一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法
阅读：1026发布：2020-05-19
专利汇可以提供一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种生产β-丙 氨 酸的重组大肠杆菌及其厌 氧 发酵 的方法，属于代谢工程领域。本发明构建得到的菌株B0016-083BB/pPL-panD、B0016-100BB/pPL-panD、B0016-110BB/pPL-panD厌氧发酵生产β-丙氨酸的产量分别为57.55×10-3g/L、58.37×10-3g/L、80.31×10-3g/L，较出发菌株B0016-080BB/pPL-panD分别提高到142.62％、146.41％和238.82％。本发明首次利用厌氧发酵生产β-丙氨酸，与好氧发酵相比，理论转化率更高，副产物更少，且避免了好氧发酵中所需通气搅拌，降低了生产成本。，下面是一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法专利的具体信息内容。
1.一种产β-丙氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌同时整合表达和游离表达了天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD；所述整合表达，包括将前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD整合到大肠杆菌出发菌株的染色体上；所述游离表达，包括将天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD连接到质粒pPL451上获得重组质粒pPL-panD，然后将重组质粒pPL-panD转入大肠杆菌出发菌中。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌出发菌株是敲除野生型菌株E.coli CICIM B0016中的乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和乳酸代谢产物合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA和ldhA得到重组菌株E.coli B0016-050，然后在E.coli B0016-
050中敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因lysC、p anC和ptsG而获得的菌株。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述天冬氨酸-α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD的融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求1的基础上做了如下改造：利用强诱导型启动子Ptac替换染色体上天冬氨酸氨裂解酶aspA基因原有的弱启动子；所述强诱导型启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌在权利要求5的基础上做了如下改造：敲除染色体中乙醛酸循环抑制子iclR基因。
7.一种采用厌氧发酵法生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1～
6任一所述的重组菌进行厌氧发酵生产。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述厌氧发酵为将所述重组菌接种于含有甘油的培养基中，进行厌氧发酵。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述厌氧发酵具体是，将所述重组菌接种至发酵培养基中，震荡好氧培养至OD600＝2.5，然后补料甘油并调节pH＝7，同时调节温度至
42℃诱导，密闭后继续静置厌氧培养。
10.权利要求1～6任一所述重组菌在制备药物、化工、食品或环境领域的应用。
一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生产β-丙氨酸的重组大肠杆菌及其厌氧发酵的方法，属于代谢工程领域。
背景技术
[0002] β-丙氨酸即3-氨基丙酸，是自然界中存在的唯一一种β型氨基酸。近年来，在医药、化工、食品、环境等领域的作用日渐突出。有报道称β-丙氨酸是未来全球12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。目前，β-丙氨酸的市场需求巨大，但是工业生产β-丙氨酸主要采用化学合成法，存在着环境污染严重、副产物多、纯化困难、工艺条件苛刻等问题。寻求绿色的生产方法具有十分明显的经济和社会效益。生物合成法通常指利用拥有特定代谢途径的微生物转化底物生成β-丙氨酸的方法，生物合成法有绿色无污染、生产条件温和、对设备要求简单等优点，因此越来越受到青睐。
[0003] 能够发酵积累β-丙氨酸的微生物菌株有很多，目前用于研究的菌株主要集中在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。但谷氨酸棒杆菌发酵生产β-丙氨酸副产物谷氨酸浓度较高，后续需要复杂的分离和纯化过程，增加生产成本。大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，即可以在好氧条件下进行快速生长，又可以在厌氧条件下进行混合酸发酵。作为一种模式生物，大肠杆菌遗传背景和代谢途径清楚，分子操作技术发展较为成熟，菌种筛选和代谢途径的改造比较容易，培养条件相对简单，可利用碳源范围广，生长速度快，因此成为研究β-丙氨酸发酵途径和提高β-丙氨酸产量的理想载体。
