一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用
阅读：929发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种酶法检测谷 氨 酸含量的方法及其应用，利用甘氨酸转氨酶AT2以及3- 磷酸 甘油酸脱氢酶SerA的双酶偶联体系，测定谷氨酸的含量；本发明的酶法检测谷氨酸含量的方法克服了传统谷氨酸脱氢酶方法不适用于高浓度氨环境的 缺陷 ，创造性地通过甘氨酸转氨酶AT2和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA双酶偶联的方法，将谷氨酸脱氨形成α- 酮 戊二酸 ，又通过α-酮戊二酸的还原反应，以NADH含量的减少来快速正确表征体系中的谷氨酸含量。本发明灵敏度高，检测迅速稳定，重复性好，操作简便，成本较低，适用范围较广。，下面是一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于，步骤如下：利用甘氨酸转氨酶AT2以及
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶偶联体系，测定谷氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）蛋白的外源表达及分离纯化
1）制备甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因；
2）将步骤1）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因分别连入pET28a表达载体，得到pET28a-AT2与pET28a-SerA质粒；
3）将pET28a-AT2与pET28a-SerA质粒分别转入大肠杆菌Rosetta菌株中后在培养基中进行培养，得到甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
4）分离纯化目的蛋白；
（2）利用分离纯化得到的目的蛋白，通过双酶偶联法对样品中的谷氨酸的含量进行检测。
3.根据权利要求2所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤4）中分离纯化目的蛋白的步骤为：
A、将步骤3）得到的含有甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中；
B、破碎菌体后，离心，收集上清液；
C、上清液过镍柱，用洗脱液进行洗脱；
D、将洗脱得到的酶液置于超滤管中进行离心、浓缩，浓缩后的蛋白溶液分装，即可得到分离纯化目的蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤A中，离心的反应温度为4 16 ℃，转速为10000 12000 rpm；所述步骤D中，离心的反应温度为4~ ~ ~
16 ℃，转速为5000 6000 rpm。
~
5.根据权利要求3所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤A中，缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷、37.3 g氯化钾以及
100 ml甘油；所述步骤D中，在浓缩的过程中加入缓冲液B，并将蛋白悬浮于缓冲液B中；缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷、7.45 g氯化钾、200 ml甘油以及0.154 g二硫苏糖醇。
6.根据权利要求3所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于，所述步骤C中，洗脱液中含有咪唑，洗脱液中咪唑浓度为20 -500mmol/L。
7.根据权利要求2所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于：所述步骤（2）中双酶偶联法为终点法或初速度法。
8.根据权利要求7所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于，所述终点法的检测步骤如下：配置浓度在0 0.4 mmol/L之间的谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl~
并分别滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，混匀，30 40℃下反应15 30分钟后结束~ ~
反应，并使用酶标仪读取340 nm处吸光值，以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
9.根据权利要求7所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于：所述初速度法的检测步骤如下：配置浓度在0 0.4 mmol/L之间的谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 ~
μl并分别滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，混匀，30 40℃下反应2 10分钟，并使~ ~
用酶标仪监测反应进程中340 nm处吸光度的变化量，以2 10分钟内的340 nm处吸光度变化~
值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
10.根据权利要求8或9所述的一种酶法检测谷氨酸含量的方法，其特征在于：每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，10 30 μl；NADH溶~
液，4 5 μl；双酶混合液，5 10μl，补足超纯水至75 μl。
~ ~
一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及酶法检测技术领域，具体说是一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用。
背景技术
[0002] 目前检测谷氨酸的方法主要有液相色谱法、离子色谱法、分光光度法等。液相色谱法和离子色谱法分析灵敏度高，分离效果好，适合复杂样品的分析测定，但部分液相色谱测定谷氨酸的方法中需要对样品进行衍生处理，且两者仪器费用昂贵，耗时成本高，不适用于高通量样品的分析测定。
[0003] 传统分光光度法来测定谷氨酸含量的检测体系主要基于谷氨酸脱氢酶，该方法具有操作简单，成本低，检测迅速的优点。但是该方法在用于检测血样、尿样和其余含有高浓度氨的样品时，往往由于体系中高浓度氨的存在，抑制了反应的正常进行，不能得到样品中谷氨酸含量的准确结果。这限制了谷氨酸脱氢酶及其试剂盒在上述样品中的应用。
发明内容
[0004] 本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用，以解决现有技术中存在的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种酶法检测谷氨酸含量的方法，利用甘氨酸转氨酶AT2以及3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶偶联体系，实现谷氨酸含量的测定；
其中甘氨酸转氨酶AT2的核苷酸序列为：
ATGTATCAGGAAAGGCTCTTCACACCAGGACCTGTTGAGATCCCCGATAGAGTAAGGGAAGCTCTGGGAAGGCAGATTATCCATCACAGGACAGAAGAGTTCAGGCGCGCCTTTTTGGAAGTGCGAGAACTCCTCAAGAGACTGCTGGATGACCCATCAGAGAACTTCGTCTTTTTCTCATCTTCGGGCACAGGTGCCATGGAAGCGGCTATTCTGAACTTCTTTGAAGAAGGTCAGAAGGTGCTGGTGGTAAACGGCGGAAAGTTTGGCGAGAGATGGTTTTTGCTGGCAAAACACTGGGGGCTTGAGGTTGTGGAGTACAGACTGGACTGGGGCAAGTCCGCAGACCCCGAAAAAGTCAAGGATCTGCTTAAAAAGCATCCCGATTGCAAGGGTGTGCTTCTTCAAATATCAGAAACATCTACAGGTGCTTACCACCCTGTTGAAGATATAGCGGAGGTTTGCAAAAGTGCAGACGCTCTTTTGGTAGCTGATGCCATAACAGCCTTGGGAGTTTATAACTTAAAGCCTTCGGTGGGCATTGATGTAATGGTAGGTGGGTCCCAGAAGGCTCTTATGCTTCCACCTGGACTTTCTCTCCTCTGGTTCTCTCAAAAGGCAAAAGAGAGATTAAAAGACAGAGCCTTTTACTTTAGCGTAAAAAAGGAGCTTGGCAAACAGCAAGAAGGACAGACCGCGTGGACTCCTGCCATAAGCCTCCTTTTAGCTCTGAAGGAGTCTCTTAGTCTTCTTTTGCAAGAGGGAATGGAGAGAGTAGAAAAAAGGTACAGAGCCATGTCGGAGGGAACTAAGAGAGCGATAAGTGCCTTTGGTCTTGAGGTCTTCCCAGAAAGACCAGCCATATCCATAACGGCTGTAAAAAGCGACGATGCGGAAAGGATAAGAAAGGAGCTCTTAAGACATGGTATAAGGATTGCTGGAGGACAGGACCACCTTAAAGGTAAGATTTTCAGGGTTTCCCACATGGGAGTAAGTGAAAAAGATATGCTCATGCTGATAGGTGTGCTGGAGGTAGTACTAAAAAGGCTTGGTTACCCTGTGGAGCTTGGCAGCGGTGTTTGTAGATACTCACAAACTCTAGTAGAATTTGGGCTATGGTAA；
甘氨酸转氨酶AT2的氨基酸序列为：MYQERLFTPGPVEIPDRVREALGRQIIHHRTEEFRRAFLEVRELLKRLLDDPSENFVFFSSSGTGAMEAAILNFFEEGQKVLVVNGGKFGERWFLLAKHWGLEVVEYRLDWGKSADPEKVKDLLKKHPDCKGVLLQISETSTGAYHPVEDIAEVCKSADALLVADAITALGVYNLKPSVGIDVMVGGSQKALMLPPGLSLLWFSQKAKERLKDRAFYFSVKKELGKQQEGQTAWTPAISLLLALKESLSLLLQEGMERVEKRYRAMSEGTKRAISAFGLEVFPERPAISITAVKSDDAERIRKELLRHGIRIAGGQDHLKGKIFRVSHMGVSEKDMLMLIGVLEVVLKRLGYPVELGSGVCRYSQTLVEFGLW；
