一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法和产品及其应用
阅读：1015发布：2020-06-02
专利汇可以提供一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法和产品及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种具有促进人体 皮肤 细胞增殖 多肽的制备方法和产品及其应用，将 超滤 制得的南瓜籽多肽过葡聚糖凝胶G-10， 冷冻干燥 得多肽粉；将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，得到筛选出的南瓜籽多肽；将溶胀好的DEAE-52阴离子交换 树脂 注入层析柱中，去离子 水 平衡2个柱体积，以1mL/min流速梯度洗脱样品，洗脱液每管3mL，收集第50～100管洗脱液，冷冻干燥即得具有促进人体皮肤细胞增殖多肽并鉴定出该多肽序列，如SEQ ID NO.1所示。本发明提取制得的多肽化合物可以显著促进人皮肤 成 纤维 细胞 及人永生化 角 质形成细胞增殖，可以作为修复剂、抗衰老成分添加于护肤品中，具有广阔的市场前景。，下面是一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法和产品及其应用专利的具体信息内容。
1.一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：包括，将南瓜籽多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0离心收集上清液，依次通过
0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤1-10次，收集通过
1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽粉；
将超滤制得的南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶G-10中，待样品完全渗入凝胶后，以超纯水作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得多肽粉；
将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0，离心收集上清液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，得到筛选出的南瓜籽多肽；
将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入上述筛选出的南瓜籽多肽，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品，洗脱液每管3mL，收集第50～100管洗脱液，冷冻干燥即得具有促进人体皮肤细胞增殖多肽。
2.如权利要求1所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥即得具有促进人体皮肤细胞增殖多肽，其中，冷阱温度-50～-45℃，真空度为
0.025MPa，干燥时间为24h。
3.如权利要求1所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：所述将超滤制得的南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶G-10中，待样品完全渗入凝胶后，以超纯水作为洗脱剂进行洗脱，其中，洗脱条件为洗脱速度1.0mL/min，每5min收集一管洗脱液。
4.如权利要求3所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：所述以超纯水作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，是指收集第20～30管的洗脱液。
5.如权利要求1所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：所述将南瓜籽多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0离心收集上清液，其中，离心条件为8000r/min，时间为10min。
6.如权利要求1所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：所述南瓜籽多肽，其制备方法，包括，
取脱盐南瓜籽蛋白以料液比1:5～1:40g/mL加入至去离子水中，以功率20～60Hz下超声10～60min得南瓜籽蛋白分散液，调节温度至30℃～60、pH至5.0～10.0，以酶底比1％～
5.5％加入碱性蛋白酶，酶解2～4h后灭活，调节反应液温度至25～50℃、pH7.5，以酶底比
1％～5.5％加入胰蛋白酶，酶解2～4h后灭活，混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至7.0，5000r/min下离心25min收集上清液，冷冻干燥得南瓜籽多肽。
7.如权利要求6所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：所述脱盐南瓜籽蛋白，其制备方法，包括，
脱脂南瓜籽以料液比1:10～1:50g/mL加入至去离子水中，调节pH至7.0～11，25～50℃下超声提取240min，其中前120min超声功率为20Hz，后120min为40Hz，离心收集上清液，调节pH至7.0，5000r/min下离心25min收集沉淀，水洗除去盐，冷冻干燥得脱盐南瓜籽蛋白。
8.如权利要求6所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，其特征在于：所述脱脂南瓜籽，其制备方法，包括，
将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过100目筛，按料液比1:2～1:5g/mL加入石油醚，在25～
50℃下搅拌4h，抽滤，重复三次，将脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
9.一种如权利要求1～8中任一所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法制得的多肽，其特征在于：所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.一种如权利要求9所述的具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法制得的多肽在化妆品中作为抗衰老、修复、保护、抗氧化成分的应用。