[0004] 大肠杆菌可以利用甘油为底物经过一系列酶促反应合成富马酸，富马酸在天冬氨酸氨裂解酶(由aspA基因编码)的催化下合成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸在天冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因编码)的催化下合成β-丙氨酸。
[0005] 现有报导的大肠杆菌发酵生产β-丙氨酸均为好氧发酵，但是好氧发酵生产β-丙氨酸副产物多而复杂，导致转化率低，且好氧通气搅拌成本较高。
发明内容
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种产β-丙氨酸的重组菌，所述重组菌同时整合表达和游离表达了天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD；所述整合表达，包括将前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD整合到大肠杆菌出发菌株的染色体上；所述游离表达，包括将天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD连接到质粒pPL451上获得重组质粒pPL-panD，然后将重组质粒pPL-panD转入大肠杆菌出发菌中。
[0007] 在一种实施方式中，所述大肠杆菌出发菌株是敲除野生型菌株E.coli CICIM B0016中的乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和乳酸代谢产物合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA和ldhA得到重组菌株E.coli B0016-050，然后在E.coli B0016-050中敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因lysC、panC和ptsG而获得的菌株，将其命名为B0016-080BB。
[0008] 在一种实施方式中，所述天冬氨酸-α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 在一种实施方式中，所述前端融合了温度开关的天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD的融合基因片段为ci857-pR-pL-panD-kan，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010] 在一种实施方式中，所述重组菌是B0016-083BB/pPL-panD，其是将融合基因ci857-pR-pL-panD整合到大肠杆菌出发菌株B0016-080BB的染色体上，得到重组菌B0016-083BB；然后将重组质粒pPL-panD转入B0016-083BB得到。
[0011] 在一种实施方式中，所述重组菌在B0016-083BB/pPL-panD的基础上还做了如下改造：利用强诱导型启动子Ptac替换染色体上天冬氨酸氨裂解酶aspA基因原有的弱启动子；命名为B0016-100BB/pPL-panD。
[0012] 在一种实施方式中，所述强诱导型启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0014] 本发明的第二个目的是提供一种采用厌氧发酵法生产β-丙氨酸的方法，所述方法是将所述的重组菌进行厌氧发酵生产。
[0015] 在一种实施方式中，所述厌氧发酵为将所述重组菌接种于含有甘油的培养基中，进行厌氧发酵。
[0016] 在一种实施方式中，所述厌氧发酵具体是，将所述重组菌接种至发酵培养基中，震荡好氧培养至OD600＝2.5，然后补料甘油并调节pH＝7，同时调节温度至42℃诱导，密闭后继续静置厌氧培养。
[0017] 在一种实施方式中，所述发酵培养基配方为(每L)：NaHPO4·12H2O 15.1g、KH2PO4 3.0g、NH4Cl 1.0g、NaCl 0.5g、(NH4)2SO4 13.21g，补加50％(v/v)甘油10mL，200g/L泛酸
1mL，1mol/L MgSO4 1mL和微量元素母液1mL；微量元素母液成分为(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4、CoCl2·6H2O 0.3、CuCl2·2H2O 0.15、ZnCl2 0.3、Na2MO4·2H2O 0.3、H3BO3 0.075、MnCl2·
4H2O 0.495。
1mL，1mol/L MgSO4 1mL和微量元素母液1mL；微量元素母液成分为(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4、CoCl2·6H2O 0.3、CuCl2·2H2O 0.15、ZnCl2 0.3、Na2MO4·2H2O 0.3、H3BO3 0.075、MnCl2·
4H2O 0.495。
[0018] 本发明还提供所述重组菌在制备药物、化工、食品或环境领域的应用。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] (1)本发明构建得到的菌株B0016-083BB/pPL-panD、B0016-100BB/pPL-panD、B0016-110BB/pPL-panD厌氧发酵生产β-丙氨酸的产量分别为57.55×10-3g/L、58.37×10-3g/L、80.31×10-3g/L，较出发菌株B0016-080BB/pPL-panD分别提高到142.62％、146.41％和238.82％。