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的核苷酸序列为：ATGGCAAAGGTATCGCTGGAGAAAGACAAGATTAAGTTTCTGCTGGTAGAAGGCGTGCACCAAAAGGCGCTGGAAAGCCTTCGTGCAGCTGGTTACACCAACATCGAATTTCACAAAGGCGCGCTGGATGATGAACAATTAAAAGAATCCATCCGCGATGCCCACTTCATCGGCCTGCGATCCCGTACCCATCTGACTGAAGACGTGATCAACGCCGCAGAAAAACTGGTCGCTATTGGCTGTTTCTGTATCGGAACAAACCAGGTTGATCTGGATGCGGCGGCAAAGCGCGGGATCCCGGTATTTAACGCACCGTTCTCAAATACGCGCTCTGTTGCGGAGCTGGTGATTGGCGAACTGCTGCTGCTATTGCGCGGCGTGCCGGAAGCCAATGCTAAAGCGCACCGTGGCGTGTGGAACAAACTGGCGGCGGGTTCTTTTGAAGCGCGCGGCAAAAAGCTGGGTATCATCGGCTACGGTCATATTGGTACGCAATTGGGCATTCTGGCTGAATCGCTGGGAATGTATGTTTACTTTTATGATATTGAAAATAAACTGCCGCTGGGCAACGCCACTCAGGTACAGCATCTTTCTGACCTGCTGAATATGAGCGATGTGGTGAGTCTGCATGTACCAGAGAATCCGTCCACCAAAAATATGATGGGCGCGAAAGAAATTTCACTAATGAAGCCCGGCTCGCTGCTGATTAATGCTTCGCGCGGTACTGTGGTGGATATTCCGGCGCTGTGTGATGCGCTGGCGAGCAAACATCTGGCGGGGGCGGCAATCGACGTATTCCCGACGGAACCGGCGACCAATAGCGATCCATTTACCTCTCCGCTGTGTGAATTCGACAACGTCCTTCTGACGCCACACATTGGCGGTTCGACTCAGGAAGCGCAGGAGAATATCGGCCTGGAAGTTGCGGGTAAATTGATCAAGTATTCTGACAATGGCTCAACGCTCTCTGCGGTGAACTTCCCGGAAGTCTCGCTGCCACTGCACGGTGGGCGTCGTCTGATGCACATCCACGAAAACCGTCCGGGCGTGCTAACTGCGCTGAACAAAATCTTCGCCGAGCAGGGCGTCAACATCGCCGCGCAATATCTGCAAACTTCCGCCCAGATGGGTTATGTGGTTATTGATATTGAAGCCGACGAAGACGTTGCCGAAAAAGCGCTGCAGGCAATGAAAGCTATTCCGGGTACCATTCGCGCCCGTCTGCTGTACTAA；
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的氨基酸序列为：MAKVSLEKDKIKFLLVEGVHQKALESLRAAGYTNIEFHKGALDDEQLKESIRDAHFIGLRSRTHLTEDVINAAEKLVAIGCFCIGTNQVDLDAAAKRGIPVFNAPFSNTRSVAELVIGELLLLLRGVPEANAKAHRGVWNKLAAGSFEARGKKLGIIGYGHIGTQLGILAESLGMYVYFYDIENKLPLGNATQVQHLSDLLNMSDVVSLHVPENPSTKNMMGAKEISLMKPGSLLINASRGTVVDIPALCDALASKHLAGAAIDVFPTEPATNSDPFTSPLCEFDNVLLTPHIGGSTQEAQENIGLEVAGKLIKYSDNGSTLSAVNFPEVSLPLHGGRRLMHIHENRPGVLTALNKIFAEQGVNIAAQYLQTSAQMGYVVIDIEADEDVAEKALQAMKAIPGTIRARLLY。
其中甘氨酸转氨酶AT2的核苷酸序列为：
ATGTATCAGGAAAGGCTCTTCACACCAGGACCTGTTGAGATCCCCGATAGAGTAAGGGAAGCTCTGGGAAGGCAGATTATCCATCACAGGACAGAAGAGTTCAGGCGCGCCTTTTTGGAAGTGCGAGAACTCCTCAAGAGACTGCTGGATGACCCATCAGAGAACTTCGTCTTTTTCTCATCTTCGGGCACAGGTGCCATGGAAGCGGCTATTCTGAACTTCTTTGAAGAAGGTCAGAAGGTGCTGGTGGTAAACGGCGGAAAGTTTGGCGAGAGATGGTTTTTGCTGGCAAAACACTGGGGGCTTGAGGTTGTGGAGTACAGACTGGACTGGGGCAAGTCCGCAGACCCCGAAAAAGTCAAGGATCTGCTTAAAAAGCATCCCGATTGCAAGGGTGTGCTTCTTCAAATATCAGAAACATCTACAGGTGCTTACCACCCTGTTGAAGATATAGCGGAGGTTTGCAAAAGTGCAGACGCTCTTTTGGTAGCTGATGCCATAACAGCCTTGGGAGTTTATAACTTAAAGCCTTCGGTGGGCATTGATGTAATGGTAGGTGGGTCCCAGAAGGCTCTTATGCTTCCACCTGGACTTTCTCTCCTCTGGTTCTCTCAAAAGGCAAAAGAGAGATTAAAAGACAGAGCCTTTTACTTTAGCGTAAAAAAGGAGCTTGGCAAACAGCAAGAAGGACAGACCGCGTGGACTCCTGCCATAAGCCTCCTTTTAGCTCTGAAGGAGTCTCTTAGTCTTCTTTTGCAAGAGGGAATGGAGAGAGTAGAAAAAAGGTACAGAGCCATGTCGGAGGGAACTAAGAGAGCGATAAGTGCCTTTGGTCTTGAGGTCTTCCCAGAAAGACCAGCCATATCCATAACGGCTGTAAAAAGCGACGATGCGGAAAGGATAAGAAAGGAGCTCTTAAGACATGGTATAAGGATTGCTGGAGGACAGGACCACCTTAAAGGTAAGATTTTCAGGGTTTCCCACATGGGAGTAAGTGAAAAAGATATGCTCATGCTGATAGGTGTGCTGGAGGTAGTACTAAAAAGGCTTGGTTACCCTGTGGAGCTTGGCAGCGGTGTTTGTAGATACTCACAAACTCTAGTAGAATTTGGGCTATGGTAA；
甘氨酸转氨酶AT2的氨基酸序列为：MYQERLFTPGPVEIPDRVREALGRQIIHHRTEEFRRAFLEVRELLKRLLDDPSENFVFFSSSGTGAMEAAILNFFEEGQKVLVVNGGKFGERWFLLAKHWGLEVVEYRLDWGKSADPEKVKDLLKKHPDCKGVLLQISETSTGAYHPVEDIAEVCKSADALLVADAITALGVYNLKPSVGIDVMVGGSQKALMLPPGLSLLWFSQKAKERLKDRAFYFSVKKELGKQQEGQTAWTPAISLLLALKESLSLLLQEGMERVEKRYRAMSEGTKRAISAFGLEVFPERPAISITAVKSDDAERIRKELLRHGIRIAGGQDHLKGKIFRVSHMGVSEKDMLMLIGVLEVVLKRLGYPVELGSGVCRYSQTLVEFGLW；
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的核苷酸序列为：ATGGCAAAGGTATCGCTGGAGAAAGACAAGATTAAGTTTCTGCTGGTAGAAGGCGTGCACCAAAAGGCGCTGGAAAGCCTTCGTGCAGCTGGTTACACCAACATCGAATTTCACAAAGGCGCGCTGGATGATGAACAATTAAAAGAATCCATCCGCGATGCCCACTTCATCGGCCTGCGATCCCGTACCCATCTGACTGAAGACGTGATCAACGCCGCAGAAAAACTGGTCGCTATTGGCTGTTTCTGTATCGGAACAAACCAGGTTGATCTGGATGCGGCGGCAAAGCGCGGGATCCCGGTATTTAACGCACCGTTCTCAAATACGCGCTCTGTTGCGGAGCTGGTGATTGGCGAACTGCTGCTGCTATTGCGCGGCGTGCCGGAAGCCAATGCTAAAGCGCACCGTGGCGTGTGGAACAAACTGGCGGCGGGTTCTTTTGAAGCGCGCGGCAAAAAGCTGGGTATCATCGGCTACGGTCATATTGGTACGCAATTGGGCATTCTGGCTGAATCGCTGGGAATGTATGTTTACTTTTATGATATTGAAAATAAACTGCCGCTGGGCAACGCCACTCAGGTACAGCATCTTTCTGACCTGCTGAATATGAGCGATGTGGTGAGTCTGCATGTACCAGAGAATCCGTCCACCAAAAATATGATGGGCGCGAAAGAAATTTCACTAATGAAGCCCGGCTCGCTGCTGATTAATGCTTCGCGCGGTACTGTGGTGGATATTCCGGCGCTGTGTGATGCGCTGGCGAGCAAACATCTGGCGGGGGCGGCAATCGACGTATTCCCGACGGAACCGGCGACCAATAGCGATCCATTTACCTCTCCGCTGTGTGAATTCGACAACGTCCTTCTGACGCCACACATTGGCGGTTCGACTCAGGAAGCGCAGGAGAATATCGGCCTGGAAGTTGCGGGTAAATTGATCAAGTATTCTGACAATGGCTCAACGCTCTCTGCGGTGAACTTCCCGGAAGTCTCGCTGCCACTGCACGGTGGGCGTCGTCTGATGCACATCCACGAAAACCGTCCGGGCGTGCTAACTGCGCTGAACAAAATCTTCGCCGAGCAGGGCGTCAACATCGCCGCGCAATATCTGCAAACTTCCGCCCAGATGGGTTATGTGGTTATTGATATTGAAGCCGACGAAGACGTTGCCGAAAAAGCGCTGCAGGCAATGAAAGCTATTCCGGGTACCATTCGCGCCCGTCTGCTGTACTAA；
