应研究、用高效价和低效价病毒储液的动力学研究、多种病毒和生物学应用、和最后多制造商比较以确保一致性。初始筛选条件基于经典Triton X-100去污剂的历史数据，其中在2-8℃、120分钟内和0.1至0.3％(w/v)范围的灭活浓度，病毒灭活是成功的。为了确保新去污剂与已知的有力去污剂(Triton X-100)是相当的，选择低温和30分钟和120分钟的温育时间来初步筛选N-甲基葡糖酰胺。评估的浓度基于每种新去污剂的CMC。然后，使用生色测定试剂盒评估在灭活有包膜的病毒方面最有效的N-甲基葡糖酰胺候选物对人凝血因子VIII活性的任何影响。然后，对N-甲基葡糖酰胺评估对增加浓度的N-甲基葡糖酰胺的其相应的剂量响应，所述浓度就每种个别去污剂而言在0.014-01.0％(w/v)的范围内。为了评估如何快速地发生灭活，使用低和高效价病毒制剂两者用N-甲基葡糖酰胺进行动力学研究。为了增加整个过程中生成的数据的可信度，在相似的条件下测定多个供应商来源，以证明所测试的N-甲基葡糖酰胺的一致性和可靠性。最后，为了评估N-甲基葡糖酰胺在其他血液或血浆相关基质中是否仍然有效，在相似条件下在人免疫球蛋白G和人血浆中测定病毒灭活。总之，此种系统性方法使公开的实施方案能够证明N-甲基葡糖酰胺在纯化过程中的适用性。

[0043] 用N-甲基葡糖酰胺灭活病毒的此种方法适用于生物活性药物，例如蛋白质亚基、蛋白质(酶，因子等)、重组蛋白质或抗体的纯化过程。此方法中使用的环境更安全(也称为无生态毒性)的去污剂基于多个N-甲基葡糖酰胺同系物，该同系物由通过酰胺键连接的亲水性葡萄糖部分和疏水性脂肪酸尾部组成。由于在N-甲基葡糖酰胺中没有已知的毒性中间体，例如辛基酚，因此在生物制剂生产中使用时，它消除了与环境关注相关的风险。另外，这些基于糖的去污剂本质上是非离子的，其不应破坏目的药物蛋白。此方法涉及将N-甲基葡糖酰胺与生物产物一起温育以灭活任何潜在的有包膜的病毒污染物。为了评估通过此种方法的病毒减少，将模型有包膜的病毒(例如异向性白血病病毒、假狂犬病病毒和牛病毒性腹泻病毒)掺入蛋白药物样品(例如天然蛋白、重组蛋白、抗体)中，并与N-甲基葡糖酰胺温育。温育后，进行TCID50测定法以确定病毒效价和对照减少因子(LRF)，其是未处理的对照和N-甲基葡糖酰胺处理的样品之间的病毒感染性效价的差异。此外，用N-甲基葡糖酰胺灭活有包膜的病毒与行业标准品Triton X-100相当。总之，这些优异的特性使N-甲基葡糖酰胺成为生物衍生的药物产品纯化过程中的有力工具。

[0044] 材料

[0045] 实施例1-病毒储液：

[0046] 分别在Bayer病原体安全性实验室(Berkeley,CA)或由Bioreliance Inc.(Rockville,MD)内部制备低效价和高效价的异向性鼠白血病病毒(X-MuLV)储液pNFS Th-1株。由Bioreliance Inc.(Rockville，MD)制备高效价猪伪狂犬病病毒(PPV)储液Aujeszky株。也由Bioreliance Inc.(Rockville，MD)制备高效价牛病毒性腹泻病毒(BVDV储液，NADL株。

[0047] 实施例2-细胞系：

[0048] 猫PG-4细胞(S+L-)(ATCC CRL-2032)，非洲绿猴肾Vero细胞(ATCC CCL-81)和胚牛气管EBTr细胞(ATCC CCL-44)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，www.atcc.org)。

[0049] 实施例3-细胞培养基和补充剂：

[0050] 用于PG-4、Vero和ETBr细胞的培养基是McCoy的5A(Lonza,12-688F,Slough,UK)和Minutesimum必需培养基Eagle(Corning，10-010-CV，Manassas，VA)。使用以下生长培养基补充剂：胎牛血清(FBS)(Hyclone，SH30070.03，Logan，UT)，100x青霉素/链霉素(P/S)(Corning，30-002-Cl，Manassas，VA)和200mM L-Glutaminutese(L-Glu)(MP Biomedicals，1680149，Solon，OH)。

