技术领域
[0001] 本
发明涉及青稞麦芽制备领域，特别涉及一种富含褪黑素的青稞麦芽及其生产方法。
背景技术
[0002] 褪黑素(即N-乙酰基-5-甲
氧基色胺)首先发现于
脊椎动物的松果体中，褪黑素的主要研究还是集中于
哺乳动物中，
植物体中也可通过
生物途径合成褪黑素，但研究较少，目前，在一些高等可食用植物中均分离到了褪黑素，如西红柿，黄瓜，香蕉，苹果，洋葱，稻米等(参考文献：Dubbels R,Reiter RJ,Klenke E et al.Melatonin in edibleplants identified by radioimmunoassay and by high performanceliquid chromatography-mass spectrometry.J Pineal Res1995；18:28–31.6.Hattori A,Migitaka H,Iigo M et al.Identification ofmelatonin in plants and its effects on plasma melatonin levelsand binding to melatonin receptors in vertebrates.BiochemMol Biol Int 1995；35:627–634.)，但青稞麦芽苗中还未进行褪黑素的生成和高产研究。
[0003] 一些研究也显示在避光诱导衰老、紫外线暴露或毒性剂量
铜离子刺激下，植物体为了抗氧化及促进生长，会由根部分泌生成褪黑素，但含量较低(参考文献：Posmyk MM,Kuran H,Marciniak K,Janas KM.Presowingseed treatment with melatonin protects red cabbageseedlings against toxic copper ion concentrations.J Pineal Res2008；45:24–31.20.Tan DX,Manchester LC,Helton P,Reiter RJ.Phytoremediativecapacity of plants enriched with melatonin.PlantSignal Behav 2007；2:514–516.)，因而研发生产一种富含褪黑素的青稞麦芽苗可以为生产富含褪黑素的保健品奠定
基础。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题：如何诱导青稞麦芽高效生成褪黑素，进而生产富含褪黑素的青稞麦芽苗。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
[0006] 一种富含褪黑素的青稞麦芽生产方法，包含如下具体步骤：
[0007] (1)将青稞
种子在24℃的黑暗环境下蒸馏
水浸泡24h催芽,将催芽后的种子
播种于育苗盘中，育苗基质采用蛭石，控制环境
相对湿度在50～60％，24℃暗光培养5天；所述暗光培养为24h光照，8h黑暗交替进行；
[0008] (2)在上述培养条件下，将培养5天的青稞麦芽根部采用处理液浸泡刺激处理，所述处理液的
溶剂均为10mM，pH6.5的
磷酸盐缓冲液，所述处理液中包含终浓度≤20mM的过氧化氢和终浓度≤3mM的
硫酸锌；
[0009] 所述处理液刺激的方法为：
[0010] (a)将育苗盘整体浸入
水培池中，水培池中循环有处理液，控制液面仅没过根部，向溶剂中匀速滴加100mM的硫酸锌母液直至硫酸锌浓度为6mM，滴加完成后循环维持1h；
[0011] (b)再匀速滴加2M过氧化氢母液至溶剂中，直至过氧化氢的浓度为40mM，循环维持30min；
[0012] (c)加入去离子水稀释处理液，直至处理液中过氧化氢浓度恒定为20mM,硫酸锌终浓度恒定为3mM，继续循环维持24h后取出育苗盘；
[0013] (3)
收获青稞麦芽，4℃清水中清洗沥干麦芽全株即得。
[0014] 优选地，将青稞种子于10％
次氯酸溶液中浸泡5分钟灭菌，随后用蒸馏水清洗三遍，再进行催芽操作。