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的氨基酸序列为：MAKVSLEKDKIKFLLVEGVHQKALESLRAAGYTNIEFHKGALDDEQLKESIRDAHFIGLRSRTHLTEDVINAAEKLVAIGCFCIGTNQVDLDAAAKRGIPVFNAPFSNTRSVAELVIGELLLLLRGVPEANAKAHRGVWNKLAAGSFEARGKKLGIIGYGHIGTQLGILAESLGMYVYFYDIENKLPLGNATQVQHLSDLLNMSDVVSLHVPENPSTKNMMGAKEISLMKPGSLLINASRGTVVDIPALCDALASKHLAGAAIDVFPTEPATNSDPFTSPLCEFDNVLLTPHIGGSTQEAQENIGLEVAGKLIKYSDNGSTLSAVNFPEVSLPLHGGRRLMHIHENRPGVLTALNKIFAEQGVNIAAQYLQTSAQMGYVVIDIEADEDVAEKALQAMKAIPGTIRARLLY。
[0006] 优选的，一种酶法检测谷氨酸含量的方法，包括以下步骤：（一）蛋白的外源表达及分离纯化：
（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸转氨酶AT2的基因编码序列和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的基因编码序列，然后分别通过全基因合成目的基因及PCR得到目的基因的方法（其中serA基因克隆的模板为大肠杆菌E. coli k-12菌株的基因组），分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因；
（2）将步骤（1）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因分别采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-AT2与pET28a-SerA质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD600约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，37℃，诱导表达4小时，分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
（3）分离纯化目的蛋白：将含有目的蛋白的菌液低温离心收集菌体后，破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白包括步骤（2）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
（二）双酶偶联法检测谷氨酸：
（1）配制反应混合液：
配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 mM 乙醛酸钠水溶液，5 mM NADH溶液，备用；
配置含有甘氨酸转氨酶AT2与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶混合液500 μl，包含有
100 μl 3.4 mg/ml纯化后的AT2目的蛋白和80 μl 32 mg/ml纯化后的SerA目的蛋白，再加入320 μl的缓冲液B补足至500 μl，备用；
缓冲液 B的组成为：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。
（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸转氨酶AT2的基因编码序列和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的基因编码序列，然后分别通过全基因合成目的基因及PCR得到目的基因的方法（其中serA基因克隆的模板为大肠杆菌E. coli k-12菌株的基因组），分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因；
（2）将步骤（1）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因分别采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-AT2与pET28a-SerA质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD600约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，37℃，诱导表达4小时，分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
（3）分离纯化目的蛋白：将含有目的蛋白的菌液低温离心收集菌体后，破碎菌体，离心收集上清液，采用镍柱分离、纯化目的蛋白后备用，所述的目的蛋白包括步骤（2）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
（二）双酶偶联法检测谷氨酸：
（1）配制反应混合液：
配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 mM 乙醛酸钠水溶液，5 mM NADH溶液，备用；
配置含有甘氨酸转氨酶AT2与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶混合液500 μl，包含有
100 μl 3.4 mg/ml纯化后的AT2目的蛋白和80 μl 32 mg/ml纯化后的SerA目的蛋白，再加入320 μl的缓冲液B补足至500 μl，备用；
缓冲液 B的组成为：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。
[0007] 根据上述溶液配置反应混合液，其中每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，10 30 μl；NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10μl；补足~ ~ ~超纯水至75 μl。
[0008] （2）终点法制作谷氨酸浓度标准曲线：配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别~
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应15 30分钟后结束反~ ~
应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补~
足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；
NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取~ ~
340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线；
（3）初速度法制作谷氨酸浓度标准曲线
配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别~
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应2 10分钟。空白对照~ ~
的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至~
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以2 10分钟内340 nm处吸光度变化值为~
纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应15 30分钟后结束反~ ~
应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补~
足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；
NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取~ ~
340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线；
（3）初速度法制作谷氨酸浓度标准曲线
配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别~
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应2 10分钟。空白对照~ ~
的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至~
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以2 10分钟内340 nm处吸光度变化值为~
纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
[0009] （三）尿液、血液、或一般生物试样中的谷氨酸检测：（1）尿液的处理及检测
终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40 ℃下反应15 30分钟~ ~
后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5~
10μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，
25 μl；NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10 μl；尿液25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结~ ~
