【技术领域】
[0001] 本
发明涉及食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及甘氨酸测定方法及其试剂盒。【背景技术】
[0002] 甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味，能缓和酸、
碱味，掩盖食品中添加糖精的苦味并增强甜味。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。甘氨酸不能被人体利用，只能分解转化为
热能，这样会增加肝脏负担。而分解产物中的含氮化合物要通过尿液排出体外，又会增加肾脏负担。如果大量、长期食用这类食品，可能造成肝肾损伤。部分含乳饮料企业为提高产品中
蛋白质含量，在生产加工中违规使用甘氨酸，对青少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。
[0003] 按照我国《
食品添加剂使用卫生标准》GB2760规定，甘氨酸在作为食品添加剂只允许在
调味剂与豆奶中使用，且最高限量为每公斤1克，但在含乳饮料中不允许使用。 【发明内容】
[0004] [要解决的技术问题]
[0005] 本发明的目的是提供一种甘氨酸的测定方法。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。
[0007] [技术方案]
[0008] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0009] 本发明的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还
原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm
波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。
[0010] 本发明甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述甘氨酸转氨酶、氨甲酰
磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶的系列催化反应完成：
[0011] 甘氨酸+
酮戊二酸甘氨酸转氨酶
乙醛酸+谷氨酸
[0012] 谷氨酸+2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+二
氧化
碳+
水[0013] 二氧化碳+核糖-5-磷酸+还原型辅酶磷酸葡糖酸脱氢酶磷酸葡糖酸+辅酶 [0014] 本发明的方法利用甘氨酸转氨酶(glycine transaminase；EC 2.6.1.4)酶(偶)联氨甲酰磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase；EC 6.3.5.5)、磷酸葡糖酸脱氢酶(phosphogluconate dehydrogenase；EC 1.1.1.44)酶促反应终点法。甘氨酸转氨酶酶解甘氨酸反应产生谷氨酸，再通过(偶)联合氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧
化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算甘氨酸的浓度大小。
[0015] 本发明是通过下述技术方案实现的。
[0016] 本发明涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下： [0017] A、样品准备：
[0018] A.1标准样品的制备
[0019] 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；
[0020] A.2待测样品的制备
[0021] 待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；
[0022] A.3空白样品
[0023] 所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升； [0024] B、试剂溶液的制备：
[0025] 分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、单价
磷酸盐、氨甲酰磷酸与核糖-5-磷酸，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L与1-100mmol/L； [0026] C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在
温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；
[0027] D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化； [0028] E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化； [0029] F、
数据处理[0030] 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量：
[0031]
[0032] 式中：
[0033] ΔA(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；
[0034] ΔA(空白)表示步骤E)得到的空白样品的吸光度变化；
[0035] ΔA(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。
[0036] 根据本发明，在所述的甘氨酸测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的pH基本保持稳定(一般是6.5-8.5)的溶液。如果该pH高于8.5或pH低于6.5，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。
[0037] 在本发明中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-
盐酸缓冲 液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-
柠檬酸缓冲液、
硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二
乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。 [0038] 优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。
[0039] 更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0040] 根据本发明，在所述的甘氨酸测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶，使其不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质，它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时，顶多数天，就会逐渐失去活性而不再具备检测性能。在本发明中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。 [0041] 在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自
硫酸铵、
氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠
防腐剂的稳定剂。
[0042] 优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。