[0022] 图1：基因敲除PCR验证电泳图；M：DL10 000 DNA maker；1：panD整合前；2：panD整合后；3：PaspA::Ptac替换前；4：PaspA::Ptac替换后；5：iclR敲除前；6：iclR敲除后。
[0023] 图2：多基因编辑对β-丙氨酸合成的影响。
[0024] 图3：panD基因的过量表达对不同菌株发酵合成β-丙氨酸的影响。
[0025] 生物材料
[0026] (1)野生型菌株E.coli CICIM B0016由江南大学工业微生物资源和信息中心筛选和保藏(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn/)，参见周丽等人的文章《温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸》中1.1节(公开日：2015-05-04)。
[0027] (2)本发明的出发菌株B0016-080BB，即B0016 ΔackA-pta ΔpflB ΔadhE ΔfrdA ΔldhA ΔlysC ΔpanC ΔptsG，已经于文章(梁珊珊等.食品与发酵工业,2017,43(05):13-18)中公开，其具体构建过程为：
[0028] 在野生型菌株E.coli CICIM B0016中敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和乳酸代谢产物合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA和ldh A得到重组菌株B0016-050，参见周丽等人的文章《温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸》表1(公开日：2015-05-04)。在菌株E.coli B0016-050中依次叠加敲除天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGlc)的编码基因lysC、panC和ptsG，获得B0016-080BB菌株，参见梁姗姗等人的文章《代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸》表1(公开日：2017-12-31)。
具体实施方式
[0029] (1)基因整合和敲除方法：
[0030] 采用Red重组法，参见Datsenko等(Datsenko K A,et al.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:6640-6645)报道的基因整合和敲除方法。
[0031] (2)β-丙氨酸检测方法：
[0032] 发酵液预处理方法：发酵液样品10000rpm离心2min，取上清液加入等体积10％(m/v)三氯乙酸，避光放置大于3h，适当稀释后用0.45μm滤膜过膜。
[0033] 利用邻苯二甲醛(OPA)试剂在线衍生β-丙氨酸，用高效液相色谱(HPLC)分析β-丙氨酸的含量。色谱柱为Diamonsil C18柱(250cm×4.6mm,5μm)，流动相A为：无水醋酸钠(分析纯)4.52g，先溶于水，再加三乙胺200μL，四氢呋喃5mL，水定容至1L，醋酸调节pH7.2；流动相B为：无水醋酸钠4.52g，水定容为200mL，醋酸调节pH7.2，加400mL甲醇和400mL乙腈。采用梯度洗脱：0～27min，B液由8％上升到60％，流速为1mL/min；20～31.5min，B液由60％上升到100％，流速为1mL/min；32～34min，B液梯度不变，流速为1.2mL/min。34～35min，B液由100％下降到8％，流速为1mL/min。柱温为40℃，检测波长为338nm；进样量为10μL。
[0034] 实施例1：在染色体上整合天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD
[0035] 在panD基因前端融合温控开关pR-pL启动子，能够通过改变培养温度快速、有效地开启或关闭重组蛋白的表达。具体参见周丽等文章《温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸》(公开日：2015.12.31)。
[0036] (1)融合基因片段ci857-pR-pL-panD-kan的获得
[0037] 质粒pPL-panD已经于文章(梁珊珊等.食品与发酵工业,2017,43(05):13-18)中公开，在该质粒中ci857、pR启动子、pL启动子、panD基因和kan抗性基因串联在一起。
[0038] 以质粒pPL-panD为模板，利用引物PanD-PKD13F和PanD-CI857R扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的ci857-pR-pL-panD-kan基因。
[0039] (2)将ci857-pR-pL-panD-kan融合基因整合到染色体上
[0040] 以大肠杆菌B0016-080BB为出发菌，利用Red重组法将步骤(1)中得到的ci857-pR-pL-panD-kan融合基因整合到大肠杆菌染色体上，利用引物YpanDF，YpanDR对重组结果进行验证。结果表明基因整合到染色体之前扩增得到的片段长度为556bp(参见图1lane1)，将ci857-pR-pL-panD-kan融合基因整合到大肠杆菌染色体上之后扩增得到的片段长度为3024bp(参见图1lane2)，并经测序正确，说明ci857-pR-pL-panD-kan基因被整合到大肠杆菌染色体上。最后得到菌株B0016-080BB-panD，将其命名为B0016-083BB。
[0042]
[0043] 实施例2：替换染色体上天冬氨酸氨裂解酶基因aspA原有的弱启动子[0044] (1)强诱导型启动子Ptac的扩增