束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40 ℃下反应15 30分钟~ ~
后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5~
10μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，
25 μl；NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10 μl；尿液25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结~ ~
束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
[0010] 根据尿液样本吸光度的变化值及终点法制作的谷氨酸标准曲线计算得到尿液的谷氨酸含量。
[0011] 初速度法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40 ℃下反应2~ ~10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μ~
l；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。
l；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。
[0012] 根据2 10分钟内尿液样本吸光度的变化值及初速度法制作的谷氨酸标准曲线计~算得到尿液的谷氨酸含量。
[0014] 血液样本在进行检测时，需要对血液样本进行预处理，步骤如下：抗凝管中的血液需要首先低速离心得到血浆，条件是4 ℃，4000 rpm，10 min，然后再高速离心去除血浆中可能干扰实验的杂质，条件是4 ℃，14000 rpm，10 min。离心后取上清进行谷氨酸含量的测定。
[0015] 终点法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应15 30分钟后结束反~ ~应，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补~
足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；
NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10 μl；血浆或血清25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结~ ~
束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；
NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10 μl；血浆或血清25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结~ ~
束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
[0016] 根据血浆或血清样本吸光度的变化值及终点法制作的谷氨酸标准曲线计算得到血液的谷氨酸含量。
[0017] 初速度法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应2 10分钟，空白对~ ~照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至~
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。
[0018] 根据2 10分钟内血浆或血清样本吸光度的变化值及初速度法制作的谷氨酸标准~曲线计算得到血浆或血清样本的谷氨酸含量。
[0019] （3）一般生物试样的检测终点法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有75 μl的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应15 30分钟后结束反应，空白对照的反应混合液的比~ ~
例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值~
读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5~
10 μl；一般生物试样25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处~
吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。根据一般生物试样吸光度的变化值及终点法制作的谷氨酸标准曲线计算得到其谷氨酸含量。
例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值~
读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5~
10 μl；一般生物试样25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处~
吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。根据一般生物试样吸光度的变化值及终点法制作的谷氨酸标准曲线计算得到其谷氨酸含量。
[0020] 初速度法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有75 μl的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应2 10分钟，空白对照的反应混合液的比例组成~ ~包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪监测340 ~
nm处吸光值的变化。
nm处吸光值的变化。
[0021] 根据2 10分钟内一般生物试样吸光度的变化值及初速度法制作的谷氨酸标准曲~线计算得到血浆或血清样本的谷氨酸含量。
[0022] 优选的，分离纯化目的蛋白的步骤为：A. 将含有目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A中。离心条件是反应温度为4 16 ℃，转速为10000 12000 rpm；缓冲液A由~ ~
以下组分组成：1 L缓冲液A中含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。所述的目的蛋白包括步骤（2）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
B. 使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，在4 16 ℃，10000 12000rpm离心30 50 min，收~ ~ ~
集上清液；
C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
D. 将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，在4 16 ℃，5000 6000 rpm下离心后，进~ ~
行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
以下组分组成：1 L缓冲液A中含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。所述的目的蛋白包括步骤（2）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
B. 使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，在4 16 ℃，10000 12000rpm离心30 50 min，收~ ~ ~
集上清液；
C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
D. 将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，在4 16 ℃，5000 6000 rpm下离心后，进~ ~
行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
[0023] 优选的，所述的双酶偶联法检测谷氨酸方法中的甘氨酸转氨酶采用以下编码基因序列：第一，与甘氨酸转氨酶AT2的编码基因序列同源相似性大于50%，且编码蛋白具有甘氨酸转氨酶活性的基因序列；第二，与甘氨酸转氨酶AT2蛋白的氨基酸序列一致性大于40%，且编码蛋白具有甘氨酸转氨酶活性。
[0024] 优选的，所述的双酶偶联法检测谷氨酸方法中的3-磷酸甘油酸脱氢酶采用以下编码基因序列：第一，与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的编码基因序列同源相似性大于50%，且编码蛋白具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性的基因序列；第二，与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA蛋白的氨基酸序列一致性大于40%，且编码蛋白具有3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
[0025] 本发明还包括一种酶法检测谷氨酸含量的方法的应用，用于开发谷氨酸检测试剂盒。例如，根据本发明中双酶偶联法测定谷氨酸含量的原理，将按照本发明步骤制备的AT2、SerA，连同100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 mM 乙醛酸钠水溶液，5 mM NADH溶液等组分置于试剂盒内，按照本发明步骤制作使用说明书即可容易地开发试剂盒。