一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法和产品及其
应用
技术领域
背景技术
[0002] 细胞是人体中最大的器官，人体衰老一定程度上可以说是细胞衰老。在皮肤衰老过程中，伴随着角质形成细胞以及成纤维细胞的老化，表皮变薄、劣质化，真皮成胶原蛋白、弹性蛋白减少，皮肤出现皱纹增生以及弹性丧失。因此细胞衰老的重要表现之一为细胞增殖能力的丧失。
[0004] 南瓜籽经过处理后，其中的油脂可采用压榨法、浸出法和超临界流体萃取等方法进行提取，提油后的南瓜籽粕蛋白质含量可达50％以上，是一种优质的植物蛋白资源。但是目前南瓜籽粕仅用作饲料或者被废弃，不仅资源浪费，而且造成环境污染。
[0005] 研究表明，南瓜籽蛋白不仅具有降血糖和抗氧化作用，而且对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡和诱导分化作用。目前，关于南瓜籽多肽及其制备工艺的研究集中在抗氧化性能等方面，关于南瓜籽多肽促进细胞增殖方面的研究没有报告。
发明内容
[0006] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0007] 鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
[0008] 因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，包括，将南瓜籽多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0离心收集上清液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤1-10次，收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽粉；将超滤制得的南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶G-10中，待样品完全渗入凝胶后，以超纯水作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得多肽粉；将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0，离心收集上清液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，得到筛选出的南瓜籽多肽；将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入上述筛选出的南瓜籽多肽，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品，洗脱液每管3mL，收集第50～100管洗脱液，冷冻干燥即得具有促进人体皮肤细胞增殖多肽。
[0010] 作为本发明所述具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法一种优选方案，其中：所述冷冻干燥即得具有促进人体皮肤细胞增殖多肽，其中，冷阱温度-50～-45℃，真空度为0.025MPa，干燥时间为24h。
[0011] 作为本发明所述具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法一种优选方案，其中：所述将超滤制得的南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶G-10中，待样品完全渗入凝胶后，以超纯水作为洗脱剂进行洗脱，其中，洗脱条件为洗脱速度1.0mL/min，每5min收集一管洗脱液。
[0012] 作为本发明所述具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法一种优选方案，其中：所述以超纯水作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，是指收集第20～30管的洗脱液。
[0013] 作为本发明所述具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法一种优选方案，其中：所述将南瓜籽多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0离心收集上清液，其中，离心条件为8000r/min，时间为10min。
[0014] 作为本发明所述具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法一种优选方案，其中：所述南瓜籽多肽，其制备方法，包括，取脱盐南瓜籽蛋白以料液比1:5～1:40g/mL加入至去离子水中，以功率20～60Hz下超声10～60min得南瓜籽蛋白分散液，调节温度30℃～60、pH 5.0～10.0，以酶底比1％～5.5％加入碱性蛋白酶，酶解2～4h后灭活，调节反应液温度至25～50℃、pH7.5，以酶底比1％～5.5％加入胰蛋白酶，酶解2～4h后灭活，混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至7.0，5000r/min下离心25min收集上清液，冷冻干燥得南瓜籽多肽。
[0015] 作为本发明所述具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法一种优选方案，其中：所述脱盐南瓜籽蛋白，其制备方法，包括，脱脂南瓜籽以料液比1:10～1:50g/mL加入至去离子水中，调节pH至7.0～11.0，25～50℃下超声提取240min，其中前120min超声功率为20Hz，后120min为40Hz，离心收集上清液，调节pH至7.0，5000r/min下离心25min收集沉淀，水洗除去盐，冷冻干燥得脱盐南瓜籽蛋白。
[0016] 作为本发明所述具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法一种优选方案，其中：所述脱脂南瓜籽，其制备方法，包括，将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过100目筛，按料液比1:2～1:5g/mL加入石油醚，在25～50℃下搅拌4h，抽滤，重复三次，将脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
[0017] 本发明的另外一个目的是，提供一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法制得的多肽，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019] 本发明有益效果：