[0043] 更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、硫酸铵或双乙酸钠的稳定剂。
[0044] 在本发明中，所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。
[0045] 根据一种本发明的优选实施方式，本发明使用全自动生化分析仪测定甘氨酸时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样，然后在下述条件下进行测定：测定方法为二点终点法/终点法，温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。
[0046] 根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂 试剂：
[0047] 由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、单价磷酸盐、氨甲酰磷酸与核糖-5-磷酸组成的试剂1；
[0048] 由所述的缓冲液、稳定剂、甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶与磷酸葡糖酸脱氢酶组成的试剂2；
[0049] 其中还原型辅酶、甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、单价磷酸盐、氨甲酰磷酸、核糖-5-磷酸在试剂1或试剂2中的
位置是不限定的。
[0050] 根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂： [0051] 由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、单价磷酸盐、氨甲酰磷酸与核糖-5-磷酸组成的试剂1；
[0052] 由所述的缓冲液、稳定剂、氨甲酰磷酸合成酶与磷酸葡糖酸脱氢酶组成的试剂2； [0053] 由所述的缓冲液、稳定剂与甘氨酸转氨酶组成的试剂3；
[0054] 其中还原型辅酶、甘氨酸转氨酶、氨甲酰磷酸合成酶、磷酸葡糖酸脱氢酶、酮戊二酸、腺苷二磷酸、单价磷酸盐、氨甲酰磷酸、核糖-5-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。
[0055] 在本发明甘氨酸测定方法中使用的测定仪器可以是紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如：由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。
[0056] 本发明还涉及甘氨酸测定试剂盒。该甘氨酸测定试剂盒由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂： [0057] 缓冲液 20-500mmol/L
[0058] 稳定剂 0.001-7mol/L
[0059] 还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L
[0060] 甘氨酸转氨酶 1000-80000U/L
[0061] 氨甲酰磷酸合成酶 1000-80000U/L
[0062] 磷酸葡糖酸脱氢酶 1000-80000U/L
[0063] 酮戊二酸 1-100mmol/L
[0064] 腺苷二磷酸 1-100mmol/L
[0065] 单价磷酸盐 1-100mmol/L
[0066] 氨甲酰磷酸 1-100mmol/L
[0067] 核糖-5-磷酸 1-100mmol/L。
[0068] 根据一种本发明的优选实施方式，本发明的甘氨酸测定试剂盒有： [0069] 试剂1：
[0070] 缓冲液 100mmol/L
[0071] 稳定剂 500mmol/L
[0072] 还原型辅酶 0.25mmol/L
[0073] 酮戊二酸 15mmol/L
[0074] 腺苷二磷酸 5mmol/L
[0075] 单价磷酸盐 15mmol/L
[0076] 氨甲酰磷酸 5mmol/L
[0077] 核糖-5-磷酸 15mmol/L；
[0078] 组成如下的试剂2：
[0079] 缓冲液 100mmol/L
[0080] 稳定剂 500mmol/L
[0081] 甘氨酸转氨酶 16000U/L
[0082] 氨甲酰磷酸合成酶 18000U/L
[0083] 磷酸葡糖酸脱氢酶 12000U/L。
[0084] 根据另一种本发明的优选实施方式，本发明的甘氨酸测定试剂盒有： [0085] 试剂1：
[0086] 缓冲液 100mmol/L
[0087] 稳定剂 500mmol/L
[0088] 还原型辅酶 0.25mmol/L
[0089] 酮戊二酸 15mmol/L
[0090] 腺苷二磷酸 5mmol/L
[0091] 单价磷酸盐 15mmol/L
[0092] 氨甲酰磷酸 5mmol/L
[0093] 核糖-5-磷酸 15mmol/L；
[0094] 组成如下的试剂2：
[0095] 缓冲液 100mmol/L
[0096] 稳定剂 500mmol/L
[0097] 氨甲酰磷酸合成酶 18000U/L
[0098] 磷酸葡糖酸脱氢酶 12000U/L；
[0099] 组成如下的试剂3：
[0100] 缓冲液 100mmol/L
[0101] 稳定剂 500mmol/L
[0102] 甘氨酸转氨酶 16000U/L。
[0103] 根据另一种本发明的优选实施方式，在本发明的甘氨酸测定试剂盒中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。
[0104] 优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。
[0105] 更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0106] 在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。
[0107] 优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、丙二醇、甘油、双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。
[0108] 更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、硫酸铵或双乙酸钠的稳定剂。
[0109] 在本发明中，无论是单剂试剂、双剂试剂或三剂试剂，在本发明测定甘氨酸 的方法中，所述的还原型辅酶可以是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。 [0110] 使用本发明的甘氨酸测定试剂盒时，可以使用紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如：由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。
[0111] 在采用本发明方法测定甘氨酸时，根据实验要求进行多次试验，然后将得到的这些试验结果按照下式计算出精
密度(CV)：
[0112]
[0113] 式中：
[0114] -试验结果平均值；
[0115] Xi-各次试验结果；
[0116] n -试验次数.N≥10
[0117]
[0118] 将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差：
[0119]
[0120] 第一批各次试验结果平均值
[0121] 第二批各次试验结果平均值
[0122] 第三批各次试验结果平均值
[0123] 为X，Y，Z中的最大值
[0124] 为X，Y，Z中的最小值
[0125] 每批试样数取n≥3
[0126] 经过大量试验确定，对于甘氨酸含量为0-2mmol/L的样品，其分析误差可以达到≤5％。
[0127] 本发明方法的灵敏度可以达到0.0001mmol/L。
[0128] 通过大量试验确定，本发明方法测定甘氨酸含量范围是0-2mmol/L，本发明方法适合于食品检测。【具体实施方式】
