技术领域
[0001] 本
发明涉及一种盐酸阿考替胺二聚体杂质的制备及其应用，属于医药技术领域。
背景技术
[0002] 盐酸阿考替胺(acotiamide)是由阿斯利康制药和泽里新药株式会社联合开发，于2013年2月在日本被批准用于
治疗功能性消化不良(FD)的临床用药物，也是世界上第一个被批准用于功能性消化不良的治疗药物，主要用于改善胃动
力障碍、
胃排空延迟，从而改善FD症状，包括餐后饱胀，上腹胀，早饱等。
[0003] 最新数据显示，西方国家普通人群消化不良症状已接近40％，并显著降低了
生活质量。其中小部分人群由胃溃疡引起，可通过根治幽
门螺杆菌进行治疗，约20％的有症状人群属于胃食道逆流
疾病，可通过质子
泵抑制剂有效治疗，但大多数消化不良人群属于FD，对于FD的治疗目前仍具有挑战性。盐酸阿考替胺口服片剂在消化道主要是通过抑制乙酰胆
碱酯酶的机制起作用，可促进胃动力、改善胃容纳障碍、增强胃底扩张。盐酸阿考替胺的化学名为：N-{2-[双(1-甲基乙基)
氨基]乙基}-2 -[(2-羟基-4,5-二甲
氧基苯甲酰基)氨基]噻唑-4-甲酰胺盐酸盐三
水合物其结构式如下：
[0004]
[0005] 在临床应用中，药物的杂质对用药品的安全影响极大，临床使用的药物很大一部分不良反应都是因杂质产生的；另外，药物杂质的存在也可能直接影响药物的临床治疗效果。因此，为了保证盐酸阿考替胺的有效性和安全性，对其杂质进行检测，确定杂质含量的高低非常重要。
[0006] 然而，现有文献对盐酸阿考替胺杂质的报道很少，也没有文献公开其含有盐酸阿考替胺二聚体杂质。
发明内容
[0007] 本发明首次发现了盐酸阿考替胺的一种新的杂质，即盐酸阿考替胺二聚体杂质，并提供了它的制备方法，还提供了检测盐酸阿考替胺中该杂质含量的方法，为盐酸阿考替胺的有效性和安全性提供了保障。
[0008] 本发明提供了一种盐酸阿考替胺二聚体杂质的制备及其纯度的检测方法。同时本发明还提供了测定盐酸阿考替胺二聚体杂质含量的方法。
[0009] 本发明提供了一种盐酸阿考替胺二聚体杂质，所述二聚体杂质为2-(2-氨基噻唑-4- 甲酰胺基)噻唑-4-羧
酸化合物，它的结构式如式I所示：
[0010]
[0011] 本发明提供了一种制备上述二聚体杂质的方法，它包括以下步骤：
[0012]
[0013] (1)制备式Ⅲ所示化合物：将化合物Ⅴ和化合物Ⅳ溶于二氯甲烷和三乙胺中，加入 HATΜ，搅拌反应，得反应液，洗涤，干燥，浓缩得化合物Ⅲ；其中，HATΜ为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟
磷酸酯；
[0014] (2)制备式Ⅱ所示化合物：将化合物Ⅲ溶于
乙醇和四氢呋喃中，加入NaOH溶液，反应，旋蒸，萃取，析出，干燥得化合物Ⅱ；
[0015] (3)制备式I所示化合物：将化合物Ⅱ加入浓盐酸，搅拌，放置至析出固体，过滤，烘干得式I所示化合物。
[0016] 其中，步骤(1)中，所述化合物Ⅴ、化合物Ⅳ、三乙胺、HATΜ的摩尔比为：
[0017] 1:1～1.5:1～1.5:2～4，优选为1:1:1:3；和/或，所述化合物Ⅴ与二氯甲烷的质量体积比为 1:20～40g/mL，优选为1:30g/mL；和/或，所述反应时间为2～6小时，优选为4小时；和/ 或，所述洗涤是将反应液依次以1mol/mL稀盐酸、饱和
碳酸氢钠溶液、水进行洗涤；和/ 或，所述干燥是利用无水
硫酸钠干燥；和/或，所述反应的
温度为25±2℃。
[0018] 其中，步骤(2)中，所述化合物Ⅲ与NaOH的摩尔比为1:1～4，优选为1:2.5；和/ 或，所述化合物Ⅲ、乙醇、四氢呋喃的投料量比为1:1～3:1～3g/mL/mL，优选为[0019] 1:2:2g/mL/mL；和/或，所述反应时间为0.5～2小时，优选为1小时；和/或，所述萃取是利用甲基叔丁基醚萃取；和/或，所述析出是加入1mol/mL稀盐酸使析出；和/或，所述反应的温度为25±2℃。
[0020] 其中，步骤(3)中，所述放置时间为1～3小时，优选为2小时；和/或，所述化合物Ⅱ与浓盐酸投料量比为1:10～40g/mL，优选为1:15g/mL；和/或，所述反应的温度为25 ±2℃。
[0021] 本发明提供了一种检测上述二聚体杂质的纯度的方法，它包括如下步骤：
[0022] (1)制备供试品溶液：将
权利要求1所述的二聚体杂质溶于流动相中，得供试品溶液；其中，所述流动相为乙腈-水-三氟乙酸；
[0023] (2)取供试品溶液，注入液相色谱，得其纯度。
[0024] 其中，步骤(1)中，所述流动相的体积比为乙腈：水：三氟乙酸＝10～35:90～65:0.05～1，优选为35:65:0.05；和/或，所述供试品溶液的浓度为0.5mg/mL；