[0020] (1)本发明提供一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，首次从南瓜籽中提取一种多肽化合物，提取制得的多肽化合物可以显著促进人皮肤成纤维细胞及人永生化角质形成细胞增殖，可以作为修复剂、抗衰老成分添加于护肤品中，具有广阔的市场前景。
[0021] (2)本发明提供一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，在南瓜籽多肽的制备过程中，以脱盐南瓜籽蛋白为原料，优选碱性-胰蛋白酶双酶复合酶解制得南瓜籽多肽，多肽得率更高，且其分子量小于1000Da的多肽高达92.72％，抗氧化性能最优，促进细胞增殖性能较佳，HSF、HaCat细胞活力分别达到116.15％、121.02％。结合超滤制得的南瓜籽多肽，通过葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽，配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0，离心收集上清液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，得到筛选出的南瓜籽多肽；将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品，洗脱液每管3mL，优选收集第50～100管洗脱液，冷冻干燥即得具有促进人体皮肤细胞增殖多肽，各步骤协同作用，促进细胞增殖性能最优。附图说明
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0023] 图1为本发明实施例1～3中多肽使用葡聚糖凝胶G-10分离后洗脱曲线图。
[0024] 图2为本发明实施例1～3中G-10分离组分对细胞增殖影响图。
[0025] 图3为本发明实施例4～6中DEAE-52分离后洗脱曲线图。
[0026] 图4为本发明实施例4～6中DEAE-52分离组分对细胞增殖影响图。
[0027] 图5为本发明对比例1中DEAE-52分离结果图。
[0028] 图6为本发明对比例2中DEAE-52分离结果图。
[0030] 图8为本发明对照例3中南瓜籽多肽得率图。
[0031] 图9为本发明对照例3中多肽的抗氧化性能图。
[0032] 图10为本发明对照例3中多肽对细胞增殖影响图。
[0033] 图11为本发明实施例6中F2-b组分分析型HPLC谱图。
[0034] 图12为本发明实施例6中F2-b组分紫外吸收谱图。
[0035] 图13为本发明实施例6中F2-b组分低能1:TOF-MS图谱。
[0036] 图14为本发明实施例6中F2-b组分高能2:TOF-MS图谱。
[0037] 图15为本发明实施例6中F2-b的结构鉴定。
具体实施方式
[0038] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0039] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0040] 其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0041] 本发明多肽促进人皮肤细胞增殖活性测定：
[0042] 考察南瓜籽多肽对人皮肤成纤维细胞(HSF)及人永生化角质形成细胞(HaCat)的增殖活性。细胞培养液中只含DMEM为对照组，24h后测定其在490nm处的吸光值OD，按式(1)计算细胞活力。
[0043]
[0044] 式中：OD样品为样品组吸光值；OD空白为空白组吸光值；OD对照为对照组吸光值。
[0045] 实施例1
[0046] (1)脱脂南瓜籽的制备
[0047] 将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛。按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
[0048] (2)南瓜籽蛋白的制备
[0049] 脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下提取180min，离心收集上清液，调节pH至4.3。离心收集沉淀水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白。
[0050] (3)南瓜籽多肽的制备方法
[0051] 调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比2.5％加入碱性蛋白酶，酶解2h后于沸水中灭活。调节反应液温度及pH至37℃、7.5，加入胰蛋白酶，酶解2h后灭活。酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变。酶解结束，待混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点，离心收集上清液，冷冻干燥得多肽。
[0052] (4)超滤
[0053] 将南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤5次。收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽。
[0054] (5)葡聚糖凝胶G-10分离
[0055] 将质量浓度40mg/mL南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶中，待样品完全渗入凝胶后，用超纯水将液面恢复至距凝胶5cm处，并以超纯水作为洗脱剂进行洗脱。洗脱条件为：洗脱速度1.0mL/min。每5min收集一管洗脱液，收集20～30管的洗脱液，测定其274nm处吸光度，绘制洗脱曲线，见图1(命名为F2)。
[0056] 实施例2
[0057] (1)脱脂南瓜籽的制备
[0058] 将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛。按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
[0059] (2)南瓜籽蛋白的制备
[0060] 脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下提取180min，离心收集上清液，调节pH至4.3。离心收集沉淀水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白。
[0061] (3)南瓜籽多肽的制备方法