[0051] 实施例4-化学品：

[0052] 使用化学品海美溴铵(Polybrene)(Sigma-Aldrich，H9268-5g，St.Louis，MO)来提高PG-4细胞中X-MuLV感染的效率，并以3μg/ml终浓度添加到McCoy的5A培养基。在这项研究中表征的非离子型去污剂是辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 8)(G-Biosciences,DG017,St.Louis,MO或Sigma或Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 9)(G-Biosciences,DG019,St.Louis,MO或Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 10)(G-Biosciences,DG021,St.Louis,MO或Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，十二烷酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 12)(Bachem,P-1175.0001,Torrance,CA)和P-叔-(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(Triton X-100)(EMD Millipore,1086432500,Billerica,MA)。

[0053] 生物溶液：

[0054] 在存在由重组人因子VIII(rFVIII)(全长野生型，Bayer内部制备)，人IgG或血浆蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)组成的生物产物溶液的情况下进行每种病毒灭活测定法。

[0055] 方法

[0056] 实施例1-去污剂的制备

[0057] 以每体积5％重量(w/v)储液的目标浓度制备Mega 8、Mega 9、Mega 10和Mega 12去污剂。每种去污剂从制造商以粉末形式获得，并进行适当称重并允许溶于Milli-Q水中。若去污剂在室温下未完全溶解，则将溶液在≤37℃的水浴(Mega 10和Mega 12)中加热约
10–15分钟。最初，5％Mega 12在≤37℃时未溶解，因此置于≤60℃水浴中，并在30分钟后溶解。由于Mega 12的临界胶束浓度为0.013％，因此可能的是至少10倍的储备溶液将方便用于病毒灭活。因此，在Milli-Q水中以0.15％的浓度制备新储备溶液，其允许混合物在置于≤60℃的水浴中(约15分钟)时更快变为溶液。将去污剂储存在2-8℃的黑暗容器中。

[0058] 实施例2-Mega 8、Mega 9、Mega 10和Mega 12病毒灭活筛选

[0059] 对N-甲基葡糖酰胺去污剂(Mega 8、Mega 9、Mega 10和Mega 12)评估其在重组因子VIII(rFVIII)治疗药物的典型制造条件下有效且稳健灭活异向性鼠白血病病毒(X-MuLV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)或牛病毒性腹泻疾病病毒(BVDV)的能力。每种去污剂测试的浓度分别基于临界胶束浓度(CMC)的0.5x、1x或2x。将每种去污剂与不含去污剂的rFVIII蛋白一起温育，并以1:11的比例用高效价X-MuLV储液掺入，并在2.0±1.0℃温育30分钟。包括仅含rFVIII的阳性对照样品，并在2.0±1.0℃温育0和30分钟。在每个温育时间点后，将40μL的每种灭活样品或对照取出，并且转移至含有4.0ml基础培养基(即，对于X-MuLV或EMEM，每ml补充有3μg Polybrene(MP)的McCoy的5A培养基)的15mL管。此1:101稀释因子淬灭允许将去污剂稀释超出对指示细胞系的毒性作用，并且还允许在进行TCID50测定法必需的范围内稀释病毒。简而言之，通过在MP或EMEM中以1:3.2倍连续滴定每个淬灭样品，直到第11个稀释水平来进行评估病毒感染性的TCID50测定法。以8个重复用每个稀释100μL淬灭且连续稀释的样品或基础培养基接种96孔细胞培养板中每孔以3,000个细胞前1天接种的指示细胞单层。在37℃温育1.5-2.5小时后，将100μL由补充有4％FBS、2％P/S和2％L-Glu的基础培养基(对于PRV或BVDV的McCoy的5A或EMEM)组成的测定法培养基添加到板的每孔。然后，将细胞在37℃温育长达6-7天，并在光学显微术下观察细胞病变效应(CPE)的形成，其指示病毒感染。