[0129] 下述
实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。
[0131] 1)标准样品的制备
[0132] 将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升； [0133] 2)待测样品预处理
[0134] 牛奶样品作为待测样品，无须预处理；
[0135] 3)空白样品
[0136] 所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升； [0137] B、试剂溶液的制备：
[0138] 本实施例的甘氨酸测定试剂为单剂试剂，它含有：
[0139] 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
[0140] 甘油 1mol/L
[0141] NADPH 0.25mmol/L
[0142] 甘氨酸转氨酶 16000U/L
[0143] 氨甲酰磷酸合成酶 18000U/L
[0144] 磷酸葡糖酸脱氢酶 12000U/L
[0145] 酮戊二酸 15mmol/L
[0146] 腺苷二磷酸 5mmol/L
[0147] 单价磷酸盐 15mmol/L
[0148] 氨甲酰磷酸 5mmol/L
[0149] 核糖-5-磷酸 15mmol/L。
[0150] 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 [0151] C、待测牛奶样品，与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/50进行混合， 在温度37℃下反应5分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化ΔA(样品)为0.0498；
[0152] D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化ΔA(标准)为0.1638；
[0153] E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶液的吸光度随时间的变化ΔA(空白)为0.0011；
[0154] F、数据处理
[0155] 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量：
[0156]
[0157] 式中：
[0158] ΔA(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；
[0159] ΔA(空白)表示步骤E)得到的空白样品的吸光度变化；
[0160] ΔA(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。
[0161] 通过上式计算得到该牛奶样品的甘氨酸含量为0.30mmol/L，其误差是±0.002mmol/L。
[0162] 实施例2：牛奶中甘氨酸含量的测定
[0163] 1)标准样品的制备
[0164] 将一定量的甘氨酸溶于水中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升，作为标准样品；
[0165] 2)待测样品的制备
[0166] 牛奶样品作为待测样品，无须处理；
[0167] 3)空白样品
[0168] 所述的水作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升；
[0169] B、试剂溶液的制备：
[0170] 甘氨酸测定试剂为双剂试剂，它含有：
[0171] 组成如下的试剂1：
[0172] 磷酸盐缓冲液 100mmol/L
[0173] NADH/NAD+ 0.25mmol/L
[0174] 酮戊二酸 15mmol/L
[0175] 腺苷二磷酸 5mmol/L
[0176] 单价磷酸盐 15mmol/L
[0177] 氨甲酰磷酸 5mmol/L
[0178] 核糖-5-磷酸 15mmol/L；
[0179] 组成如下的试剂2：
[0180] 磷酸盐缓冲液 100mmol/L
[0181] 乙二醇 5mol/L
[0182] 甘氨酸转氨酶 16000U/L
[0183] 氨甲酰磷酸合成酶 32000U/L
[0184] 磷酸葡糖酸脱氢酶 40000U/L。
[0185] 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 [0186] C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定
[0187] 该全自动生化分析仪主要操作参数如下：
[0188] 计量方法 ：两点终点法
[0189] 测试计量时间点 ：21，31
[0190] 主波长 ：340
[0191] 副波长 ：405
[0192] 反应温度 ：37
[0193] 样品体积 ：5
[0194] 试剂1(R1)体积 ：200
[0195] 试剂2(R3)体积 ：50
[0196] 反应方向 ：负
[0197] 标准样品1 ：0.00
[0198] 标准样品2 ：1.00
[0199] 定标结果显示K值为-641，换算成灵敏度为0.1560ΔA/mmol/L。 测试结果显示该牛奶中含有甘氨酸为0.45mmol/L。其误差是±0.003mmol/L。
[0200] 实施例3：牛奶样品中甘氨酸含量的测定
[0201] 该实施例的操作方式与实施例2相同，只是本实施例：
[0202] B、试剂溶液的制备：
[0203] 甘氨酸测定试剂为三剂试剂，它含有：
[0204] 组成如下的试剂1：
[0205] 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
[0206] NADH 0.25mmol/L
[0207] 酮戊二酸 15mmol/L
[0208] 腺苷二磷酸 5mmol/L
[0209] 单价磷酸盐 15mmol/L
[0210] 氨甲酰磷酸 5mmol/L
[0211] 核糖-5-磷酸 15mmol/L；
[0212] 组成如下的试剂2：
[0213] 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
[0214] 硫酸铵 1mol/L
[0215] 氨甲酰磷酸合成酶 28000U/L
[0216] 磷酸葡糖酸脱氢酶 50000U/L；
[0217] 组成如下的试剂3：
[0218] 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
[0219] 硫酸铵 2mol/L
[0220] 甘氨酸转氨酶 26000U/L。
[0221] 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 [0222] C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定
[0223] 该全自动生化分析仪主要操作参数如下：
[0224] 计量方法 ：两点终点法
[0225] 测试计量时间点 ：21，31
[0226] 主波长 ：340
[0227] 副波长 ：405
[0228] 反应温度 ：37
[0229] 样品体积 ：5
[0230] 试剂1(R1)体积 ：20
[0231] 试剂2(R2)体积 ：180
[0232] 试剂3(R3)体积 ：50
[0233] 反应方向 ：负
[0234] 标准样品1 ：0.00
[0235] 标准样品2 ：1.00
[0236] 定标结果显示K值为-635，换算成灵敏度为0.1575ΔA/mmol/L。 [0237] 测试结果显示该牛奶中含有甘氨酸为0.41mmol/L。其误差是±0.001mmol/L。 [0238] 实施例4：
稳定性试验
[0239] 该实施例的操作方式与实施例1相同，只是在实施例1实施后，实施例1使用的试剂在密闭试剂瓶中在2-8℃下存放了半年与一年。
[0240] 使用同样的标准样品，使用与实施例2同样的新试剂与上述存放半年与一年的试剂分别进行了测定，其它条件都与实施例2相同，其测定结果如下：
