関連出願の相互参照

優先権主張および関連特許出願 本出願は、2015年12月21日に出願された米国仮出願第62/270,226号の優先権の利益を主張し、その全内容はその全体が参照により本明細書に援用される。

本発明は、概してフルオロカーボンナノエマルジョンの組成物およびそれらの調製および使用の方法に関する。より詳細には、本発明は、ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよびリン脂質の1つ以上で安定化された他とは異なるフルオロカーボンナノエマルジョン、およびそれらの調製および適用の方法に関する。

一般的な外科手術および介入処置ならびに外傷および自然の病態は、適時にかつ適切に処置しなければ、臓器および組織の損傷を引き起こし、結果的には病的状態そしては死を招く、失血、虚血または低酸素症を招き得る。虚血性症候群として存在する血液損失の出現は、身体および四肢全域および脳内に脳卒中として広く分布する。迅速な血行再建術および酸素供給された血流の回復が、依然として臨床上脳卒中治療で重視されている。加えて、献血された血液の保存期間が限られているため、献血された血液は部分的に不足しているようであり、加えてウィルス汚染が起こりやすい。酸素キャリアまたは人工血液は、放射線療法および化学療法を含む様々な疾患および状態の治療を補助するのに有用である。

例えば、より大きい分子量のフルオロカーボン(例えば、ペルフルオロデカリンおよびペルフルオロオクチルブロミド)を利用して、乳化フルオロカーボン(FC)ベースの酸素キャリアが報告されている。しかしながら、これらの組成物は、厳格な臨床上の必要条件を殆ど満たすことができず、安全で信頼性があり、有効な酸素キャリアの緊急の必要性に対処するために多くの課題が残されている。

本発明は、ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール、リン脂質またはそれらの組み合わせから選択される界面活性剤または安定化剤を用いて独自に処方したフルオロカーボンナノエマルジョンが、6個より多い完全フッ素化炭素のペルフルオロアルキル基を有するフルオロ界面活性剤から形成される代謝産物および分解生成物の生物蓄積の重要な問題を解決するという、予測できない発見の一部分に基づく。

本発明のフルオロカーボンナノエマルジョンは界面活性剤のより短いペルフルオロカーボン鎖を用いることから、より長いペルフルオロアルキル部分を有するものが生物蓄積するのとは異なり、排泄および代謝生成物が生物蓄積しないため、有意な利益が得られる。

一態様では、本発明は、概して、約4〜約8個の炭素の範囲のフルオロカーボン;およびペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール、リン脂質またはそれらの組み合わせから選択される1つ以上の界面活性剤を含むフルオロカーボンナノエマルジョンの組成物に関する。特定の実施形態では、前記1つ以上の界面活性剤はペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシアルコールおよび/または3つのリン脂質の混合物を含む。

さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、PEGテロマーB(PEG Telomer B)およびフルオロカーボンを含む水性の第1の混合物を調製し;バイパスバルブおよび空気圧ユニットを含むホモジナイザーを介して、前記第1の混合物を、第1の容器と第2の容器の間で移送し、前記第1の容器に戻し、そこでは前記バイパスバルブは開いており;閉じたバイパスバルブを使用して前記空気圧ユニットを始動させ、前記第1の容器から前記第2の容器への材料の均質化によって均質化された一次ナノエマルジョンを形成し;前記均質化された一次ナノエマルジョンを、第1の圧力容器内に配置された、スクロースまたは別の粘性物質および任意に1つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩および殺微生物剤の水溶液内に配置して第2の混合物を形成し;前記第1の圧力容器を前記ホモジナイザーの入口端に取り付け;第2の圧力容器を前記ホモジナイザーの出口端に取り付け;前記第2の混合物のすべてを前記第2の圧力容器に移送するまで、前記バイパスバルブを閉じた状態で前記空気圧ユニットを作動させてナノエマルジョンを形成し;かつ前記第2の圧力容器を加圧して、0.8/0.2ミクロンのフィルターを通して第3の圧力容器に前記ナノエマルジョンを移送して滅菌する、ことを含む。

さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、オリゴエチレンオキシ部分が1〜16単位の長さである1つ以上のペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール、およびフルオロカーボンを含む水性の第1の混合物を調製し;バイパスバルブおよび空気圧ユニットを含むホモジナイザーを介して、前記第1の混合物を、第1の容器と第2の容器との間で移送し、前記第1の容器に戻し、そこでは前記バイパスバルブは開いており;閉じたバイパスバルブを使用して前記空気圧ユニットを始動させ、均質化された一次エマルジョンを形成し;前記均質化された一次エマルジョンを、第1の圧力容器内に配置された任意に1つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩、粘性物質および殺微生物剤を含むスクロース溶液内に配置して第2の混合物を形成し;前記第1の圧力容器を前記ホモジナイザーの入口端に取り付け;第2の圧力容器を前記ホモジナイザーの出口端に取り付け;前記第2の混合物のすべてを前記第2の圧力容器に移送するまで、前記バイパスバルブを閉じた状態で前記空気圧ユニットを作動させてナノエマルジョンを形成し;かつ前記第2の圧力容器を加圧して、0.8/0.2ミクロンのフィルターを通して第3の圧力容器に前記ナノエマルジョンを移送して滅菌する、ことを含む。

さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、ペルフルオロ−n−ヘキシルオリゴエチレンオキシ−アルコール、スクロース、および任意に1つ以上の薬学的に許容し得る緩衝塩、粘性物質および承認された殺生物滅菌剤を含む水性の第1の混合物を調製し;シリンジおよび前記シリンジに取り付けられた針を用いて前記第1の混合物をバイアル内に配置し;前記バイアルにフルオロカーボンを添加し、前記バイアルに栓をしかつクリンプキャップをし、その後、前記バイアルをボルテックスし、超音波処理する、ことを含む。

さらに別の態様では、本発明は、概してナノエマルジョンを形成する方法に関する。この方法は、1つ以上のリン脂質、水、グリセロール、一塩基性リン酸ナトリウムおよび二塩基性リン酸ナトリウムを含む混合物を形成し;前記混合物を0.2ミクロンのフィルターを介して滅菌容器に移し;前記混合物をバイアル内に配置し;前記バイアルにフルオロカーボンを添加し、前記バイアルに直ちに栓をしかつクリンプキャップをし;その後、前記バイアルをボルテックスし、超音波処理する、ことを含む。