[0060] 实施例3-评估人因子VIII活性的生色测定法

[0061] 在rFVIII基质中以0.3％(w/v)的浓度制备Mega 10(从Milli-Q H2O中制备的5.0％(w/v)储备溶液)，并在2.0±1.0℃温育120分钟。还制备仅掺入Milli-Q H2O的rFVIII基质的稀释液对照，并在相同条件下温育。温育后，将去污剂和稀释液对照与生色测定法(Chromogenix COATEST SP4 FVIII试剂盒，产品目录号：82409463)FVIII标准品和对照一起在1x测定缓冲液中稀释到合适的水平。将30μl每种去污剂、对照和标准品一式三份加载到96孔板上。根据制造商的方案添加生色测定试剂，并在37.0℃和5.0％CO2下温育8分钟。
在Molecular Devices SpectraMax M5微板阅读器上测量测定板的吸光度t 405和492nm。
使用SoftMax Pro v5分析数据。

[0062] 实施例4-rFVIII无Triton的基质中的剂量响应

[0063] 为了评估与rFVIII温育并掺入X-MuLV的Mega10去污剂的最低有效浓度，进行去污剂剂量响应研究。在重组FVIII(rFVIII)基质中制备每种去污剂的0.5％(w/v)样品，然后在rFVIII基质中进行1:2连续稀释，以得到每种去污剂的6个样品，范围为0.014-0.5％(w/v)。另外，包括仅含rFVIII基质的阳性对照样品。每种去污剂样品和对照以1:11的比例掺入低效价的X-MuLV储液，并在2.0±1.0℃温育30分钟。温育后，取出100μL的每种灭活样品和对照，并转移至含有3.0mL McCoy的5A培养基的管中，该培养基每ml补充有3μg的Polybrene(MP)。此1:31稀释因子淬灭允许将稀释剂稀释超出对指示细胞系(PG-4)的毒性作用，并且还允许在进行TCID50测定法必需的范围内稀释X-MuLV。简而言之，通过在MP中以1:3.2-h倍连续滴定每个淬灭样品，直到第11个稀释水平来进行评估X-MuLV感染性的TCID50测定法。以
8个重复用每个稀释100μL淬灭样品或MP接种每孔以3,000个细胞前1天接种的PG-4细胞单层。在37℃温育1.5-2.5小时后，使用100μL由补充有4％FBS、2％P/S和2％L-Glu的McCoy的
5A培养基组成的测定法培养基覆盖细胞。然后，将细胞在37℃温育长达6-7天，并在光学显微术下观察细胞病变效应(CPE)的形成，其指示X-MuLV感染。

[0064] 实施例4-病毒灭活动力学

[0065] 为了评估与rFVIII温育并掺入X-MuLV的Mega 10去污剂的灭活率，进行了病毒灭活动力学研究。在重组FVIII(rFVIII)的不含Triton的基质中制备Mega10的0.02％、0.10％、0.20％和0.30％(w/v)的样品。另外，包括仅含有rFVIII基质的阳性对照样品或仅培养基的对照。对每种去污剂样品和对照以1:11的比例掺入低效价和高效价的X-MuLV储液，并在2.0±1.0C温育0、5、15、30、60和120分钟。每次温育后，取出100或40μL的每种灭活样品和对照，并转移到15ml管中，该管含有每ml补充有3μg Polybrene(MP)的3.0mL或4.0mL McCoy的5A培养基。此种1:31(低效价X-MuLV)或1:101(高效价X-MuLV)稀释因子淬灭允许将去污剂稀释超出对指示细胞系(PG-4)的毒性作用，并且还允许在进行TCID50测定法所必需的范围内稀释X-MuLV。简而言之，通过在MP中将每个淬灭样品以1:3.2滴定直至第11个稀释水平来进行评估X-MuLV感染性的TCID50测定法。以8个重复用每个稀释100μL淬灭样品或MP接种每孔以3,000个细胞前1天接种的PG-4细胞单层。在37℃和5％CO2温育1.5-2.5小时后，使用100μL由补充有4％FBS、2％P/S和2％L-Glu的McCoy的5A培养基组成的测定法培养基覆盖细胞。然后，将细胞在37℃和5％CO2温育长达6-7天，并在光学显微术下观察细胞病变效应(CPE)的形成，其指示X-MuLV感染。