[0025] 步骤(2)中，所述液相色谱为高效液相色谱，其条件为：色谱仪为岛津LC-20AT；和/或，色谱柱的填充剂为十八烷基
硅烷键合硅胶；和/或，检测
波长为210～220nm，优选为220nm；和/或，柱温为30℃；和/或，流速为1.0mL/min。
[0026] 本发明还提供了上述二聚体杂质在检测盐酸阿考替胺二聚体杂质含量中的用途。
[0027] 本发明提供了一种检测盐酸阿考替胺二聚体杂质含量的方法，它包括以下步骤：
[0028] (1)对照品溶液：将二聚体杂质溶于流动相中，得对照品溶液；其中，所述流动相为乙腈-水-三氟乙酸；
[0029] (2)供试品溶液：将盐酸阿考替胺溶于流动相中，得供试品溶液；
[0030] (3)取步骤(1)所得的对照品溶液和步骤(2)所得的供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，得二聚体杂质含量。
[0031] 其中，步骤(1)中，所述流动相的体积比为乙腈：水：三氟乙酸＝10～35:90～65:0.05～1，优选为35:65:0.05；和/或，所述对照品溶液的浓度为0.005mg/mL；
[0032] 步骤(2)中，所述供试品溶液的浓度为0.5mg/mL；
[0033] 步骤(3)中，所述液相色谱为高效液相色谱，其条件为：色谱仪为岛津LC-20AT；和/或，色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；和/或，检测波长为210～220nm，优选为220nm；和/或，柱温为30℃；和/或，流速为1.0mL/min。
[0034] 本发明中所述“室温”均为25±2℃。
[0035] 本发明的“浓盐酸”一般特指普通的
试剂规格，其含量均为30～37.5％，12mol/L。
[0036] 本发明的“稀盐酸”都是浓度为1mol/mL的稀盐酸。
[0037] 本发明首次发现盐酸阿考替胺中含有盐酸阿考替胺二聚体杂质，并提供了它的高纯度制备方法以及检测方法，可以准确测定盐酸阿考替胺
原料药中该二聚体杂质的含量，进而确定盐酸阿考替胺原料药的品质，有助于确定了盐酸阿考替胺原料药的质量品质，确保临床用药的疗效和安全性。
[0038] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的
修改、替换或变更。
[0039] 以下通过
实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0040] 图1为实施例2中盐酸阿考替胺二聚体杂质的NMR图谱；
[0041] 图2为实施例2中盐酸阿考替胺二聚体杂质的质谱(MS)图；
[0042] 图3为实施例3中盐酸阿考替胺二聚体杂质的HPLC图；
[0043] 图4为实施例4中盐酸阿考替胺二聚体杂质的HPLC图；
[0044] 图5为实施例5中对照品溶液的HPLC图谱；
[0045] 图6为实施例5中供试品溶液的HPLC图谱；
[0047] 图8为定量限确定图谱。
具体实施方式
[0048] 本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。 1)材料
[0049] 2-[(叔丁氧羰基)氨基]噻唑-4-
羧酸，生产厂家：成都麦卡希化工有限公司，批号 170708002；
[0050] 甲基2-氨基噻唑-4-羧酸酯，生产厂家：成都润泽本土化工有限公司，批号BT20170215；
[0051] 盐酸阿考替胺原料：成都惟邦药业有限公司提供，批号20170802。
[0052] 2)试剂
[0053] 乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、HATΜ、三乙胺，均由成都市科隆化学品有限公司生产；浓盐酸、碳酸钠、无水硫酸钠均由成都金山化学试剂有限公司生产。
[0054] 3)主要仪器
[0055]
电子天平 EX125DZH 奥豪斯仪器有限公司
[0056] 高效液相色谱仪 LC-20AT 日本岛津
[0057] 实施例1盐酸阿考替胺二聚体杂质的制备
[0058]
[0059] 式中，化合物Ⅴ为2-[(叔丁氧羰基)氨基]噻唑-4-羧酸；
[0060] 化合物Ⅳ为甲基2-氨基噻唑-4-羧酸酯；
[0061] 化合物Ⅲ为乙基2-[2-(叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸酯；
[0062] 化合物Ⅱ为乙基2-[2-((叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸。