さらに別の態様では、本発明は、概して本明細書に開示される方法によって形成されるナノエマルジョンに関する。

本発明は、図面と関連して以下の詳細な説明を読むことによりよりよく理解されることになり、前記図面では、同様の参照符号が同様の要素を示すために使用される。

図1は、高圧均質化によってPEGテロマーBで安定化されたペルフルオロカーボンナノエマルジョンを生成するための、本発明による方法の例示的な実施形態を要約したフローチャートである。

図2は、図1の本発明による方法の例示的な実施形態における追加のステップを要約したフローチャートである。

図3は、本発明による方法の例示的な実施形態、4℃で保存したTDFH−PTBナノ粒子エマルジョンおよび23℃で保存した同エマルジョンの安定性データを図式的に記載する。

図4は、本発明による方法の例示的な実施形態、4℃で保存したTDFH−PTBナノ粒子エマルジョンおよび4℃で保存したTDFH−化合物20a(DuPont Capstone FS−3100)ナノ粒子エマルジョンの安定性データを図式的に記載する。

図5は、リン脂質で安定化されたペルフルオロカーボンナノエマルジョンを生成するための、本発明による方法の例示的な実施形態を要約したフローチャートである。

図6は、ボルテックスおよび超音波処理により最終生成物において混合成分をそれらの濃度で含む安定化されたペルフルオロカーボンナノエマルジョンを形成する本発明による方法の例示的な実施形態を要約したフローチャートである。

図7は、ペルフルオロカーボンおよび界面活性剤のナノエマルジョンの試験溶液の添加の前後に、溶液からの溶存酸素の取り込みを測定する例示的な装置の図である。

図8は、実施例5のペルフルオロカーボンナノエマルジョンの添加前後の水溶液の溶存酸素含有量のグラフである。

図9は、実施例7の製剤の添加後の水溶液中の溶存酸素レベルの低下を示すグラフである。

図10は、実施例8の製剤の添加後の水溶液中の溶存酸素レベルの低下を示すグラフである。

本発明は、ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよびリン脂質から選択される界面活性剤または安定剤を用いて独自に処方されたフルオロカーボンナノエマルジョンを提供する。これらのフルオロカーボンナノエマルジョンは、代謝産物および分解生成物の生物蓄積を含む、従来のフルオロカーボンベースの人工酸素キャリアが直面する重要な課題を解決する。これらの望ましくない不純物は、6個を超える完全フッ素化炭素のペルフルオロアルキル基を有するフルオロ界面活性剤から形成され、厳しい規制基準に照らして継続的に失敗している。本発明のフルオロカーボンナノエマルジョンは界面活性剤のより短いペルフルオロカーボン鎖を用いることから、より長いペルフルオロアルキル部分を有するものが生物蓄積するのとは異なり、排泄および代謝生成物が生物蓄積しないため、有意な利益が得られる。

一態様では、本発明は、概して、約4〜約8個の炭素の範囲のフルオロカーボン;およびペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよびリン脂質から選択される1つ以上の界面活性剤を含む、フルオロカーボンナノエマルジョンの組成物に関する。

特定の実施形態において、前記フルオロカーボンはペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、またはそれらの2つ以上の混合物を含む。

特定の好ましい実施形態では、前記フルオロカーボンはペルフルオロペンタンを含む。

特定の実施形態では、前記1つ以上の界面活性剤はペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールおよび/または3つのリン脂質の混合物を含む。

例えば、前記ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、以下の1つ以上: CF₃−(CF₂)_n−(CH₂CH₂O)_q−H 式中、nは5であり、qは1〜約50の整数である、を含む。

特定の好ましい実施形態において、前記ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、 CF₃−(CF₂)_n−(CH₂CH₂O)_q−H 式中、nは5であり、qは1〜約16の整数(例えば、約3〜約16、約6〜約16、約10〜約16、約3〜約10)である、である。

フルオロカーボンは前記ナノエマルジョン中の任意の適切なwt%(weight percentage)、例えば、約1%〜約50%(例えば、約1%〜約40%、約1%〜約30%、約1%〜約20%、約1%〜約10%、約1%〜約5%)を構成していてもよい。

ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールは、前記ナノエマルジョン中の任意の適切なwt%、例えば、約0.10%〜約7.5%(例えば、約0.10%〜約5%、約0.10%〜約4%、約0.10%〜約3%、約0.10%〜約1.5%)を構成していてもよい。

前記リン脂質は、例えば、約12個の炭素〜約18個の炭素(例えば、12、13、14、15、16、17、18)の長さの範囲の、任意の適切な炭素鎖長を有する。

前記リン脂質は前記ナノエマルジョン中の任意の適切なwt%、例えば、約0.10%〜約7.5%(例えば、約0.10%〜約5%、約0.10%〜約4%、約0.10%〜約3%、約0.10%〜約1.5%)を構成していてもよい。

発明の名称が“Phospholipid Composition And Microbubbles and Emulsions Formed Using Same(リン脂質組成物およびマイクロバブルおよびそれらを用いて形成されたエマルジョン)”の2015年6月12日に出願されたPCT/US15/35681の開示は、あらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に援用される。

前記組成物が3つのリン脂質の混合物を含む特定の実施形態において、例示的なリン脂質およびそれらの相対量は、例えば、約75〜約87モル%のホスファチジルコリン、約5〜約15モル%のホスファチジルエタノールアミンおよび約3〜約20モル%のホスファチジルエタノールアミン−MPEGであり、ここで「MPEG」は末端メトキシ基を有するPEG基を指す。本明細書におけるMPEGは、約350〜約5,000(例えば、約350〜約4,000、約350〜約3,000、約350〜約2,000、約500〜約5,000、約1,000〜約5,000、約1,500〜約5,000、約2,000〜約5,000、約3,000〜約5,000、約4,000〜約5,000)の分子量を有していてもよい。分子のオリゴエチレンオキシ部分がMPEGリン脂質に存在するメトキシ末端とは対照的にヒドロキシル基で終結するホスファチジルエタノールアミン−PEGは、製剤においてホスファチジルエタノールアミン−MPEGの代わりに使用することができる。ホスファチジルエタノールアミン−MPEGおよびホスファチジルエタノールアミン−PEGの組み合わせも、これらの製剤のオリゴエチレンオキシ含有リン脂質成分として、任意の相対比で使用することができる。