[0066] 实施例-5-在存在其他蛋白质的情况下N-甲基葡糖酰胺去污剂病毒灭活

[0067] 对N-甲基葡糖酰胺去污剂(Mega 8、Mega 9、Mega 10和Mega 12)评估其在人血浆、血浆衍生的生物制剂或人抗体的典型制造条件下有效且稳健灭活X-MuLV、PRV或BVDV的能力。每种去污剂测试的浓度分别基于临界胶束浓度(CMC)的0.5x、1x或2x。将每种去污剂与去污剂和多种浓度的游离蛋白(高蛋白梯度)一起温育，并以1:11的比例掺入高效价的X-MuLV储液，并在2.0±1.0℃温育30分钟。包括仅含有相应蛋白质的阳性对照样品，并在2.0±1.0℃温育0和30分钟。在每个温育时间点后，将40μL的每种灭活样品或对照取出并转移至含有4.0ml基础培养基(即，对于X-MuLV为每mL补充有3μg Polybrene(MP)的McCoy的5A培养基或对于PRV或BVDV为EMEM培养基)的15mL管中。此种1:101稀释因子淬灭允许将去污剂稀释超出对指示细胞系的毒性作用，并且还允许在进行TCID50测定法所必需的范围内稀释病毒。简而言之，通过在基础培养基(MP或EMEM)中将每个淬灭样品以1:3.2倍连续滴定直至第11个稀释水平来进行评估病毒感染性的TCID50测定法。以8个重复用每个稀释100μL淬灭样品或基础培养基接种每孔以3,000个细胞前1天接种的指示细胞单层。在37℃温育1.5-2.5小时后，使用100μL由补充有4％FBS、2％P/S和2％L-Glu的基础培养基(McCoy的5A培养基或EMEM)组成的测定法培养基覆盖细胞。然后，将细胞在37℃温育长达6-7天，并在光学显微术下观察细胞病变效应(CPE)的形成，其指示病毒感染。

[0068] 测定实施例

[0069] 实施例1：N-甲基葡糖酰胺去污剂：性质、制备和评估

[0070] 对于本研究，分析四种基于甲基葡糖酰胺的去污剂：辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 8)、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 9)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 10)和十二烷酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega 12)(表1)。这些去污剂都是商品化的N-甲基葡糖酰胺，并且从多个供应商(G-Biosciences、Sigma或Bachem)以粉末形式购买多个批次。

[0071] 图1显示了去污剂如何可以破坏病毒包膜的提出的理论机理。通常，在相应去污剂的临界胶束浓度(CMC)下，去污剂单体可以插入病毒包膜内，这可以允许或消除病毒附着到细胞(宿主)。在高于CMC的浓度，较多的单体插入病毒包膜中，从而导致病毒包膜的完全破坏，并且单体可以与它们自身或与胶束和来自碎裂的包膜的病毒蛋白的混合物形成胶束。如在本专利内的将来的实施例中所述，CMC似乎是有效浓度的指标(实施例3)。在处于或高于CMC的浓度，使用本研究中测试的每种甲基葡糖酰胺去污剂发生病毒灭活。

[0072] N-甲基葡糖酰胺含有通过酰胺键连接的无环亲水性葡萄糖极性头基和疏水性脂肪酸链尾部(由8-10个碳或12个碳组成)(图2)。根据表1，N-甲基葡糖酰胺是相似组成的，差异仅在于碳链长度，其成比例地对应于分子量的增加。根据他人的工作，随着脂肪酸链中碳原子增加，相反地，临界胶束浓度(CMC)降低。

[0073] 表1

[0074]

[0075] 图3显示了本研究中使用的N-甲基葡糖酰胺的二维(2D)和三维(3D)结构。2D和3D结构都显示出碳、氢、氧和氮分子的相似排列。令人感兴趣的是，Mega 8相对于其他N-甲基葡糖酰胺之间的分子堆积可形成头对头的双层堆积，而其他的分子堆积可以以头到尾的单层堆积而堆积。(Jeffery and Malusynksa,1988,Acta Cryst.,B45:447-452)。随着碳链的增加，此种堆积差异可以促成效力增加。