[0045] 以pUC57质粒为模板，以Kan-Ptac、Kan-T为引物，扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的强诱导型启动子Ptac基因序列。
[0046] (2)利用强诱导型启动子Ptac替换染色体上弱启动子PaspA
[0047] 在实施例1中得到的菌株B0016-083BB(即菌株B0016-080BB-panD)的基础上，利用Red重组法，采用引物AspA-Ptac、AspA-pK将步骤(1)中得到的启动子Ptac基因整合到大肠杆菌染色体上，利用引物YaspAF，YaspAR对重组结果进行验证。结果表明PaspA被替换之前扩增得到的片段长度为2480bp(参见图1 lane3)，替换后扩增得到的片段长度为3578bp(参见图1lane4)，并经测序正确，说明染色体上aspA基因原有的弱启动子PaspA已经被强诱导型启动子Ptac替换。最后得到菌株B0016-083BB PaspA::Ptac，将其命名为B0016-100BB。
[0048] 表2引物序列表
[0049]
[0050] 实施例3：敲除染色体中乙醛酸循环抑制子iclR
[0051] 在实施例2中得到的菌株B0016-100BB的基础上，利用Red重组法采用引物iclR-pkd13F、iclR-pkd13R敲除大肠杆菌染色体上的乙醛酸循环抑制子iclR，利用引物YiclR F，YiclR R进行验证，iclR敲除前扩增得到的基因大小为1872bp，敲除后扩增得到的序列减少为1044bp。说明染色体上的iclR被敲除。最后得到菌株B0016-100BB ΔiclR::FRT，将其命名为B0016-110BB。
[0052] 表3引物序列表
[0053]
[0054]
[0055] 实施例4：菌株的摇瓶发酵
[0057] 取-80℃甘油保藏的菌种B0016-080BB、B0016-083BB、B0016-100BB、B0016-110BB，在氨苄青霉素抗性的LB平板划线，于33℃恒温培养24h后，转接到50mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于33℃摇床200r/min震荡培养至OD600＝2.5，得到菌株的种子液。
[0058] (2)厌氧发酵培养
[0059] 将步骤(1)中得到的种子液转接至50mL M9-2培养基中，使OD600终浓度为0.05，于33℃、200r/min震荡好氧培养至OD600＝2.5。然后补料1.5mL50％(v/v)甘油并用100g/L的NaHCO3调节pH＝7，同时调节温度至42℃诱导，密闭并继续静置厌氧培养。发酵过程中每6h补加1mL50％(v/v)甘油，并用100g/L的NaHCO3调节pH＝7，42h结束厌氧发酵，每次试验采用三个平行并计算其平均值。
[0060] M9-2培养基成分(每L)：NaHPO4·12H2O 15.1g、KH2PO4 3.0g、NH4Cl 1.0g、NaCl 0.5g、(NH4)2SO4 13.21g，补加50％(v/v)甘油10mL，200g/L泛酸1mL，1mol/L MgSO4 1mL和微量元素母液1mL。微量元素成分为(g/L)：FeCl3·6H2O 2.4；CoCl2·6H2O 0.3；CuCl2·2H2O
0.15；ZnCl2 0.3；Na2MO4·2H2O 0.3；H3BO3 0.075；MnCl2·4H2O 0.495。
0.15；ZnCl2 0.3；Na2MO4·2H2O 0.3；H3BO3 0.075；MnCl2·4H2O 0.495。
[0061] B0016-080BB、B0016-083BB、B0016-100BB、B0016-110BB菌株的β-丙氨酸合成水平如图2所示，出发菌株B0016-080BB无法利用厌氧发酵合成β-丙氨酸，B0016-083BB可以利用厌氧发酵合成β-丙氨酸，产量为12.883×10-3g/L，B0016-100BB菌株和B0016-110BB菌株的β-丙氨酸合成量较B0016-083BB分别提高24.81％和50.39％。结果说明过表达panD基因可以大幅度提高β-丙氨酸的产量。
[0062] 表4菌株的发酵结果
[0063]
[0064] 实施例5：将pPL-panD质粒分别转化入菌株
[0065] 质粒pPL-panD已经于文章(梁珊珊等.食品与发酵工业,2017,43(05):13-18)中公开。
[0066] (1)菌株的构建
[0067] 将pPL-panD质粒分别通过电转化法转化入菌株B0016-080BB、B0016-083BB、B0016-100BB、B0016-110BB的感受态细胞中，在氨苄抗性平板中进行抗性筛选，能够在氨苄抗性平板生长的菌即为转化成功，最终获得B0016-080BB/pPL-panD、B0016-083BB/pPL-panD、B0016-100BB/pPL-panD、B0016-110BB/pPL-panD重组菌株。
[0068] (2)菌株的厌氧摇瓶发酵
[0069] 发酵方法与实施例4相同。
[0070] 将步骤(1)中得到的菌株进行厌氧摇瓶发酵，摇瓶发酵结果如图3所示，B0016-080BB/pPL-panD菌株可以在厌氧发酵过程中合成β-丙氨酸，产量为30.961×10-3g/L，B0016-083BB/pPL-panD、B0016-100BB/pPL-panD和B0016-110BB/pPL-panD菌株的β-丙氨酸合成量较B0016-080BB/pPL-panD分别提高到142.62％、146.41％和238.82％。说明继续过量表达panD基因显著提高了β-丙氨酸合成量。
[0071] 表5菌株的发酵结果
[0072]
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