前記組成物が3つのリン脂質の混合物を含む実施形態において、例示的なリン脂質およびその相対量は、例えば、約80〜約85モル%のホスファチジルコリン、約8〜約13モル%のホスファチジルエタノールアミンおよび約6〜約11モル%のホスファチジルエタノールアミン−MPEG(またはホスファチジルエタノールアミン−PEG)であってもよい。

特定の実施形態では、前記ホスファチジルエタノールアミンは約350〜約5,000(例えば、約350〜約4,000、約350〜約3,000、約350〜約2,000、約500〜約5,000、約1,000〜約5,000、約1,500〜約5,000、約2,000〜約5,000、約3,000〜約5,000、約4,000〜約5,000)の分子量を有するPEG基を含む。

特定の実施形態では、本発明の組成物はDuPont Zonyl FS−100またはDuPont FSOのカスタム精製医療グレードであるPEGテロマーB(PTB)を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物はペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールを含む。特定の形態のペルフルオロ−n−ヘキシルオリゴエチレンオキシ−アルコールは、DuPont Capstone FS−3100として知られているフルオロ界面活性剤製品であり、特定の実施形態において、本発明の組成物はその材料またはその材料のカスタム改良された製品を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物はテトラデカフルオロ−n−ヘキサン(TDFH)を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、任意の割合で存在するその可能な構造異性体の2つ以上の混合物からなっていてもよいテトラデカフルオロヘキサンを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物はドデカフルオロ−n−ペンタン(DDFP)を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、任意の割合で存在するその可能な構造異性体の2つ以上の混合物からなっていてもよいドデカフルオロペンタンを含む。

特定の実施形態では、本発明の組成物はドデカフルオロ−n−ペンタン、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン、1,2−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5000]塩、例えばそのナトリウム塩、および1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンの1つ以上を含む。

特定の実施形態では、本発明の組成物は1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000]塩、例えばそのナトリウム塩、および1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンの1つ以上を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は1,2−ジドデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン、1,2−ジドデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000]ナトリウム塩、および1,2−ジドデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンの1つ以上を含む。

本発明の態様は、ペルフルオロカーボンナノエマルジョンを調製する方法に関する。単一鎖長のみを含むフルオロカーボン部分を有する1つ以上のフルオロカーボン界面活性剤の水性混合物を使用して、ペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを調製する。ここで図1を参照すると、ステップ(110)において、この方法により、容器内でマグネチックスターラーを使用して、注射用水(WFI)中のフルオロ界面活性剤の約6%wt/v混合物を調製し、約2〜5℃の浴中に15〜60分間置くが、その間、溶液の温度を監視し、2〜5℃の温度で維持する。

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンはテトラデカフルオロ−n−ヘキサンを含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンは、2つ以上の構造異性体の混合物であってもよい、テトラデカフルオロヘキサンを含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンはドデカフルオロ−n−ペンタンを含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンは、2つ以上の構造異性体の混合物であってもよい、ドデカフルオロペンタンを含む。

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンはテトラデカフルオロ−n−ヘキサンからなる。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンはテトラデカフルオロヘキサンからなる。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンはドデカフルオロ−n−ペンタンからなる。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボンはドデカフルオロペンタンからなる。

さらにステップ(110)において、次に、本発明の方法では、冷(0〜4℃)ペルフルオロカーボンの一部を容器に迅速に加え、容器のキャップを閉じ、次いで得られた第1の混合物を約1時間撹拌する。

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボン界面活性剤は、PegテロマーB(Peg Telomer B)(PTB)、化合物21、

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボン界面活性剤は、ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールを含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボン界面活性剤は、上記に21で示される化合物の混合物であるPEGテロマーBからなる。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロカーボン界面活性剤は、ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコールからなる。

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は、ペルフルオロ−n−ヘキシル−オリゴエチレンオキシ−アルコール界面活性剤17であり、前記界面活性剤17は不変ペルフルオロ−n−ヘキシル部分18を、可変エチレンオキシド部分19と組み合わせて有する。

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は、yが6より大きいペルフルオロ−n−アルキル−オリゴエチレンオキシ−アルコール20を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は、yが7であり、nは1以上16以下である、化合物20を含む。

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は、yが6であり、nは1以上16以下である、ペルフルオロ−n−アルキル−オリゴエチレンオキシ−アルコール20a(例えば、DuPont Capstone FS−3100フルオロ界面活性剤)を含む。特定の実施形態において、化合物20aは製造者から受け取ったままで使用することができる。特定の実施形態において、化合物20aは使用前にカスタム改良手順または精製手順に付すことができる。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は、yが5であり、nが1以上16以下である、化合物20bを含む。

特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物1を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物2を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物3を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物4を含む。特定の実施形態では、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物5を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物6を含む。特定の実施形態では、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物7を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物8を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物9を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物10を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物11を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物12を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物13を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物14を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物15を含む。特定の実施形態において、ステップ(110)のフルオロ界面活性剤は化合物16を含む。

特定の実施形態において、前記フルオロ界面活性剤は化合物1〜16の混合物からなり、それらの混合物はそれらの化合物の任意の組み合わせを含んでいてもよく、1〜16の化合物のセットの単独または選択されたメンバーのそれらの化合物のいずれかを省略してもよい。

特定の実施形態では、異なる発泡特性および濡れ特性と組み合わせたペルフルオロ部分18を含む他のフルオロカーボン界面活性剤を使用して、本発明のペルフルオロカーボンナノエマルジョンを形成する。例えば、スルホン酸(DuPont FS−10)またはリン酸エステル(DuPont FS−61、FS63、FS−64)に基づく他のアニオン性界面活性剤;双性イオン性および両性界面活性剤(それぞれDuPont FS−50およびDuPont FS−51);ペルフルオロアルキル化ポリエチレンオキシアルコールに基づく、非イオン性界面活性剤、例えばDuPont FS−30、DuPont FS−31、DuPont FS−3100、DuPont FS34およびDuPont FS−35;などを利用することができる。