[0076] 表2列出了方法部分中也详细说明的去污剂粉末和内部制剂的制造商。在所制备的5％(重量比体积，w/v)的去污剂中，Mega 8和Mega 9在室温下易溶于水。必要的是在37℃水浴中加热Mega10，该水浴使溶液在15分钟内增溶。但是，Mega 12无法在37℃的水浴中溶于水，并且在60℃的水浴中在至少5分钟逐渐增溶。其他人也观察到了这种情况，并且可能与增加的脂肪链长度有关，所述增加的脂肪链长度增强疏水性，从而降低溶解性的可能性，尤其是在水中(Gaber等人，Burczyk，2007)。因此，在Milli-Q水中制备新的0.15％储液，其是CMC的至少10倍。在置于60℃水浴中后15分钟内，该新制剂能够溶解。

[0077] 表2

[0078]

[0079] 实施例2：病毒：背景和特性

[0080] 存在许多有包膜的RNA和DNA病毒，例如属于以下病毒科的病毒：逆转录病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、纤丝病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、杆状病毒科和痘病毒科。来自这些科中的任一种的许多血源性病毒可以潜在污染用于制造生物活性药物产品的动物衍生的产物。因此，许多制药公司已经使用模型病毒，例如鼠白血病病毒(X-MuLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和伪狂犬病病毒(PRV)，以用其各种纯化方法证明病毒清除(表3)。X-MuLV是模型病毒，其通常用于内源性逆转录病毒样颗粒宿主细胞系(即CHO或BHK细胞)，以表达蛋白质药物产物。X-MuLV也是用于其它有包膜的病毒的模型，包括逆转录病毒，例如主要血源性病原体HIV。BVDV是黄病毒的模型，并且可以代表病毒，例如寨卡病毒(参与最近全球爆发)和丙肝病毒(HCV)。PRV是肝炎病毒的模型，并且可以代表乙肝病毒(HBV)，其是最常见的血源性病原体之一。在理论上，这些有包膜的病毒都易于用N-甲基葡糖酰胺灭活。

[0081] 表3

[0082]

[0083] 已经使用低和高效价的X-MuLV储液评估N-甲基葡糖酰胺病毒灭活的典型条件(表4)。使用X-MuLV的低效价储液进行剂量响应研究和动力学研究。使用X-MuLV的高效价储液进行动力学研究并且测定以对数降低因子(LRF)表示的高病毒灭活能力。表4中包括的其他病毒是BVDV和PRV的高效价病毒储液，其也应易于N-甲基葡糖酰胺去污剂灭活。

[0084] 表4

[0085]

[0086] 实施例3：N-甲基葡糖酰胺衍生物的筛选

[0087] 对N-甲基葡糖酰胺衍生物测试了其灭活高效价X-MuLV储液的能力。在0.5倍、1倍和2倍CMC测试每种去污剂(Mega 8、Mega 9、Mega 10或Mega 12)，并与蛋白质药物(重组凝血因子VIII，rFVIII，抗体或血浆)混合，并且掺入有包膜的病毒(即X-MuLV、PRV或BVDV)，并且在室温或2.0±1.0℃温育30分钟。温育后，将反应淬灭，并使用适当的指示细胞(PG-4、Vero或EBTr细胞)进行TCID50滴定测定法。TCID50回答两个问题，它们是：在测试的任何孔中是否有任何观察到的病毒感染？若如此，测试的样品中的病毒(效价)量是多少？如预期，在2℃和室温(25℃)温育30分钟后，掺入X-MuLV的rFVIII对照的测量滴定分别平均为6.40和6.45Log10 TCID50/mL(图4和图5)。对于每种温度条件，当N-甲基葡糖酰胺浓度为1x CMC以上时，测试的N-甲基葡糖酰胺(Mega8、9、10和12)及其浓度使X-MuLV灭活至检测限(LOD)，指示病毒感染性的完全灭活达≥104.3倍或对数降低因子(LRF)≥4.3(图4和图5，表5和表6)。
重要的是注意，检测限(LOD)≤2.03Log10 TCID50/mL，这也是在未观察到病毒时的效价。
Mega 9和Mega 10在0.5xCMC时的浓度在25℃时完全灭活X-MuLV，但在2℃时部分灭活。当在
25℃或2℃进行处理时，Mega 8和Mega 12在0.5x CMC时无明显灭活(图4和图5)。

[0088] N-甲基葡糖酰胺对X-MuLV的灭活与Triton X-100一样有效，但对测定指示细胞的毒性较小(图6)。在0.3％(w/v)时，这两种去污剂均使X-MuLV完全灭活；Mega 10给出检测限(LOD)≤2.03TCID50/mL，而Triton X-100具有LOD≤2.54TCID50/mL(图6)。总之，这些结果显示了这些生态友好去污剂在病毒灭活方面是有效且稳健的。