[0026] 如图1酶法检测谷氨酸含量的方法的原理示意图，谷氨酸和乙醛酸在甘氨酸转氨酶（glycine aminotransferase，AT2）的作用下转变为甘氨酸和2-酮戊二酸；3-磷酸甘油酸脱氢酶（3-phosophoglycerate dehydrogenase，SerA）催化2-酮戊二酸还原成2-羟基戊二酸，同时NADH被氧化成NAD+，使得体系在340 nm处的吸光度减少；本发明的检测方法，除了乙醛酸和NADH通过商品化购买外，需要制备AT2和SerA，根据文献报道，结合序列比对分析手段，确定AT2和SerA的编码基因，通过全基因合成或PCR克隆获得目的基因，连接表达载体，转入专用于蛋白表达的大肠杆菌或其他表达宿主，实现目的蛋白的大量外源化表达和分离提纯；其次构建含AT2、SerA、乙醛酸、谷氨酸、及NADH的反应体系；优化缓冲液、pH、温度、各酶及各反应物的浓度及配比等因素对体系吸光度变化的影响，估算检测限及定量限，确定合适的谷氨酸检测范围，制作标准曲线；
最后，收集临床样本（包括血液、尿液等体液或者组织等）或一般生物样本制备样品，利用该检测体系检测谷氨酸含量；需要注意的是谷氨酸和糖尿病、脑部疾病等疾病均有相关度，检测该数值很有必要，但是该数值只是一个中间值，不能确诊某种疾病，要确诊还需要到相应的专业科室进行检查。
最后，收集临床样本（包括血液、尿液等体液或者组织等）或一般生物样本制备样品，利用该检测体系检测谷氨酸含量；需要注意的是谷氨酸和糖尿病、脑部疾病等疾病均有相关度，检测该数值很有必要，但是该数值只是一个中间值，不能确诊某种疾病，要确诊还需要到相应的专业科室进行检查。
[0027] 由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：本发明的酶法检测谷氨酸含量的方法克服了传统谷氨酸脱氢酶方法不适用于高浓度氨环境的缺陷，创造性地通过甘氨酸转氨酶AT2和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA双酶偶联的方法，将谷氨酸脱氨形成α-酮戊二酸，又通过α-酮戊二酸的还原反应，以NADH含量的减少来快速正确表征体系中的谷氨酸含量。本发明灵敏度高，检测迅速稳定，重复性好，操作简便，成本较低，适用范围较广。
[0029] 图1为酶法检测谷氨酸含量的方法的原理示意图；图2为终点法制作的实施例3所得的0-100 μM谷氨酸浓度下的标准曲线；
图3为初速度法制作的实施例3所得的0-100 μM谷氨酸浓度下的标准曲线。
图3为初速度法制作的实施例3所得的0-100 μM谷氨酸浓度下的标准曲线。
具体实施方式
[0030] 下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。
[0031] 一种酶法检测谷氨酸含量的方法，包括以下步骤：（一）蛋白的外源表达及分离纯化：
（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸转氨酶AT2的基因编码序列和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的基因编码序列，然后分别通过全基因合成目的基因及PCR得到目的基因的方法（其中serA基因克隆的模板为大肠杆菌E. coli k-12菌株的基因组），分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因；
（2）将步骤（1）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因分别采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-AT2与pET28a-SerA质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD600约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，37℃，诱导表达4小时，分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
（3）分离纯化目的蛋白：
A. 将含有目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将蛋白悬浮于缓冲液A中。离心条件是4 16 ℃，转速是10000 12000 rpm；缓冲液A由以下组分组~ ~
成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。目的蛋白为甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
B. 使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，在4 16 ℃，10000 12000rpm下离心30 50 min，~ ~ ~
收集上清液；
C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
D. 将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，在4 16 ℃，5000 6000 rpm下离心后，进~ ~
行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸转氨酶AT2的基因编码序列和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的基因编码序列，然后分别通过全基因合成目的基因及PCR得到目的基因的方法（其中serA基因克隆的模板为大肠杆菌E. coli k-12菌株的基因组），分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因；
（2）将步骤（1）所得的甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因分别采用分子克隆连入pET28a表达载体，将克隆后测序正确的pET28a-AT2与pET28a-SerA质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中后，在装有Luria-Bertani (LB) 培养基的试管中37℃培养过夜，然后转接入装有LB培养基的摇瓶中，37℃、220 rpm培养至OD600约0.6时，加入终浓度为1 mM的IPTG，37℃，诱导表达4小时，分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
（3）分离纯化目的蛋白：
A. 将含有目的蛋白的菌液低温离心，去除上清液，收集菌体，加入缓冲液A，并将蛋白悬浮于缓冲液A中。离心条件是4 16 ℃，转速是10000 12000 rpm；缓冲液A由以下组分组~ ~
成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9。目的蛋白为甘氨酸转氨酶AT2目的蛋白和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的蛋白；
B. 使用高压细胞破碎仪破碎细胞后，在4 16 ℃，10000 12000rpm下离心30 50 min，~ ~ ~
收集上清液；
C. 上清液过镍柱，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
D. 将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，在4 16 ℃，5000 6000 rpm下离心后，进~ ~
行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液 B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
[0032] （二）双酶偶联法检测谷氨酸：（1）配制反应混合液：
配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 mM 乙醛酸钠水溶液，5 mM NADH溶液，备用；
配置含有甘氨酸转氨酶AT2与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶混合液500 μl，其中包含有100 μl 3.4 mg/ml纯化后的AT2目的蛋白和80 μl 32 mg/ml纯化后的SerA目的蛋白，再加入320 μl的缓冲液 B补足至500 μl，备用；
根据上述溶液配置反应混合液，其中每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，10 30 μl；NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯~ ~ ~
水至75 μl。
配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 mM 乙醛酸钠水溶液，5 mM NADH溶液，备用；
配置含有甘氨酸转氨酶AT2与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶混合液500 μl，其中包含有100 μl 3.4 mg/ml纯化后的AT2目的蛋白和80 μl 32 mg/ml纯化后的SerA目的蛋白，再加入320 μl的缓冲液 B补足至500 μl，备用；
根据上述溶液配置反应混合液，其中每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，10 30 μl；NADH溶液，4 5 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯~ ~ ~
水至75 μl。
[0033] （2）终点法制作谷氨酸浓度标准曲线：配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别~
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应15 30分钟。空白对~ ~
照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至~
100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，4~
5 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸~
光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线；