特定の実施形態において、異なる長さのエチレンオキシド部分19と組み合わせた部分18を含むフルオロカーボン化合物を利用して、本発明のペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成する。特定の実施形態では、nは約3〜約6の間にある。他の実施形態では、nは1以上で約16以下であり、低分子量のペルフルオロカーボン、例えばドデカフルオロペンタン(DDFP)、テトラデカフルオロヘキサン(TDFH)、ヘキサデカフルオロヘプタン(HDFH)およびオクタデカフルオロオクタン(ODFO)と共に安定なナノエマルジョンを形成する。

ある実施形態では、化合物22として示される形態のペグ化ペルフルオロアルキルオリゴエチレンオキシアルコール界面活性剤

式中、独立して、mは1〜約50の整数(例えば、1〜約25、1〜約12、1〜約6、6〜約50、12〜約50、25〜約50)であり、nは1〜約50(例えば、1〜約25、1〜約12、1〜約6、6〜約50、12〜約50、25〜約50)であり、qは1〜約50の整数(例えば、1〜約25、1〜約12、1〜約6、6〜約50、12〜約50、25〜約50)である、を利用して、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成する。

特定のより好ましい実施形態では、使用することができる化合物のクラスは、以下に示す化合物22のサブセットから選択される: H−(OCH₂CH₂)_m−(CF₂)_n−(CH₂CH₂O)_q−H、 式中、m=1〜約50、n=1〜12およびq=1〜約50である。

特定の最も好ましい実施形態では、使用することができる化合物のクラスは、以下に示す化合物22のサブセットから選択される: H−(OCH₂CH₂)_m−(CF₂)_n−(CH₂CH₂O)_q−H、 式中、m=1〜約50、n=1〜6およびq=1〜約50である。

特定の実施形態において、化合物22として表される化合物の群の個々のメンバーまたは前記化合物の群の個々のメンバーの任意の組み合わせは、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンナノエマルジョンを形成するために使用されるフルオロカーボン界面活性剤として利用される。

特定の実施形態において、構造22として表される化合物の混合物は、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成するために利用される前に、カスタム改良または精製プロトコルに供され得る。

特定の実施形態では、構造22によって表される化合物の群の任意の個々の分子種または個々のメンバーの任意の組み合わせは、本明細書に開示されるペルフルオロカーボンのナノエマルジョンを形成するために利用される前に、カスタム改良または精製プロトコルに供され得る。

特定の実施形態では、Ultra Turraxまたは同様の分散装置が、磁気撹拌システムと置き換わって、初期の粗いエマルジョンを生成することができる。Ultra Turraxは高速撹拌モーター(1,000〜25,000rpm)を有し、これに分散要素が軸を介して取り付けられる。したがって、Ultra Turraxを使用して粗いエマルジョンを生成するのに必要な時間は、磁気撹拌システムを使用することによる生成と比較するとあまり時間がかからない(0.5〜5分)。運転中を通して、低沸点のペルフルオロカーボン液の損失を最小限に抑えるために、溶液の温度を2〜6℃で維持する。

さらに、高速モーターおよび分散アッタッチメントからなるホモジナイザーやプローブソニケーターを用いて生じる激しい撹拌により粗エマルジョンを製造することもできる。

次に、図1のステップ(140c)〜(160c)または(140d)〜(175d)を参照すると、前記粗エマルジョンを均質化して、400nm以下の平均粒径および99%累積分布が900nm以下である微細エマルジョンが得られる。

一実施形態では、ホモジナイザー(AvestinモデルC5)が使用される。別の実施形態では、ホモジナイザー(AvestinモデルC50)が使用される。別の実施形態では、空気圧補助装置を備えたまたは備えていないKirkland productsのハンドヘルドホモジナイザーが使用される。特定の実施形態において、均質化圧力は1,000psiから14,000psiの範囲である。さらに、他の実施形態では、ホモジナイザーは連続均質化モードまたは不連続均質化モードで使用される。不連続通過の数または連続均質化の時間は、微細エマルジョンを確実に達成するように調整することができる。

図1、ステップ(180)を参照すると、粗エマルジョンの均質化が完了して微細エマルジョンが形成された後、得られた微細エマルジョンは、WFIからなる冷却された(0〜10℃の)撹拌連続相を含む別の容器に移される。さらに、前記連続相は、緩衝剤、粘度調整剤、賦形剤、および偶発的に入った微生物種の増殖を阻害するための防腐剤(殺微生物剤)を任意に含有する。

特定の実施形態では、前記エマルジョンを前記第1の容器から前記ホモジナイザーを介して、場合により加圧した状態の前記ホモジナイザーで前記第2の容器に前記エマルジョンを通すことによって移送を行うことができる。分散相の体積は移送した前記エマルジョンの1〜100倍の間である。特定の実施形態では、前記微細エマルジョンが連続相全体に均一に分散されることを確実にするために、前記微細エマルジョンは窒素圧(2〜10psi)下で10〜30分間撹拌される。当業者であれば、前記装置の構成および準備の規模が、異なる規模の以前の運転で使用された時間の変更または異なる装置の使用を必要とすることがあることを理解するであろう。

ステップ(180)において、本方法では、第1の圧力容器(PV1)に配置されたスクロース溶液に前記微細エマルジョンを注入して第2の混合物を形成する。図2を参照すると、ステップ(210)において、本方法では、ステップ(210)の第2の混合物を撹拌しながら、第1の圧力容器(PV1)を加圧する。

ステップ(220)および(230)において、本方法では、ホモジナイザーを用いて前記第2の混合物を第2の圧力容器(PV2)に移送する。

ステップ(240)および(250)において、本方法では、第2の圧力容器(PV2)を0.8/0.2ミクロンのフィルターを介して第3の圧力容器(PV3)に接続し、次いで前記第2の圧力容器を加圧して、前記第2の混合物を濾過して滅菌し、その第2の混合物を第3の圧力容器に移送する。特定の実施形態では、濾過ステップはシリンジ膜フィルター、カートリッジ膜フィルター、またはカプセル膜フィルター、または、培地と適合する物質でできておりかつ微生物実体、例えば細菌、カビ、カビ胞子、および約0.2ミクロンまたは0.1ミクロン相当の小さい、真菌汚染物を含む粒子状物質を除去することができる任意の他の膜を利用する。例えば、膜材料は、Pall SciencesのSupor(登録商標)(ポリエーテルスルフォン)膜、Pall EKV(登録商標)フィルターシリーズ膜、またはPall Sciences GHP Polypro(登録商標)膜であってもよい。