[0089] 表5

[0090]

[0091] *LRF＝rFVIII(对照)效价-去污剂处理的效价表6

[0092]

[0093] 实施例4：N-甲基葡糖酰胺对rFVIII的影响

[0094] 在N-甲基葡糖酰胺筛选后，由于在较低浓度(约0.2％)和溶解度下的高功效，确定Mega 10为居首的N-甲基葡糖酰胺候选物。为了确保Mega 10不对蛋白质药物活性施加负面影响，使用生色测定试剂盒测量rFVIII制剂的活性。测定法的原理涉及血液凝固机理中的特定步骤，其中将因子X转化为因子Xa，导致生色底物的水解。此反应取决于因子VIII(FVIII)的活性，并直接与可测量的颜色强度相关。在2.0±1.0℃将rFVIII制剂样品与0.3％(重量/体积，w/v)的Mega 10或0.3％(体积/体积，v/v)水温育2小时，并使用生色测定试剂盒确定rFVIII的活性。水对照和Mega 10处理的样品的平均活性(IU/mL)是相当的，分别为57.19和52.26IU/mL(图7)。这些结果指示即使在与Mega 10温育2小时(其是完全超出
30分钟的病毒灭活的时间点)后，rFVIII活性仍然得到维持。结果证明了Mega 10不仅有效灭活有包膜的病毒，而且对蛋白药物的活性没有影响。

[0095] 实施例5：剂量响应

[0096] 为了确定Mega 10的最低作用浓度，进行了剂量响应研究。将范围为0.014-0.5％(重量/体积，w/v)的增加浓度与重组FVIII(rFVIII)温育，并在2.0±1.0℃掺入X-MuLV(低效价)30分钟。也在相同条件下温育仅rFVIII的对照。温育后，将所有反应淬灭，并且采集样品以在TCID50测定法中进行连续稀释。对于Mega 10反应，病毒效价在0.014-0.06％(w/v)浓度之间与对照相当，指示Mega 10在那些低浓度下不能灭活有包膜的病毒(图8)。一旦Mega 10浓度增加到约0.11％，病毒效价显著下降到约2.62Log10 TCID50/mL。在约0.23％的Mega
10，病毒效价显著下降至未观察到病毒感染的水平(图7和表7)。在0.23％(w/v)，Mega 10的检测限(LOD)≤1.52Log10 TCID50/mL，因此，对于Mega 10，于2.0±1.0℃持续30分钟，LRF≥
3.96(表7)。总之，对于Mega 10，使X-MuLV迅速且完全灭活的最低浓度为约0.23％。

[0097] 表7

[0098]

[0099] *LRF＝rFVIII(对照)效价-去污剂处理的效价

[0100] 实施例6：动力学研究

[0101] 使用低效价和高效价病毒制剂两者进行动力学研究以确定Mega 10可以如何快速且广泛灭活X-MuLV。动力学研究需要多种浓度(0.02％、0.10％、0.20％和0.30％(w/v))、时间点(0、5、15、30、60和120分钟)以及低和高效价X-MuLV原液。通过测试额外的高效价X-MuLV储液，可以实现更高的测定灵敏度，其将在更高的对数降低因子中反映。将0.3％的Mega 10与重组FVIII(rFVIII)制剂一起温育，并且在2.0±1.0℃掺入低效价X-MuLV病毒达0、5、15、30、60和120分钟。然后，将反应样品淬灭，并采集样品以进行TCID50测定法。Mega 10的结果显示了将X-MuLV与含有去污剂的样品(t约0)混合后，立即灭活病毒(图9)。在测定的任何时间点时未检测到病毒感染性，再次指示完全灭活，检测限达到≤1.52Log10 TCID50/mL和对数降低因子≥3.80。

[0102] 表8

[0103]

[0104] *LRF＝rFVIII(对照)效价-去污剂处理的效价

[0105] 用高效价X-MuLV储液和多种Mega 10浓度重复类似实验后，在0分钟(t约0)(0.20％Mega 10)观察到病毒的部分灭活，到5分钟(0.20％Mega 10)实现完全灭活(图10)。值得注意的是，在0.20％的Mega 10，温育5至120分钟未观察到活病毒，检出限≤2.03Log10 TCID50/mL，导致病毒感染性降低≥104.80倍(表9)。本实施例证明了Mega 10在低浓度下在范围为0-5分钟的快速作用内高度有效。