（3）初速度法制作谷氨酸浓度标准曲线
配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别~
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应2 10分钟。空白对照~ ~
的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至~
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以2 10分钟内340 nm处吸光度变化值为~
纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应15 30分钟。空白对~ ~
照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至~
100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，4~
5 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸~
光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线；
（3）初速度法制作谷氨酸浓度标准曲线
配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl并分别~
滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，30 40℃下反应2 10分钟。空白对照~ ~
的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 10μl；补足超纯水至~
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以2 10分钟内340 nm处吸光度变化值为~
纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
[0034] 本发明的操作步骤全基因合成目的基因委托交给生物公司合成，本实施例的该步骤由南京金斯瑞生物科技有限公司来合成；乙醛酸钠英文名为Sodium glyoxylate monohydrate，CAS号918149-31-2；
NADH英文名为Nicotinamide adenine dinucleotide，CAS号74927-11-0；
本发明采用的去蛋白试剂盒为Biovision。
NADH英文名为Nicotinamide adenine dinucleotide，CAS号74927-11-0；
本发明采用的去蛋白试剂盒为Biovision。
[0035] 以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
[0036] 实施例1一种酶法检测谷氨酸含量的方法，包括以下步骤：
（一）蛋白的外源表达及分离纯化：
（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸转氨酶AT2的基因编码序列和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的基因编码序列，然后分别通过全基因合成目的基因及PCR得到目的基因的方法（其中serA基因克隆的模板为大肠杆菌E. coli k-12菌株的基因组），分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因；
根据文献“Masafumi Kameya, et al. (2010) Purification of three
aminotransferases from Hydrogenobacter thermophilus TK-6 – novel types of alanine or glycine aminotransferase. FEBS Journal, 277:1876-1885.”报道 Hydrogenobacter thermophilus TK-6菌株中存在甘氨酸转氨酶AT2（amnT2），在NCBI的Gene数据库中搜索amnT2即可获取基因序列；
根据文献“Genshi Zhao, et al. (1996) A novel α-ketoglutarate reductase activity of the sera-encoded 3-phosphoglycerate dehydrogenase of Escherichia coli K-12 and its possible implications for human 2-hydroxyglutaric aciduria. Journal of Bacteriology, 178(1):232-239.”报道Escherichia coli K-12菌株中存在
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase ，NP_311811.1），在NCBI的Gene数据库中搜索NP_311811.1即可获取基因序列；
甘氨酸转氨酶AT2通过全基因合成目的基因委托生物公司完成，3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA通过以Escherichia coli K-12 基因组为模板进行的PCR得到目的基因；
其中，AT2蛋白的外源表达和分离纯化包括以下具体步骤：
（1）Masafumi Kameya, et al. (2010) Purification of three aminotransferases from Hydrogenobacter thermophilus TK-6 – novel types of alanine or glycine aminotransferase. FEBS Journal, 277:1876-1885.
上面这个文献报道 Hydrogenobacter thermophilus TK-6菌株中存在甘氨酸转氨酶AT（2 amnT2），在NCBI的Gene数据库中搜索amnT2即可获取基因序列；
（2）将amnT2序列送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成；两端设计酶切位点EcoRI和HindIII；
（3）利用EcoRI和HindIII酶切上述合成的amnT2，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；
（4）利用EcoRI和HindIII酶切pET28a载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；
（5）利用Solution I（连接酶）将步骤3和4的片段构建连接反应体系，16 ℃连接2 h；
（6）常规方法化学将连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板；
（7）挑取5个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；
（8）将提取的质粒EcoRI和HindIII酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；
（9）测序验证步骤8正确克隆的正确性；保存菌株于10％的甘油中。
（一）蛋白的外源表达及分离纯化：
（1）结合序列比对分析手段，选择甘氨酸转氨酶AT2的基因编码序列和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的基因编码序列，然后分别通过全基因合成目的基因及PCR得到目的基因的方法（其中serA基因克隆的模板为大肠杆菌E. coli k-12菌株的基因组），分别得到甘氨酸转氨酶AT2目的基因和3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA目的基因；
根据文献“Masafumi Kameya, et al. (2010) Purification of three
aminotransferases from Hydrogenobacter thermophilus TK-6 – novel types of alanine or glycine aminotransferase. FEBS Journal, 277:1876-1885.”报道 Hydrogenobacter thermophilus TK-6菌株中存在甘氨酸转氨酶AT2（amnT2），在NCBI的Gene数据库中搜索amnT2即可获取基因序列；
根据文献“Genshi Zhao, et al. (1996) A novel α-ketoglutarate reductase activity of the sera-encoded 3-phosphoglycerate dehydrogenase of Escherichia coli K-12 and its possible implications for human 2-hydroxyglutaric aciduria. Journal of Bacteriology, 178(1):232-239.”报道Escherichia coli K-12菌株中存在
3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase ，NP_311811.1），在NCBI的Gene数据库中搜索NP_311811.1即可获取基因序列；
甘氨酸转氨酶AT2通过全基因合成目的基因委托生物公司完成，3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA通过以Escherichia coli K-12 基因组为模板进行的PCR得到目的基因；
其中，AT2蛋白的外源表达和分离纯化包括以下具体步骤：
（1）Masafumi Kameya, et al. (2010) Purification of three aminotransferases from Hydrogenobacter thermophilus TK-6 – novel types of alanine or glycine aminotransferase. FEBS Journal, 277:1876-1885.