ステップ(250)が完了した後、本方法では、濾過した溶液の均質な分散を確実にするために、得られた滅菌された第2の混合物を窒素の軽い圧力下で撹拌する。特定の実施形態では、本方法では、さらに、蠕動ポンプ、計量ポンプ、ギアポンプ、または他の適切な流体移送装置を用いて、濾過した第2の混合物を、栓をしかつクリンプする(した)バイアルに移送する。これらの操作のすべての間に微生物汚染を回避するための予防措置がとられ、無菌充填操作のためのそのような予防措置は当業者に知られている。

ここで図6を参照すると、特定の実施形態では、例えばフルオロカーボン界面活性剤20aまたは21を含むナノエマルジョンは、組み合わされた成分の超音波処理によって調製することができる。例えば、DDFP(原液として)、リン酸緩衝化水性スクロース(溶液として)、および化合物20a界面活性剤(原液としてまたはリン酸緩衝化スクロース水溶液と予め混合したもの)を用いてDDFPのナノ粒子エマルジョンを調製する。

ステップ(610)において、本方法では、リン酸緩衝化スクロースおよびフルオロ界面活性剤である化合物21(PegテロマーB)の水溶液を調製する。ステップ(620)において、本方法では、ステップ(610)の溶液を複数のバイアルに充填し、各バイアルの口を覆って栓を置く。ステップ(630)において、この方法では、前記バイアルの溶液にペルフルオロカーボンが添加された場合、そのペルフルオロカーボンの有意な量の蒸発がないと予想されるような温度に前記バイアルを冷やす冷却環境に前記バイアルを置く。ステップ(640)では、前記フルオロカーボンを各バイアルに加え、続いて各バイアルに迅速にクリンプキャップをする。ステップ(650)において、本方法では、各バイアルをボルテックスに供した後、超音波処理して本発明のペルフルオロカーボンナノエマルジョンを生成する。ステップ(650)では、最初に振盪またはボルテックスすることによって、栓をしかつクリンプキャップをしたバイアル中で成分を混合し、その粒径分布が約200ナノメートルから約15ミクロンまでの範囲に及び得る粗エマルジョンを生成する。粒子寸法の大きさは例示的なものであり、当業者であれば、実際の実施における寸法が所定の範囲を下回るかまたは上回る可能性があることを認識する。

次に、本発明の方法では、例えばVWR Aquasonic 75HTユニットの超音波洗浄浴中で前記バイアルを超音波処理し、約40KHzの音波処理周波数および約75〜80ワットの総出力を1秒〜1時間の時間でもたらし、ナノ粒子エマルジョンの所望の粒径分布を形成する。

ここで図5を参照すると、特定の実施形態では、1つ以上のリン脂質が乳化界面活性剤系として使用される。図5を参照すると、ステップ(510)において、本方法では、周囲温度〜100℃の間の温度で撹拌される一塩基性および二塩基性リン酸塩緩衝剤を含む水とグリセロールの第1の混合物を調製する。ステップ(520)において、リン脂質を固体材料としてまたは適切な溶媒中の溶液として前記第1の混合物にプロセスに適合する周囲温度〜100℃の間の温度で添加し第2の混合物を形成する。ステップ(530)では、前記第2の混合物を0.2ミクロンのフィルターを通して第2の容器に濾過する。ステップ(540)において、濾過した溶液は、その調製物の温度が周囲温度を超える場合、周囲温度まで冷却させる。ステップ(550)において、本方法では、ステップ(540)の溶液を複数のバイアルに移し、前記バイアルに栓を取り付ける。ステップ(560)において、乳化されるべき選択されたフルオロカーボンを前記バイアルに加え、前記バイアルに直ちにクリンプキャップをする。ステップ(570)において、本方法では、フルオロカーボンのエマルジョンを提供するためにステップ(560)の前記バイアルをボルテックスし、次いで1秒〜1時間の間超音波処理する。超音波処理時間は、特定の用途に最適であり得る所望のサイズの粒径分布を提供するように調整することができる。特定の実施形態において、前記1つ以上のリン脂質は飽和、部分飽和、または完全に不飽和である。例えば、第1のナノエマルジョンは、DPPC(16:0)、DPPE−MPEG−2000、またはDPPE−MPEG5000、および場合によりDPPE(16:0)を用いて形成される。第2のナノエマルジョンは、卵黄リン脂質を単独でまたは他の添加リン脂質または誘導体化リン脂質と組み合わせて使用して形成される。第3のナノエマルジョンは、16:0〜18:1PC、16:0〜18:1PEおよび16:0〜18:1PE−MPEG2000、または16:0〜18:1PE−MPEG5000を使用して形成される。第4のナノエマルジョンは、DPPC(16:1)、DPPE−MPEG−2000またはDPPE−MPEG−5000、および場合によりDPPE(16:1)を用いて形成される。第5のナノエマルジョンは、DMPC、DMPEおよびDMPE−MPEG2000、またはDMPE−MPEG5000を使用して形成される。第6のナノエマルジョンは、14:1(Δ9−Cis)PC、14:1(Δ9−Cis)PE、14:1(Δ9−Cis)MPEG2000、または14:1(Δ9−Cis)MPEG5000を用いて形成される。第6のナノエマルジョンは、14:1(Δ9−trans)PC、14:1(Δ9−trans)PE、14:1(Δ9−trans)MPEG2000、または14:1(Δ9−trans)MPEG5000を用いて形成される。第7のナノエマルジョンは、DLPC(12:0)、DLPE−MPEG−2000またはDLPE−MPEG−5000、DLPE(12:0)を用いて形成される。