[0106] 表9

[0107]

[0108] *LRF＝rFVIII(对照)效价-去污剂处理的效价

[0109] 实施例7：Mega 10批次与批次的比较

[0110] 为了确保多个供应商和制造批次之间的Mega 10一致性，进行了比较来自G-Bioscience和Sigma的去污剂产品的剂量响应。对于每个供应商，以多个浓度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4％w/v)制备样品，并与重组FVIII(rFVIII)一起温育，并在2.0±1.0℃掺入X-MuLV(高效价)达30分钟。也在相同条件下温育仅rFVIII的对照。温育后，将所有反应淬灭并滴定以进行TCID50测定法。对于每个G-Bioscience和Sigma生产的Mega 10样品，病毒效价在其相应的浓度水平上彼此一致(图11)。X-MuLV灭活概况显示来自这两种来源的Mega 10产品是相当的。用每种产品的0.2-0.4％Mega 10处理的样品具有完全灭活≤2.03Log10 TCID50/mL和LRF≥4.45。总之，从不同来源获得的Mega 10产生彼此一致并且与以前的数据一致的结果。

[0111] 实施例8：通过N-甲基葡糖酰胺灭活重组FVIII中的更多的有包膜的病毒(BVDV和PRV)

[0112] 为了进一步确定通过N-甲基葡糖酰胺对X-MuLV的有力且快速灭活是否对其他有包膜的病毒同等有效，对Mega 9和10评估了其在重组FVIII(rFVIII)溶液中灭活BVDV和PRV的能力。

[0113] 经由剂量响应研究确定Mega 9和10的BVDV灭活。对含有0.5％、0.8％和1.0％(w/v)的Mega 9和0.2％、0.3％和0.4％(w/v)的Mega 10的rFVIII样品以1:11掺入BVDV储液，并在2.0±1.0℃温育30分钟。温育后，将样品淬灭并滴定以使用EBTr指示细胞进行TCID50测定法。结果显示了仅在浓度1.0％的情况下，Mega 9能够将BVDV灭活至检测限(≤2.03Log10 TCID50/mL)。Mega 10能够在0.2％、0.3％和0.4％(w/v)完全灭活BVDV。这两种去污剂能够将BDVD感染性降低≥105.14倍。

[0114] 将PRV掺入(1:11)含有0.2％或0.3％(w/v)的Mega 10的rFVIII制剂中，并在2.0±1.0℃在0、5、15、30和60分钟的时间点进行测定。温育后，淬灭样品，并使用Vero指示细胞在TCID50测定法中滴定。结果显示了0.2和0.3％Mega 10两者都能够立即将病毒感染性降低≥
104.5倍或更高，并在15分钟时达到检测限(≤2.03Log10 TCID50/mL)，对于这两种浓度的Mega 10，感染性降低≥105.10倍数(图12)。

[0115] 总之，Mega 10能够在混合后15分钟内在0.2％灭活PRV，并在混合后立即在0.2％灭活BVDV，代表BVDV感染性降低≥105.14倍。Mega 9在处理的30分钟内在1.0％(w/v)有效地将BVDV灭活至LOD。Mega 10和Mega 9均能使BVDV灭活至LOD，代表BVDV感染性的≥105.14倍降低。BVDV的Mega 10灭活比Mega 9快得多且浓度低得多。这些结果证明了无论病毒的科和种如何，N-甲基葡糖酰胺能够有效地灭活有包膜的病毒(图13)。