[0015] 优选地，所述光照由日光
灯管提供，光合作用
光子通量
密度为80～100μmol光子/m2/s，光合作用光子通量密度由Delta OHM-HD9021光子探测装置控制并保持恒定；
[0016] 优选地，所述过氧化氢母液的滴
加速度为每分钟滴加溶剂体积的0.5‰。
[0017] 优选地，所述硫酸锌母液的滴加速度为每分钟滴加溶剂体积的0.1％。
[0018] 一种青稞麦芽，由上述富含褪黑素的青稞麦芽生产方法制备获得。
[0019] 本发明获得的有益效果：
[0020] 通过顺次逐渐升高处理液中的硫酸锌浓度和过氧化氢浓度，使得青稞麦芽逐渐适应化学刺激，并在较高浓度的硫酸锌和过氧化氢下受到耐受冲击，使青稞麦芽在终浓度20mM的过氧化氢和终浓度3mM的硫酸锌的处理液中存活并受到刺激大量生成褪黑素，从而生产富含褪黑素的青稞麦芽苗。
具体实施方式
[0021] 下面通过对
实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0022] 实施例1：按如下方法生产富含褪黑素的青稞麦芽苗：
[0023] 一种富含褪黑素的青稞麦芽生产方法，包含如下具体步骤：
[0024] (1)将青稞种子于10％次氯
酸溶液中浸泡5分钟灭菌，随后用蒸馏水清洗三遍，再进行催芽操作。将青稞种子在24℃的黑暗环境下蒸馏水浸泡24h催芽,将催芽后的种子播种于育苗盘中，育苗基质采用蛭石，控制环境相对湿度在50～60％，24℃暗光培养5天；所述暗光培养为24h光照，8h黑暗交替进行；光照由36W日光灯管提供，光合作用光子通量密度为80～100μmol光子/m2/s，光合作用光子通量密度由Delta OHM-HD9021光子探测装置控制并保持恒定；
[0025] (2)在上述培养条件下，将培养5天的青稞麦芽根部采用处理液浸泡刺激处理，所述处理液的溶剂均为10mM，pH6.5的磷酸盐缓冲液，所述处理液中包含终浓度≤20mM的过氧化氢和终浓度≤3mM的硫酸锌；
[0026] 处理液刺激的方法为：
[0027] (a)将育苗盘整体浸入水培池中，水培池中循环有处理液，控制液面仅没过根部，向溶剂中按每分钟滴加溶剂体积的0.1％匀速滴加100mM的硫酸锌母液直至硫酸锌浓度为6mM，滴加完成后循环维持1h；
[0028] (b)再按每分钟滴加溶剂体积的0.5‰匀速滴加2M过氧化氢母液至溶剂中，直至过氧化氢的浓度为40mM，循环维持30min；
[0029] (c)按每分钟加入溶剂体积10％的速度加入去离子水稀释处理液，直至处理液中过氧化氢浓度恒定为20mM,硫酸锌终浓度恒定为3mM，继续循环维持24h后取出育苗盘；
[0030] (3)收获青稞麦芽，4℃清水中清洗沥干麦芽全株，4℃保存即得富含褪黑素的青稞麦芽。
[0031] 数据结果采用SPSS 10进行分析，P＜0.05*为显著性差异。
[0032] 对照实施例1：其余均与实施例1相同，不同之处在于刺激过程中不加入过氧化氢刺激。
[0033] 对照实施例2：其余均与实施例1相同，不同之处在于刺激过程中不加入硫酸锌刺激。
[0034] 对照实施例3：其余均与实施例1相同，不同之处在于处理液刺激的方法为：直接用终浓度20mM的过氧化氢和终浓度3mM的硫酸锌的处理液浸泡麦芽苗根部24h。
[0035] 按如下方法测定青稞麦芽中的褪黑素含量，将鲜重0.1g的植物样本切碎(不进行匀浆)后浸泡于3mL氯仿中，避光4℃振摇15h，将植物样本用0.5mL氯仿冲洗后弃去，剩余氯仿溶液用
真空冷冻干燥，干燥物复溶于0.5mL乙腈中，复溶物0.2μm滤
膜过滤后采用液相色谱法测定
荧光强度，测定过程于较暗的人造光条件下进行。
[0036] 测定过程中采用0.01和0.1μM的不同浓度的褪黑素作为标准溶液测定样本提取物的回收率，将回收率达到95％加标样本用于后续的植物组织褪黑素测定。
[0037] 液相色谱法采用Jasco液相色谱仪，Waters Spherisorb-S5 ODS2色谱柱(250*4.6mm)，荧光探针采用Jasco FP-2020-Plus，激发