上面这个文献报道 Hydrogenobacter thermophilus TK-6菌株中存在甘氨酸转氨酶AT（2 amnT2），在NCBI的Gene数据库中搜索amnT2即可获取基因序列；
（2）将amnT2序列送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成；两端设计酶切位点EcoRI和HindIII；
（3）利用EcoRI和HindIII酶切上述合成的amnT2，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；
（4）利用EcoRI和HindIII酶切pET28a载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；
（5）利用Solution I（连接酶）将步骤3和4的片段构建连接反应体系，16 ℃连接2 h；
（6）常规方法化学将连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板；
（7）挑取5个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；
（8）将提取的质粒EcoRI和HindIII酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；
（9）测序验证步骤8正确克隆的正确性；保存菌株于10％的甘油中。
[0037] （10）将步骤9中确定的正确克隆接入LB瓶中，等OD600 = 0.6时，加入终浓度1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达，37℃，200 rpm，诱导4 h；（11）将菌液4℃、12000rpm离心5分钟，去除上清，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A（缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，
37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9）中；
(12)利用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃，11000rpm离心30 min，收集上清液；
(13) 上清液过镍柱，基于亲和层析的原理纯化蛋白。使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
(14) 将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4 ℃，5000 rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为
7.9。。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9）中；
(12)利用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃，11000rpm离心30 min，收集上清液；
(13) 上清液过镍柱，基于亲和层析的原理纯化蛋白。使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
(14) 将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4 ℃，5000 rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为
7.9。。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
[0038] 其中，SerA蛋白的外源表达和分离纯化包括以下具体步骤：（1）Genshi Zhao, et al. (1996) A novel α-ketoglutarate reductase activity of the sera-encoded 3-phosphoglycerate dehydrogenase of Escherichia coli K-12 and its possible implications for human 2-hydroxyglutaric aciduria. Journal of Bacteriology, 178(1):232-239.
上面这个文献报道Escherichia coli K-12菌株中存在3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA（D-
3-phosphoglycerate dehydrogenase, NP_311811.1），在NCBI的Gene数据库中搜索NP_
311811.1即可获取基因序列。
上面这个文献报道Escherichia coli K-12菌株中存在3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA（D-
3-phosphoglycerate dehydrogenase, NP_311811.1），在NCBI的Gene数据库中搜索NP_
311811.1即可获取基因序列。
[0039] （2）按照获取的基因序列设计serA基因的引物，两端设计酶切位点SacI和NotI，引物交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，以Escherichia coli K-12基因组为模板，使用KOD聚合酶进行PCR；（3）PCR得到的产物进行DNA电泳后，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；
（4）利用SacI和NotI酶切上述PCR得到的SerA，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；
利用Nanodrop 2000测定浓度；
（5）利用SacI和NotI酶切pET28a载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；
（6）利用Solution I（连接酶）将步骤4和5的片段构建连接反应体系，16 ℃连接2 h；
（7）常规方法化学将连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板；
（8）挑取3个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；
（9）将提取的质粒SacI和NotI酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；
（10）测序验证步骤9正确克隆的正确性；保存菌株于10％的甘油中。
（4）利用SacI和NotI酶切上述PCR得到的SerA，切胶，采用胶回收试剂盒回收基因片段；
利用Nanodrop 2000测定浓度；
（5）利用SacI和NotI酶切pET28a载体，切胶，采用胶回收试剂盒回收载体片段；利用Nanodrop 2000测定浓度；
（6）利用Solution I（连接酶）将步骤4和5的片段构建连接反应体系，16 ℃连接2 h；
（7）常规方法化学将连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板；
（8）挑取3个单克隆至LB培养基，过夜培养后，质粒小量提取试剂盒提取质粒；
（9）将提取的质粒SacI和NotI酶切，凝胶电泳根据片段大小确定正确的克隆；
（10）测序验证步骤9正确克隆的正确性；保存菌株于10％的甘油中。
[0040] （11）将步骤10中确定的正确克隆接入LB瓶中，等OD600＝0.6时，加入终浓度1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达，37℃，200 rpm，诱导4 h；（12）将菌液4℃、12000rpm离心5分钟，去除上清，收集菌体，加入缓冲液A，并将菌体悬浮于缓冲液A（缓冲液A由以下组分组成：1 L缓冲液A中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，
37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9）中；
（13）利用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃，11000 rpm离心50 min，收集上清液；
（14）上清液过镍柱，基于亲和层析的原理纯化蛋白。使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
（15）将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4 ℃，5000 rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
37.3 g氯化钾，100 ml甘油，使用盐酸调节pH为7.9）中；
（13）利用高压细胞破碎仪破碎细胞后，4 ℃，11000 rpm离心50 min，收集上清液；
（14）上清液过镍柱，基于亲和层析的原理纯化蛋白。使用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，洗脱液中咪唑浓度为20 mM 500 mM；
~
（15）将500 mM洗脱得到的酶液置于超滤管中，4 ℃，5000 rpm进行蛋白浓缩，并在浓缩过程中添加缓冲液B来悬浮蛋白。缓冲液B由以下组分组成：1 L缓冲液B中，含有2.42 g三羟甲基氨基甲烷，7.45 g氯化钾，200 ml甘油，0.154 g二硫苏糖醇，使用盐酸调节pH为7.9。浓缩后的蛋白溶液分装后于-80℃冰箱冷冻保存。
[0041] （二）双酶偶联法检测谷氨酸：（1）配制反应混合液：
配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 mM 乙醛酸钠水溶液，5 mM NADH溶液，备用；
配置含有甘氨酸转氨酶AT2与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶混合液500 μl，包含有100 μl 3.4 mg/ml纯化后的AT2目的蛋白和80 μl 32 mg/ml纯化后的SerA目的蛋白，再加入320 μl的缓冲液B补足至500 μl，备用；
根据上述溶液配置反应混合液，其中每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，30 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至75 μl。
配置100 mM TEA-HCl溶液（pH 9.0），100 mM 乙醛酸钠水溶液，5 mM NADH溶液，备用；