[0062] 调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比2.5％加入碱性蛋白酶，酶解2h后于沸水中灭活。调节反应液温度及pH至37℃、7.5，加入胰蛋白酶，酶解2h后灭活。酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变。酶解结束，待混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点，离心收集上清液，冷冻干燥得多肽。
[0063] (4)超滤
[0064] 将南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤5次。收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽。
[0065] (5)葡聚糖凝胶G-10分离
[0066] 将质量浓度40mg/mL南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶中，待样品完全渗入凝胶后，用超纯水将液面恢复至距凝胶5cm处，并以超纯水作为洗脱剂进行洗脱。洗脱条件为：洗脱速度1.0mL/min。每5min收集一管洗脱液，收集1～19管的洗脱液，测定其274nm处吸光度，绘制洗脱曲线，见图1(命名为F1)。
[0067] 实施例3
[0068] (1)脱脂南瓜籽的制备
[0069] 将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛。按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
[0070] (2)南瓜籽蛋白的制备
[0071] 脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下提取180min，离心收集上清液，调节pH至4.3。离心收集沉淀水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白。
[0072] (3)南瓜籽多肽的制备方法
[0073] 调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比2.5％加入碱性蛋白酶，酶解2h后于沸水中灭活。调节反应液温度及pH至37℃、7.5，加入胰蛋白酶，酶解2h后灭活。酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变。酶解结束，待混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点，离心收集上清液，冷冻干燥得多肽。
[0074] (4)超滤
[0075] 将南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤5次。收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽。
[0076] (5)葡聚糖凝胶G-10分离
[0077] 将质量浓度40mg/mL南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶中，待样品完全渗入凝胶后，用超纯水将液面恢复至距凝胶5cm处，并以超纯水作为洗脱剂进行洗脱。洗脱条件为：洗脱速度1.0mL/min。每5min收集一管洗脱液，收集31～40管的洗脱液，测定其274nm处吸光度，绘制洗脱曲线，见图1(命名为F3)。
[0078] 图1为葡聚糖凝胶G-10分离结果，根据出峰情况分为三个组分，分别为F1(1-19管)、F2(20-30管)、F3(31-40管)，集中收集各峰溶液，冷冻干燥的多肽粉末，评价三个组分在同一质量浓度下对HSF、HaCat细胞的增殖效果，如图2所示，图2a：HSF；图2b：HaCat，在同一质量浓度下组分F2促进细胞增殖效果最优，因此本发明优选组分F2。
[0079] 实施例4
[0080] 在实施例1中制得的F2多肽粉末配制成溶液，使用DEAE-52分离，具体：
[0081] 将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成10mg/mL溶液，将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入经葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽溶液，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品。洗脱液每管3mL，收集第1～50管洗脱液，并于274nm检测吸光度，见图3(命名为F2-a)。
[0082] 实施例5
[0083] 在实施例1中制得的F2多肽粉末配制成溶液，使用DEAE-52分离，具体：
[0084] 将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成10mg/mL溶液，将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入经葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽溶液，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品。洗脱液每管3mL，收集第51～100管洗脱液，并于274nm检测吸光度，见图3(命名为F2-b)。
[0085] 实施例6
[0086] 在实施例1中制得的F2多肽粉末配制成溶液，使用DEAE-52分离，具体：
[0087] 将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成10mg/mL溶液，将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入经葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽溶液，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品。洗脱液每管3mL，收集第101～150管洗脱液，并于274nm检测吸光度，见图3(命名为F2-c)。
[0088] 图3为DEAE-52分离结果，根据出峰情况分为三个组分，分别为F2-a(1～50管)、F2-b(51～100管)、F2-c(101～150管)，集中收集各峰溶液，冷冻干燥得多肽粉末。在后续的实验中评价三个组分在同一质量浓度下对HSF、HaCat细胞的增殖效果，如图4所示，图4a：HSF，图4b：HaCat，可以看出，在同一质量浓度下组分F2-b促进细胞增殖效果最优。