波长为280nm，发射波长350nm,流动相采用water:acetonitrile(60:40)，流速0.2mL/min，数据分析采用Jasco ChromPass
1.8.6Data System
软件，荧光
光谱分析采用褪黑素标准品的激发和发射光谱进行对照。
[0038] 将实施例1和对照实施例1～3中生产的青稞麦芽进行褪黑素含量测定，每个实施例分别取三个样品测定三次，空白对照组的麦芽直接采用溶剂浸泡处理24h，结果如下：
[0039] 表1不同刺激条件下青稞麦芽苗中褪黑素的含量
[0040]组别 褪黑素含量(ng/g)
实施例1 51.2±13.4
对照实施例1 19.8±5.9
对照实施例2 27.8±8.7
对照实施例3 1.2±0.2
空白对照 未检出
[0041] 表1结果表明，在硫酸锌和过氧化氢的双重刺激下青稞麦芽苗中大量生成了褪黑素，且褪黑素的含量显著高于对照实施1～2的硫酸锌或过氧化氢单一刺激组，单独处理虽然也能诱导麦苗产生褪黑素，但生成量较低。但对照实施例3结果中褪黑素含量极低，主要是由于青稞麦苗无法适应终浓度20mM的过氧化氢和终浓度3mM的硫酸锌的直接同时刺激处理而出现了凋亡现象，因此褪黑素含量极低。而实施例1中麦芽苗之所以能适应20mM的过氧化氢和终浓度3mM的硫酸锌的处理液，主要是由于进行了更高浓度的化学胁迫冲击，使麦芽逐步适应高浓度的化学刺激，短时间维持高浓度化学刺激主要是防止麦芽无法长时间耐受而死亡，当麦芽适应化学刺激后再回调至较低的终浓度20mM的过氧化氢和终浓度3mM的硫酸锌时，麦芽即可适应并存活，同时大量生成褪黑素进行自我保护和促生长修复。
[0042] 采用实施例1提供的方法，将过氧化氢和硫酸锌的终浓度设为变量进行生产青稞麦芽，测定麦芽中褪黑素含量以确定最佳刺激浓度。
[0044]组别 终浓度 褪黑素含量(ng/g)
实施例1 20mM过氧化氢，3mM硫酸锌 55.2±11.1
实验组1 1mM过氧化氢，0.1mM硫酸锌 8.4±2.2
实验组2 5mM过氧化氢，0.5mM硫酸锌 12.5±3.4
实验组3 10mM过氧化氢，1mM硫酸锌 22.8±4.1
实验组4 15mM过氧化氢，2mM硫酸锌 36.1±7.9
实验组5 30mM过氧化氢，4mM硫酸锌 0.8±0.1
实验组6 40mM过氧化氢，6mM硫酸锌 未检出
空白对照组 0 未检出
[0045] 表2结果中，实验组5和6结果表明长时间高浓度的过氧化氢和硫酸锌处理而不回调至最适浓度会造成麦芽的部分或彻底萎蔫，也无法诱导麦芽产生褪黑素，而实验组1～4及实施例1表明，高浓度耐受冲击后回调至终浓度≤20mM的过氧化氢和终浓度≤3mM的硫酸锌时，麦芽中的褪黑素会呈现剂量依赖性的增长，且不会死亡，因此，将回调最适处理浓度设定为20mM的过氧化氢和终浓度3mM的硫酸锌。
[0046] 采用实施例1提供的方法，将固定终浓度40mM过氧化氢和固定终浓度6mM硫酸锌的处理液对5天的麦芽进行化学刺激，将处理时间作为变量以确定高浓度耐受处理的合理时间，高浓度处理后移入溶剂液中培养48h，观察麦芽存活状况。
[0047] 表3高浓度耐受处理时间对青稞麦芽存活状态的影响
[0048]处理时间(h) 存活状态
0.5 无萎蔫，生长正常
1.0 无萎蔫，但芽苗较矮
1.5 少量萎蔫，芽苗较矮
2 大量萎蔫，无新叶
2.5 枯死，无新叶
[0049] 表3结果可见，高浓度处理1h以内对芽苗的存活无明显影响，但可能会影响芽苗的产量和生物量积累，高于1h的高浓度处理则会对芽苗造成显著的永久损伤，后期降低化学刺激浓度也无法保证芽苗的存活率，因此将硫酸性和过氧化氢的同时高浓度耐受处理时间确定为30min。
[0050] 综上所述，通过顺次逐渐升高处理液中的硫酸锌浓度和过氧化氢浓度，使得青稞麦芽逐渐适应化学刺激，并在较高浓度的硫酸锌和过氧化氢下受到耐受冲击，使青稞麦芽在终浓度20mM的过氧化氢和终浓度3mM的硫酸锌的处理液中存活并受到刺激大量生成褪黑素，从而生产富含褪黑素的青稞麦芽苗。
[0051] 以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过
现有技术加以实现。