配置含有甘氨酸转氨酶AT2与3-磷酸甘油酸脱氢酶SerA的双酶混合液500 μl，包含有100 μl 3.4 mg/ml纯化后的AT2目的蛋白和80 μl 32 mg/ml纯化后的SerA目的蛋白，再加入320 μl的缓冲液B补足至500 μl，备用；
根据上述溶液配置反应混合液，其中每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，30 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至75 μl。
[0042] （2）制作谷氨酸浓度标准曲线：终点法：配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 μl~
并分别滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应20分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线；
初速度法：配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 ~
μl并分别滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以5分钟内340 nm处吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
并分别滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应20分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线；
初速度法：配置浓度在0 0.4 mM之间的一系列谷氨酸标准品溶液，每个浓度分别取25 ~
μl并分别滴入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至
100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。以5分钟内340 nm处吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线。
[0043] （三）尿液、血液、或一般生物试样中的谷氨酸检测：（1）尿液的处理及检测
终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37 ℃下反应20分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；
NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5μl；尿液，25 μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
终点法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37 ℃下反应20分钟后结束反应。空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；
NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5μl；尿液，25 μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
[0044] 根据尿液样本吸光度的变化值及终点法制作的谷氨酸标准曲线计算得到尿液的谷氨酸含量。
[0045] 初速度法：使用去蛋白试剂盒处理尿液，离心获取上清液，得到尿液样本；检测时取25 μl的尿液加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37 ℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。
[0046] 根据5分钟内尿液样本吸光度的变化值及初速度法制作的谷氨酸标准曲线计算得到尿液的谷氨酸含量。
[0047] （2）血液的处理及检测本发明中所用的血液样本是存放在抗凝管中，因此，血液样本含有血液样本抗凝剂，血液抗凝管中抗凝剂为10%草酸钾-氟化钠。
[0048] 血液样本在进行检测时，需要对血液样本进行预处理，步骤如下：抗凝管中的血液需要首先低速离心得到血浆，条件是4 ℃，4000 rpm，10 min，然后再高速离心去除血浆中可能干扰实验的杂质，条件是4 ℃，14000 rpm，10 min。离心后取上清进行谷氨酸含量的测定。
[0049] 终点法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应20分钟后结束反应，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5μl；血浆或血清，25 μl；补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
[0050] 根据血浆或血清样本吸光度的变化值及终点法制作的谷氨酸标准曲线计算得到血液的谷氨酸含量。
[0051] 初速度法：血液分离获得血浆或血清，得到血液样本；检测时取25 μl的血浆或血清加入装有75 μl反应混合液的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。
[0052] 根据5分钟内血浆或血清样本吸光度的变化值及初速度法制作的谷氨酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的谷氨酸含量。
[0053] （3）一般生物试样的检测终点法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有75 μl的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应20分钟后结束反应，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5μl；一般生物试样，25 μl；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
[0054] 根据一般生物试样吸光度的变化值及终点法制作的谷氨酸标准曲线计算得到其谷氨酸含量。
[0055] 初速度法：一般生物样本经过处理后取上清液，取25 μl的生物试样加入装有75 μl的96孔酶标板中，轻轻混匀，37℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5 μl；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化。
[0056] 根据5分钟内一般生物试样吸光度的变化值及初速度法制作的谷氨酸标准曲线计算得到血浆或血清样本的谷氨酸含量。
[0057] 实施例2除了每75 μl混合液的比例组成以外，其余条件和实施例1一致；
每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，20 μl；
NADH溶液，4 μl；双酶混合液，10 μl；超纯水，16 μl。
每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，20 μl；
NADH溶液，4 μl；双酶混合液，10 μl；超纯水，16 μl。
[0058] 实施例3除了每75 μl混合液的比例组成以外，其余条件和实施例1一致；
每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，10 μl；
NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5 μl；超纯 水，30 μl。
每75 μl的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；乙醛酸钠水溶液，10 μl；
NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5 μl；超纯 水，30 μl。
[0059] 使用酶标仪对340 nm处的吸光值进行终点法或者初速度法的检测后，以吸光度变化值为纵坐标，以谷氨酸标准品溶液浓度为横坐标绘制谷氨酸浓度标准曲线，通过Excel等软件绘制标准曲线，结果发现0～100 μΜ谷氨酸浓度下具有良好的线性关系，因此选择谷氨酸浓度0 100 μΜ作为主要的测量范围，如图2所示为终点法制作的0～100 μΜ谷氨酸浓~度下的标准曲线，如图3所示为初速度法制作的0～100 μΜ谷氨酸浓度下的标准曲线；因此，当样品中谷氨酸浓度大于此范围时，样品要进行适当稀释。
[0060] 使用实施例3所得的0～100 μM 谷氨酸浓度下的标准曲线进行血浆谷氨酸浓度的测定，具体操作如下：（1）按照医院伦理规范要求，收集42例常规体检人员的外周血；
（2）常规方法利用血浆分离胶管，分离获得血浆，置于-80℃保存；
（3）测定时，取步骤2的25 μl上清加入到96孔板（CLS3590-100EA，Corning），然后加入
75 μl反应混合液（实施例3），轻轻混匀；
（4）终点法：37 ℃下反应20分钟后结束反应，空白对照的反应混合液的比例组成包括：
TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5μl；血浆，25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
（2）常规方法利用血浆分离胶管，分离获得血浆，置于-80℃保存；
（3）测定时，取步骤2的25 μl上清加入到96孔板（CLS3590-100EA，Corning），然后加入
75 μl反应混合液（实施例3），轻轻混匀；
（4）终点法：37 ℃下反应20分钟后结束反应，空白对照的反应混合液的比例组成包括：
TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。原始吸光值读数的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；NADH溶液，5 μl；双酶混合液，5μl；血浆，25 μl，补足超纯水至100 μl。反应结束后使用酶标仪读取340 nm处吸光值，吸光度的变化值为原始吸光值读数与其余读数之差。
[0061] 初速度法：37 ℃下反应5分钟，空白对照的反应混合液的比例组成包括：TEA-HCl溶液，25 μl；双酶混合液，5μl；补足超纯水至100 μl。使用酶标仪监测340 nm处吸光值的变化，得到5分钟内340 nm处吸光度变化值。
[0062] （5）根据血液样本吸光度的变化值及终点法或初速度法制作的谷氨酸标准曲线可计算得到血液的谷氨酸含量，该部分人群谷氨酸浓度平均值为125.1±57.5 μM。
[0063] 上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
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