[0089] 如图11所示，HPLC谱图中，在梯度洗脱条件下分离组分F2-b，出峰时间为17.486min，且仅得到这个比较突出的洗脱峰，可推断F2-b组分为单一组分。其紫外检测器检测到的该组分紫外吸收如图12所示，在229.1nm以及272.8nm处有明显的吸收峰。说明已成功分离得到单一组分F2-b，且从紫外谱图看符合多肽的基本紫外吸收特征。F2-b组分低能TOF-MS图谱见图13，F2-b组分高能TOF-MS图谱见图14。
[0091] ASPNEPEDNPDGF。
[0092] 为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：
[0093] Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；
[0094] Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；
[0095] Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝组氨酸；Ile＝I＝异亮氨酸；
[0096] Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝赖氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；
[0097] Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝丝氨酸；
[0098] Thr＝T＝苏氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y＝酪氨酸；
[0099] Val＝V＝缬氨酸；Cys＝C＝半胱氨酸。
[0100] 其中多肽的N端是丙氨酸，C端为芳香族氨基酸苯丙氨酸。苯丙氨酸残基所含苯环的共轭结构可以解释该多肽的紫外吸收。通过活性肽数据库(BIOPEP)搜索查询发现，ASPNEPEDNPDGF是一种新发现的肽。
[0101] 对照例1
[0102] (1)脱脂南瓜籽的制备
[0103] 将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛。按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
[0104] (2)南瓜籽蛋白的制备
[0105] 脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下提取180min，离心收集上清液，调节pH至4.3。离心收集沉淀水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白。
[0106] (3)南瓜籽多肽的制备方法
[0107] 调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比5％加入碱性蛋白酶，酶解4h后于沸水中灭活。酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变。酶解结束，待混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点，离心收集上清液，冷冻干燥得多肽。
[0108] (4)超滤
[0109] 将南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤5次。收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽。
[0110] (5)分离、纯化
[0111] 将质量浓度40mg/mL南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶中，待样品完全渗入凝胶后，用超纯水将液面恢复至距凝胶5cm处，并以超纯水作为洗脱剂进行洗脱。洗脱条件为：洗脱速度1.0mL/min。每5min收集一管洗脱液，收集20～30管的洗脱液，冷冻干燥得多肽；
[0112] 将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成10mg/mL溶液，将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入经葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽溶液，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品。洗脱液每管3mL，收集第1～50管洗脱液、51～100管洗脱液、101～150管洗脱液，并于274nm检测吸光度，见图5。
[0113] 可以看出，多肽的制备过程中仅加入碱性蛋白酶，在相同管数条件下，50～100管出现响应峰，但是过小。表明采用碱性蛋白酶制备的多肽中含有所述活性多肽组合，但是提取效率低下，产率低。没有采用碱性-胰蛋白酶双酶复合酶解方式得率高。
[0114] 对照例2
[0115] (1)脱脂南瓜籽的制备
[0116] 将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛。按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
[0117] (2)南瓜籽蛋白的制备
[0118] 脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下提取180min，离心收集上清液，调节pH至4.3。离心收集沉淀水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白。
[0119] (3)南瓜籽多肽的制备方法
[0120] 调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比5％加入胰蛋白酶，酶解4h后于沸水中灭活。酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变。酶解结束，待混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点，离心收集上清液，冷冻干燥得多肽。
[0121] (4)超滤
[0122] 将南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤5次。收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽。
[0123] (5)分离、纯化