さらに、特定の実施形態では、本明細書に記載のリン脂質成分の相対的比率は、溶解性、乳化安定性、および酸素取り込みおよび放出動力学に関して製剤を最適化するように変化させることができる。例えば、前記第1のナノエマルジョンは、水−プロピレングリコール−グリセロール85/10/5v/v/vおよび0.75mg/mL〜約50mg/mLまでの総脂質濃度を含む溶液中の82 DPPC(16:0)、8 DPPE(16:0)−MPEG−2000、および10 DPPE(16:0)のモル比で処方することができる。所定の希釈剤において脂溶性が低い場合、プロピレングリコールとグリセロールの相対量は水に対して増加させることができる。使用することができるリン脂質成分は、上記の例示に記載されたものに限定されない。特定の製剤は、所与の画分の完全飽和リン脂質とそれらの不飽和同族体の所与の画分との組み合わせからなるリン脂質混合物を必要としてもよい。ゲル対液晶相転移温度などの特性の調整および調節は、当業者には十分理解されている。

いくつかの実施形態では、一連の例示において言及したものと相同であるヘッド基を有するリン脂質の添加が必要とされてもよい。例えば、MPEG2000の代わりにMPEG350が使用される場合、MPEG2000を使用する系における構成要素の相対的な比率は、コリンヘッド基を有するものと比較して、より大きな割合のMPEGリン脂質を必要とすることによって異なる可能性がある。PEG化リン脂質またはMPEGリン脂質とPEGリン脂質との組み合わせが界面活性剤系として使用される場合も、これが適用される。

いくつかの実施形態では、コリン型ヘッド基は、より大きいまたはより小さいアルキル基、または3未満のアルキル基を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、ジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質などのそれらのヘッド基にカチオン性部分を有するリン脂質は、ジアシルホスファチジルグリセロールリン脂質などの中性ヘッド基またはジアシルホスファチジン酸などのアニオン性ヘッド基を有するリン脂質で全体的にまたは部分的に置換することができる。

特定の実施形態において、小分子物質は、ナノ粒子フルオロカーボンエマルジョンの沈降(逆クリーミング)を阻害し、溶液の全体的な密度、粘度、および張度を調節して製品溶液が注入される血液の密度、粘度、および張度に近似させる粘性賦形剤として使用することができる。例えば、物質、例えばプロピレングリコール、グリセリン、および糖アルコール、例えばソルビトール、キシリトール、マンニトールおよびエリスリトールを粘性物質として使用することができる。同様に、媒体中に適切な溶解性を有する他のポリヒドロキシ化合物、例えばモノ−、ジ−またはトリサッカライドも粘性物質として役立ち得る。例としては、フルクトース、グルコース、キシロース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、アルギン酸塩、シクロデキストリン、置換シクロデキストリン、およびデキストランが挙げられる。さらに、直鎖または分岐ポリエチレングリコール、例えばPEG300、PEG400、PEG600、およびMW10,000までの高分子量のPEGも粘性物質として使用することができる。

特定の実施形態において、医学分野の当業者は、ナノエマルジョンの溶液の注入速度を制御して、ナノエマルジョンの溶液と血液との間の張度のミスマッチの影響を最小にする必要がある。しかしながら、注入されるナノエマルジョンは等張である必要はない。等張性からの逸脱の程度が過渡効果を超えて患者への不快感または組織への損傷をもたらさない限り、前記ナノエマルジョンの注入溶液は、低張または高張性であってもよい。

特定の実施形態では、前記ナノエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水の調製に使用されるようなリン酸緩衝液などの他の成分を任意に含む0.9%生理食塩水などのより大きな容量の希釈剤に注入することができる。

特定の実施形態では、リン酸ナトリウム緩衝系以外の緩衝液を使用して、前記ナノエマルジョンのpHを維持することができる。前記緩衝液は、例えば、酢酸、アルギニン、アスパラギン酸、安息香酸、炭酸、クエン酸、グルコン酸、グルコン酸ラクトン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メグルミン、リン酸、またはトロメタミンの遊離酸形態と塩形態の塩または組合せであってもよく;酸性塩は前記緩衝系の一部である。さらに、対イオンは、一般的に、ナトリウム、メグルミン、または生化学的に適合し、非経口での使用が可能な他のカチオンである。

特定の実施形態では、不飽和リン脂質を含有するナノエマルジョンを保護するために、EDTA二ナトリウムなどのキレート剤を使用して、Fe³⁺などの酸化金属イオンの量を抑制することができる。さらに、他の抗酸化賦形剤、例えばアセトン重硫酸ナトリウム、ヘッドスペース中の100%アルゴン、パルミチン酸アスコルビル、アスコルベート(アスコルビン酸ナトリウム/アスコルビン酸)、重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、システイン/システイン酸HCl、亜ジチオン酸ナトリウム(Naハイドロサルファイト、Naスルホキシレート)、ゲンチシン酸、ゲンチジン酸エタノールアミン、グルタチオン、ホルムアルデヒドスルホキシレート、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、メチオニン、窒素100%(ヘッドスペース中)、プロピルガレート、亜硫酸ナトリウム、トコフェロールアルファ、コハク酸水素−アルファトコフェロール、またはチオグリコール酸ナトリウムをこの保護を達成するために添加することができる。

さらに、特定の実施形態では、抗菌剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、安息香酸、クロロブタノール、m−クレゾール、塩化ミリスチルガンマピコリニウム、パラベンメチル、パラベンプロピルまたはチメロサールは、0.005%〜5%w/vの範囲でこれらのうちのいずれかが使用されるかに応じて製剤に加えることができる。

実施例1 実験を行い、前記ナノエマルジョンの粒径分布を研究した。ドデカフルオロペンタン[(DDFP) FluoroMed、テキサス州ラウンドロック]を、生理学的pH(約7)で緩衝化した30%(w/v)スクロース溶液中2%(w/v)で乳化させた。精製された医療グレードの形態のフルオロ界面活性剤、化合物21(PEG−テロマーB)を、Emulsiflex C−5ホモジナイザー(Avestin、カナダ、オンタリオ州)と組み合わせて0.3%(w/v)の濃度で使用し、粒径を小さくして約250nmで安定化させた。DDFP(BP 29℃)の揮発性のために、冷却用のジャケットを備えたステンレス鋼(316L)の圧力容器(PV)を、調合手順の3段階の間、製品の温度および加圧を制御するために設計して製造した。PV間のすべてのプロセスフロー経路を1/4インチ内径の可撓性ナイロン管材料で計画した。管材料ラインの端は、ホモジナイザーとPVの間の流路を円滑かつ無菌的に接続するために選択されたミニ−1/2インチのサニタリートリクランプフィッティングを用いて取り付けた。したがって、製品を製造プロセス全体の間室内環境から完全に遮蔽した。プロセス温度を4〜6℃に制御し、前記容器のヘッドスペース内の圧力を、圧縮窒素を用いて5〜7psiに制御した。前記エマルジョンを、均質化バルブを通して14,000psiで6回通過させ(効果的に)再循環(連続均質化)した後、直ちに0.2μmの滅菌濾過カプセルを通して濾過した。Unispence(登録商標)(Wheaton、ニュージャージー州ミルビル)充填機を用いて、得られた生成物を5mLのバイアルに充填し、それらのバイアルに速やかに手で栓をし、空気圧Power Crimper(Kebby Industries)を用いて圧着(crimp)した。