[0116] 将甲基葡糖酰胺与其他化合物一起进行测试，以测定对病毒灭活的潜在协同作用。将甲基葡糖酰胺与和不与Tween 20(Tw20)去污剂、磷酸三正丁酯(TnBP)溶剂或氯化钠(NaCl)盐混合，然后与X-MuLV温育。然后，使用先前描述的TCID50测定法测定每个样品或对照的效价。对于每个实验(图15、16和17)，对照由掺入X-MuLV且无去污剂的rFVIII组成，并且产生的滴度在约6.5log10 TCID50/ml的预期范围内。将浓度0.05％(w/v)、0.10％(w/v)或0.30％(w/v)的Mega 10与0.01％(w/v)、0.02％(w/v)或0.06％(w/v)的常用的Tw20去污剂混合，病毒效价与单独的Mega 10相当(图15)。因此，Mega 10+Tw20未进一步增强病毒灭活。
将浓度0.05％(w/v)或0.30％(w/v)的Mega 10与0.05％(w/v)或0.30％(w/v)的常用的TnBP溶剂(分别)混合，与0.05％的单独的Mega 10相比，在0.05％(w/v)的Mega 10+0.05％(w/v)的TnBP的情况下病毒效价略有降低(图16)。因此，Mega 10+TnBP略微增强病毒灭活。最后，将浓度0.10％(w/v)Mega 10或0.51％(w/v)Mega 9与500mM NaCl混合，与单独的0.10％(w/v)Mega 10或0.51％(w/v)Mega 9相比病毒效价降低(图17)。因此，Mega 10或Mega 9+NaCl增强病毒灭活。结果共同显示了在甲基葡糖酰胺和TnBP或NaCl之间观察到协同作用，并且可以用于增强甲基葡糖酰胺的病毒灭活效率。

[0117] 实施例9：通过N-甲基葡糖酰胺灭活人抗体溶液和人血浆中的有包膜的病毒(X-MuLV)

[0118] 至此，已经显示了Mega 10是重组FVIII蛋白基质中多种有包膜的病毒的有力的灭活剂。为了评估Mega 10在其他血浆相关蛋白基质中是否有效，在人免疫球蛋白G(IgG)和血浆溶液中进行X-MuLV灭活。每个蛋白质基质样品以30mg/mL制备，其含有0.2％、0.3％和0.4％(w/v)的Mega 10并掺入X-MuLV储液(1:11)，并在2.0±1.0℃温育30分钟。温育后，将样品淬灭并使用PG-4指示细胞在TCID50测定法中连续稀释。结果显示了在人IgG和人血浆样品两者中，Mega 10能够灭活X-MuLV至检测限(≤2.03Log10 TCID50/mL)，在IgG中将X-MuLV感染性降低至≥104.46倍并且在人血浆溶液中降低至≥103.50倍(图14)。两种蛋白质基质的病毒感染性降低值的差异是由于与IgG阳性对照相比，人血浆样品具有更低的阳性对照病毒效价的实情所致。认为该差异的原因源自血浆在进行实验之前未被热灭活，导致补体非特异性介导的病毒灭活。总之，与在rFVIII蛋白溶液中一样，Mega 10能够在多种血液相关蛋白基质中有效且快速地灭活X-MuLV，指示了N-甲基葡糖酰胺对病毒的灭活不受生物学产物类型、来源和浓度的影响。

[0119] 用N-甲基葡糖酰胺灭活病毒的此种方法适用于生物活性药物的纯化过程，所述药物如蛋白质亚基、蛋白质(酶，因子等)、重组蛋白或抗体或人血液/血浆衍生的治疗剂。本方法中使用的环境安全的去污剂是基于糖的多个N-甲基葡糖酰胺同系物，其由通过酰胺键连接的亲水性葡萄糖部分和疏水性脂肪酸尾部组成。由于在N-甲基葡糖酰胺中没有已知的有毒中间体，例如辛基酚，它消除了与环境关注相关的风险。另外，这些基于糖的去污剂本质上是非离子的，已证明它对目标药物蛋白显示无破坏。在本质上，N-甲基葡糖酰胺应对非有包膜的病毒和核酸制品没有影响。本方法涉及将N-甲基葡糖酰胺与蛋白质药物产品一起温育以灭活任何潜在的有包膜的病毒污染物。为了评估通过此方法实现的病毒减少，将多种有包膜的病毒模型(例如异向性白血病病毒、假狂犬病病毒和牛病毒性腹泻病毒)分别掺入蛋白质药物样品(例如天然蛋白质、重组蛋白质、抗体、人血浆)中，并与N-甲基葡糖酰胺温育。温育后，进行TCID50测定法以确定病毒感染性效价。此外，用N-甲基葡糖酰胺灭活有包膜的病毒与充分证明的病毒灭活去污剂Triton X-100的灭活相当。总之，这些优异的特性使N-甲基葡糖酰胺成为生物衍生的药物产品的纯化过程中的有力工具。

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