[0124] 将质量浓度40mg/mL南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶中，待样品完全渗入凝胶后，用超纯水将液面恢复至距凝胶5cm处，并以超纯水作为洗脱剂进行洗脱。洗脱条件为：洗脱速度1.0mL/min。每5min收集一管洗脱液，收集20～30管的洗脱液，冷冻干燥得多肽；
[0125] 将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成10mg/mL溶液，将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入经葡聚糖凝胶G-10分离制备配制成的10mg/mL多肽溶液，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品。洗脱液每管3mL，收集第1～50管洗脱液、51～100管洗脱液、101～150管洗脱液，并于274nm检测吸光度，见图6。
[0126] 可以看出，多肽的制备过程中仅加入胰蛋白酶，在相同管数条件下，50～100管出现响应峰，但是过小。表明采用碱性蛋白酶制备的多肽中含有所述活性多肽组合，但是提取效率低下，产率低。没有采用碱性-胰蛋白酶双酶复合酶解方式得率高。
[0127] 对照例3
[0128] (1)脱脂南瓜籽的制备
[0129] 将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛。按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，脱脂后于通风橱中除去残留石油醚，低温密封保存。
[0130] (2)南瓜籽蛋白的制备
[0131] 脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下提取180min，离心收集上清液，调节pH至4.3。离心收集沉淀水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白。
[0132] (3)南瓜籽多肽的制备方法
[0133] 调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比蛋白酶，酶解4h后于沸水中灭活。酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变。酶解结束，待混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点，离心收集上清液，冷冻干燥得多肽。
[0134] 其中，蛋白酶分别为：碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、碱性-胰蛋白酶、碱性-风味蛋白酶。双酶酶解过程中，第一种蛋白酶水解2h后灭活，再用第二种蛋白酶水解2h。
[0135] 由此生成的5种酶解南瓜籽多肽分别命名为JX、Y、F、JX-Y、JX-F。采用pH-state法对水解度进行测定并计算各多肽产率。不同酶解产物制备条件见表1。
[0136] 表1
[0137]
[0138] (4)多肽得率及水解度
[0139] 多肽得率见图7。从图7可以看出，随着时间的推移，水解度逐渐趋于平稳，4h后JX、Y、F、JX-Y、JX-F的水解度分别为25.20％、12.02％、10.11％、27.23％、23.24％，其中JX-Y水解度最高。
[0140] 水解度测定见图8，从图8可以看出，JX-Y产率达39.20％，为5者中最高。由此可见，水解度和多肽得率两项指标都表明，使用碱性蛋白酶-胰蛋白酶可以得到更多的南瓜籽多肽。
[0141] (5)分子量分布
[0142] 蛋白酶的加入使南瓜籽蛋白链被不同程度、不同部位地切割，成功制得南瓜籽多肽，其中分子量小于1000Da的多肽在JX-Y中占比最高，高达92.72％。多肽分子量分布(％)结果见表2。
[0143] 表2
[0144]
[0145] (6)多肽的抗氧化性能
[0146] 多肽的抗氧化性能测定结果见图9。从图9可以看出，抗氧化能力由小到大依次排列为：F＜Y＜JX＜JX-F＜JX-Y，其中JX-Y抗氧化性能最优。在其浓度为10mg/mL时，对DPPH·、OH·、O2·自由基清除率分别为46.27％、25.37％、10.57％。
[0147] (7)促进细胞增殖
[0148] HSF、HaCat是人体皮肤细胞的重要组成部分，其中HSF位于皮肤真皮层，HaCat位于表皮层。多肽对细胞增殖影响如图10所示，图10a：HSF；图10b：HaCat，5种南瓜籽多肽中JX-Y促进细胞增殖性能最优，HSF、HaCat细胞活力分别达到116.15％、121.02％。
[0149] 本发明提供一种具有促进人体皮肤细胞增殖多肽的制备方法，首次从南瓜籽中提取一种多肽化合物，提取制得的多肽化合物可以显著促进人皮肤成纤维细胞及人永生化角质形成细胞增殖，可以作为修复剂、抗衰老成分添加于护肤品中，具有广阔的市场前景。
[0150] 发明人发现，在南瓜籽多肽的制备过程中，以脱盐南瓜子蛋白为原料，优选碱性-胰蛋白酶双酶复合酶解制得南瓜籽多肽，多肽得率更高，且其分子量小于1000Da的多肽高达92.72％，抗氧化性能最优，促进细胞增殖性能较佳，HSF、HaCat细胞活力分别达到116.15％、121.02％。
[0151] 结合将南瓜籽多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0离心收集上清液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.1～0.2MPa，常温超滤1-10次，收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽粉；将超滤制得的南瓜籽多肽加入到葡聚糖凝胶G-10中，待样品完全渗入凝胶后，以超纯水作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得多肽粉；将葡聚糖凝胶G-10分离制备的多肽配制成1～50mg/mL溶液，调节pH至5.0～10.0，离心收集上清液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，得到筛选出的南瓜籽多肽；将溶胀好的DEAE-52阴离子交换树脂注入层析柱中，去离子水平衡2个柱体积，加入上述筛选出的南瓜籽多肽，分别用0、0.5、1mol/L NaCl溶液以1mL/min流速梯度洗脱样品，洗脱液每管3mL，优选收集第50～100管洗脱液，冷冻干燥即得具有促进人体皮肤细胞增殖多肽，促进细胞增殖性能最优。
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