前記エマルジョンの粒径分布を、0、1、2、3週間および1、2、4、6および11ヶ月間で3回評価した。各時点で、3本のバイアルを無作為に選択し、PSS Nicomp 380 DLSサブミクロン粒子サイザー(Particle Sizing Systems、フロリダ州ポートリッチー)を用いて動的光散乱によって分析した。サイズ決定中の漸進的な温度上昇の影響を最小限にするために、試料温度を19℃に制御した。

強度補正平均径(intensity weighted mean diameter)(IWMD)として得られる平均粒径は260nmを超えなかった。さらに、研究の全体を通して、粒子の99%の径が400nm以下であると測定された。粒子の総体積の0.8%未満が0.5μ〜50μの間の粒子からなっていた。

実施例2 実験を行い、TDFH/化合物21(PTB)を使用して、サブミクロン粒子のサイズ、領域0.5〜50ミクロンの粒子のサイズ、異なる温度でのナノ粒子エマルジョンの安定性を研究した。

カスタム精製された医療グレードの化合物21(J.Techn Sales、フロリダ州ボカラトン)の6%溶液の調製は、yが5であり、nが1〜16である、化合物21の1.2gアリコートを入れ、注射用水(HyCloneからのHyPure(登録商標))でガラスシンチレーションバイアル中の予め測定した20mL容積の目盛まで希釈し、小型の十字形マグネチックスターラーを用いて5℃で0.5時間撹拌することによって行った。得られた溶液を冷蔵庫中4℃で保存した。先に調製した水中の化合物21の溶液を冷蔵庫から取り出し、小型バレル形磁気撹拌棒を備えた15mLのRBフラスコ(総容量21mL)に12.12mLの部分を加えた。次いで、冷(4℃)TDFH(Sigma Aldrich Co.、ミズーリ州セントルイス)3.17mL(5.29g)を添加し、前記フラスコを14/20ゴム製セプタムで覆い、2℃の氷水浴に浸漬した。前記混合物を1時間撹拌した。

撹拌期間中、シリンジ冷却タンクおよびPV1〜PV3冷却タンクに氷水を充填した。フローティングマグネチックスターラーを入れた前記圧力容器にそれらの栓を取り付け、前記圧力容器の各々が0.25インチ外径 316SS浸漬管(容器から製品を出し入れするため)に取り付けられたSwagelok(登録商標)ボトムエントリー二位置計器ボールバルブと、窒素入口および通気システムとして働く三方三位置活栓を備える。キャップおよび大型の十字形スターラーを備えたPV1に、リン酸緩衝化スクロースの溶液(216.8mL)を充填し、PV1〜PV3冷却タンクに入れ、撹拌を開始した。PV2を前記タンク内に入れ、両方のスターラーが動くようにPV1の近傍に適切に配置した。PV2からの生成物を受ける前に、PV3を冷却用の氷浴に入れた。0.8/0.2ミクロンのPall Acrodisc(登録商標)(Supor膜)をPV3の計器バルブ入口に取り付ける準備をした。

Kirkland productsのハンドヘルドホモジナイザー(「ホモジナイザー」)から残留WFIを除き、次いで冷WFI(25mL)ですすいだ。ガラス製プランジャーを伴うコールドジャケット付きの25mLガラス製Perfektum MicroMate(登録商標)シリンジを、前記ホモジナイザーの入口および出口のルアーロックフィッティングに取り付けた。受けるシリンジを、ルアーフィッティングを備えた二方活栓に取り付けた。供給ガスライン(80psi)を前記ホモジナイザーの空気圧ピストン部に接続した。一次エマルジョンの撹拌期間の終了時に、出口シリンジを前記ホモジナイザーから取り外し、17ゲージの針を取り付けた。前記一次エマルジョンを前記シリンジ内に引き込み、次いでその針を外し、前記シリンジを前記ホモジナイザーの入口側に迅速に固定した。BioRad Econopump蠕動ポンプを使用して、シリンジ浴冷却タンクから直列に前記シリンジを通して氷水を送る。前記蠕動ポンプを、38mL/分の合計流速に近づくようにYコネクタを使用して入口側と出口側で接続された、2本の長さ1/8インチ径のPharmed(登録商標)管材料に取り付けた。前記蠕動ポンプからの冷却材ラインを出口シリンジと入口シリンジに直列に取り付けて、冷却材の循環を開始した。前記ホモジナイザーのバイパスバルブを開け、シリンジプランジャーの押し下げを交互に行うことによって、出口シリンジと入口シリンジの間で前記一次エマルジョンを数回移行させ;前記一次エマルジョンの最終位置は入口シリンジ内であった。前記バイパスバルブを閉じ、空気圧部の操作を約30mL/分のポンプ速度で開始した。入口シリンジの内容物が十分に出口シリンジに移されたら、前記バイパスバルブを急速に開き、出口シリンジのプランジャーを押し下げて、均質化された一次エマルジョンを入口シリンジに迅速に戻し、前記バイパスバルブを閉め、第2の通過を開始した。このようにして、前記一次エマルジョンはホモジナイザーを通る20回の別々の通過に供された。この手順の最後に、前記一次エマルジョンは出口シリンジにあった。