[0063] (1)制备化合物Ⅲ：乙基2-[2-(叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸酯
[0064] 称取1.5g化合物Ⅴ和1.56g化合物Ⅳ加入至500mL烧瓶中，加入50mL的二氯甲烷中和1.8g三乙胺，搅拌使之充分溶解，继续加入2.3g的HATΜ(化学名2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)，继续搅拌，室温下反应4小时。反应液依次以 1mol/mL稀盐酸、饱和
碳酸氢钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得棕色油状液体 2-[2-(叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸酯2.6g。
[0065] (2)制备化合物Ⅱ：乙基2-[2-((叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸
[0066] 称取2-[2-(叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸酯2g置于500mL烧瓶中，加入4mL乙醇和4mL四氢呋喃，搅拌，使之溶解完全。加入3M NaOH溶液4mL，室温反应1小时。反应液旋蒸除去乙醇和四氢呋喃后以甲基叔丁基醚萃取，以1mol/mL 稀盐酸析出，干燥，得黄色固体2-[2-((叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4- 羧酸2g。
[0067] (3)制备盐酸阿考替胺二聚体杂质
[0068] 称取2-[2-((叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸2g，加入到30mL 的浓盐酸中，室温搅拌2小时，放置析出固体；过滤，
滤饼以乙酸乙酯打浆回流，过滤，烘干，得黄色粉末盐酸阿考替胺二聚体杂质2-(2-氨基噻唑-4-甲酰胺基)噻唑-4-羧酸0.4g。
[0069] 实施例2盐酸阿考替胺二聚体杂质的制备
[0070] (1)制备化合物Ⅲ：乙基2-[2-(叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸酯
[0071] 称取5g化合物Ⅴ和5g化合物Ⅳ加入至500mL烧瓶中，加入200mL的二氯甲烷中和 7g三乙胺，搅拌使之充分溶解，继续加入8g的HATΜ，继续搅拌，室温下反应3小时。反应液依次以1mol/mL稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得棕色油状液体2-[2-(叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸酯7.1g。
[0072] (2)制备化合物Ⅱ：乙基2-[2-((叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸
[0073] 称取2-[2-(叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸酯7g置于500mL烧瓶中，加入15mL乙醇和18mL四氢呋喃，搅拌，使之溶解完全。加入3M NaOH溶液15mL，室温反应2小时。反应液旋蒸除去乙醇和四氢呋喃后，以甲基叔丁基醚萃取，以1mol/mL 稀盐酸析出，干燥，得黄色固体2-[2-((叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4- 羧酸6.7g。
[0074] (3)制备盐酸阿考替胺二聚体
[0075] 称取2-[2-((叔丁氧羰基)氨基)噻唑-4-甲酰胺基]噻唑-4-羧酸6.7g，加入100mL浓盐酸，室温搅拌2小时，放置析出固体；过滤，滤饼以乙酸乙酯打浆回流，过滤，烘干，得黄色粉末盐酸阿考替胺二聚体杂质2-(2-氨基噻唑-4-甲酰胺基)噻唑-4-羧酸1.1g。
[0076] (4)盐酸阿考替胺二聚体结构的确认
[0077] 为确证盐酸阿考替胺二聚体杂质的化学结构，我们对步骤(3)所得产品进行了NMR 谱和质谱(MS)分析。具体见图1和图2。
[0078] NMR图谱解析：1HNMR,(DMSO,300MHz)11.80(1H,),9.49(1H,s),8.72(t,J＝4Hz，1H), 7.90(1H,s),7.49(1H,s),6.83(1H,s),3.82(H,s).3.77(3H,s),3.59(4H,m),3.16(2H,m), 1.32(12H,s).
[0079] MS谱解析：LCMS:271.0(M+H)
[0080] 结论：步骤(3)所得产品符合盐酸阿考替胺二聚体杂质化学结构，即为盐酸阿考替胺二聚体杂质。
[0081] 实施例3盐酸阿考替胺二聚体杂质纯度检验
[0082] (1)高效液相色谱法测试条件
[0083] 色谱仪：岛津LC-20AT
[0084] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱
[0085] 检测波长：220nm
[0086] 柱温：30℃
[0087] 流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝35:65:0.05(V/V/V)
[0088] 流速：1.0mL/min
[0089] (2)测定法
[0090] 精密称取12.5mg实施例1制备的盐酸阿考替胺二聚体杂质，置于25mL容量瓶中，以流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取10μL供试品溶液，注入液相色谱仪，以面积归一法计算纯度，即得。
[0091] 测定结果：盐酸阿考替胺二聚体杂质纯度为99.36％，见图3所示。根据图3可得两峰的保留时间、相对面积等，如表1所示。
[0092] 表1实施例3中盐酸阿考替胺二聚体杂质的HPLC数据
[0093]峰号 保留时间 面积 高度 面积％ 理论塔板数(USP) 分离度(USP)
1 3.249 36534 3579 0.642 2370 --
2 3.880 5656055 872932 99.358 7278 2.808
总计 5692589 876511 100.000
[0094] 实施例4盐酸阿考替胺二聚体杂质纯度检验
[0095] (1)高效液相色谱法测试条件
[0096] 与实施例3中的高效液相色谱法测试条件相同。
[0097] (2)测定法
[0098] 与实施例3中的测定方法相同。
[0099] 测定结果：实施例2制备的盐酸阿考替胺二聚体杂质纯度99.37％，见图4所示。根据图4可得两峰的保留时间、相对面积等，如表2所示。
[0100] 表2实施例4中盐酸阿考替胺二聚体杂质的HPLC数据
[0101]峰号 保留时间 面积 高度 面积％ 理论塔板数(USP) 分离度(USP)
1 3.251 35793 3502 0.629 2387 --
2 3.886 5659051 873634 99.371 7301 2.812
总计 5694844 877136 100.000
[0102] 实施例5盐酸阿考替胺原料中二聚体杂质的检测
[0103] (1)色谱条件同实施例3。
[0104] (2)溶液配制
[0105] a、对照品溶液：精密称取12.5mg实施例2制备的盐酸阿考替胺二聚体杂质，置于 25mL容量瓶中，以流动相(乙腈∶水∶三氟乙酸＝35∶65∶0.05)溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸阿考替胺二聚体杂质对照品母液。精密吸取盐酸阿考替胺二聚体杂质对照品母液
1mol/mLL，置于100mL容量瓶中，以流动相稀释至刻度，作为对照品溶液。
[0106] b、供试品溶液：精密称取12.5mg盐酸阿考替胺原料(成都惟邦药业有限公司提供，批号20170802)置于25mL容量瓶中，以流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0107] (3)测定
[0108] 精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算盐酸阿考替胺原料中的盐酸阿考替胺二聚体杂质含量为0.09％。
[0109] 对照品溶液HPLC图谱如图5所示，其中保留时间3.753min为盐酸阿考替胺二聚体杂质对照品峰；供试品溶液HPLC图谱如图6所示，其中保留时间3.752min为盐酸阿考替胺二聚体杂质峰，保留时间7.919min为盐酸阿考替胺原料峰。
[0110] 以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
[0111] 实验例1盐酸阿考替胺中二聚体杂质的检测限和定量限
[0112] 精密称取13.2mg盐酸阿考替胺二聚体杂质，置于100mL容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，经过逐级稀释，精密量取10μL供试品溶液，注入液相色谱仪，测定结果S/N 约为3时，计算得检测限，测定结果S/N约为10时，计算得定量限。
[0113] 具体结果为：检测限为0.05ng，定量限为0.1ng，能够满足检测样品中盐酸阿考替胺二聚体杂质的要求。
[0114] 检测限确定图谱见图7，定量限确定图谱见图8。
[0115] 综上，本发明不仅提供了有效制备盐酸阿考替胺二聚体杂质的制备方法，而且提供了检验其纯度的高效液相色谱法分析方法，还提供了一种检测盐酸阿考替胺原料中二聚体杂质含量的方法，可有效应用于盐酸阿考替胺原料药有关其二聚体杂质的定性、定量测定，从而有助于确定盐酸阿考替胺原料药的质量品质，确保临床用药的治疗效果和安全性。