出口シリンジを前記ホモジナイザーの出口から外し、前記針をPV1中の撹拌溶液の表面の約2インチ下に入れた。前記一次エマルジョンを前記シリンジからPV1に注入した。PV1を窒素で加圧し(約8〜10psi)、混合物を約5分間撹拌し、その間に1/16インチの管材料(編み込まれたシリコーン−白金硬化物)を、PV1の浸漬管活栓から前記ホモジナイザーの入口側へそしてPV2の浸漬管活栓から前記ホモジナイザーの出口側へ接続した。窒素圧をPV1内で維持し、PV2の通気を大気に向かって行った。PV2の浸漬管ボールバルブを開け、続いてPV1の浸漬管ボールバルブの開放を前記ホモジナイザーの開始と同時に行った。これにより、32%スクロース溶液中の前記一次エマルジョンの撹拌溶液がPV1からPV2へ前記ホモジナイザーを通る1回の通過で移された。PV2への前記溶液の移行の後、P1をPV1〜PV3冷却タンクから取り出し、P2〜P3のペアを両方において撹拌されるように配置した。Pall Sciences Acrodisc 20(登録商標)0.8/0.2ミクロンフィルターを浸漬管ボールバルブの入口/出口を介してPV2とPV3の間に取り付けた。その後、PV2を窒素で最初に約12psiで加圧し、PV2からPV3への前記溶液の移送濾過を開始した。濾過完了には約30〜40分間を要し、移送はほぼ定量的であった。

PV3中の濾過溶液を、氷水を含む結晶化皿に移し、クランプで安定させ、窒素で約8psiまで加圧し、その中の溶液を約15分間撹拌した。この時間が経過した後、灰色のブチルゴム栓を有する50個の公称2mL血清バイアル(総容量3mL)を有する2枚のWheatonバイアルトレイを冷蔵庫から取り出した。その出口側に12ゲージのSS管を取り付けた1/16インチ内径の編込みシリコーンチューブを、PV3の計器バルブの出口に接続した。PV3における圧力を約5psiに調整し、前記浸漬管活栓を前記チューブに向かって開いた。前記バイアルからノッチ付ストッパーを取り外し、PV3に取り付けられたチューブの遠位端で前記活栓を開閉し、前記ノッチ付きストッパーを交換することによって前記バイアルを充填した(10の群において)。

10本のバイアルを充填した後、それらに栓をしかつクリンプキャップをした。PV3中の溶液が消費されるまでこれを繰り返した。これにより、2.6〜2.7mLの充填容量を有する65本のバイアルを得た。前記トレイ中の前記バイアルを、安定性試験のために4℃で保存した。材料の第2の部分を同じ方法で調製し、23℃で保存して、粒子の安定性に対する保存温度の効果を調べた。

調製直後に得られたPSS Nicomp 380 DLSサブミクロン粒子サイザー(Particle Sizing Systems、フロリダ州ポートリッチー)を用いたサブミクロン粒度測定データを表1に示す。IWMDで測定したTDFH−化合物21のナノエマルジョンの平均粒径は変化せず、放出に関する仕様の範囲内に十分とどまる。さらに、研究の全体を通して、前記粒子の99%の径は400nm以下であると測定された。

PSS 780 SIS光遮蔽装置(Particle Sizing Systems、フロリダ州ポートリッチー)を使用して、0.5〜50ミクロンの領域の粒径データを得たため、表2に表示する。粒子の総体積の0.8%未満は0.5μ〜50μの間の粒子からなり、粒子の大部分の体積は0.5ミクロンの閾値よりも小さい粒子からなっていた。

4℃および23℃での粒径および99%累積分布に関するデータをそれぞれ表3および表4に示す。

TDFH−化合物21ナノエマルジョンを4℃で保存した場合、IWMDで測定した粒子の平均粒径は非常にゆっくりと変化し、放出に関する仕様内に十分とどまる。さらに、研究の全体を通して、前記粒子の99%の径は≦400nmであると測定された。

TDFH−化合物21ナノエマルジョンを23℃で保存した場合、IWMDで測定した粒子の平均粒径はゆっくりと変化するが、依然として放出に関する仕様の範囲内に十分とどまっている。さらに、研究を通して前記粒子の99%の径が≦530nmであることが測定された。

表3、表4および表5に示した上記データは、TDFH−化合物21ナノエマルジョンが、放出に関するおよび4℃と23℃での保存温度での保存可能期間に関する仕様の範囲内に十分とどまることを明確に示す。さらに、データの傾向により、26週間で保存可能期間の仕様を超えないことが示される。

実施例3 高圧均質化によって調製されたテトラデカフルオロ−n−ヘキサン(TDFH)および化合物20aのナノ粒子エマルジョン 実験を行い、TDFHおよび化合物20aのナノ粒子エマルジョンの粒径、4℃でのTDFHおよび化合物20aのナノ粒子エマルジョンの粒径、23℃でのTDFHおよび化合物20aのナノ粒子エマルジョンの粒径の安定性、ならびにTDFH−化合物20aおよび4℃で保存したTDFH−化合物20aに関する経時的な粒径および99%累積分布の変化を示す。

化合物20a(J.Tech Sales、フロリダ州ボカラトン)の6%溶液(20mL)の調製は、前記界面活性剤の1.2gアリコートを添加し、注射用水(HyCloneからのHyPure)でガラス製のシンチレーションバイアル中の予め測定した20mL容量の目盛まで希釈し、小型の十字形マグネチックスターラーを用いて5℃で0.5時間撹拌することによって行った。得られた溶液は5℃で透明であり、冷蔵庫(3℃)で保存した。この溶液を異なる実験のために保存し、使用することができる。

化合物20aの前記溶液の6.25mLの部分を、小型バレル形磁気撹拌棒を備えた15mLの血清バイアルに添加した。次いで、冷(4℃)TDFH(Sigma Aldrich Co.、ミズーリ州セントルイス)1.52mL(2.53g)を添加し、前記バイアルにゴム製セプタムで栓をし、氷水浴(2℃)に浸漬し、得られた混合物をこの温度で1時間撹拌した。

シリンジコールドジャケットを通る循環のための冷却浴タンクと、前記圧力容器のための別個の冷却浴とを含む長方形のステンレス鋼パンを冷蔵庫から取り出し、両方を氷水で満たした。それぞれが実施例2に記載した大型の十字形マグネチックスターラーを含むより大きな容器に関する付属品を備えた125mLの容器である、PV1、PV2およびPV3に、生成物および窒素ガス用の適切なバルブ付き入口および出口を備えるそれらのキャップを付けた。PV1に10mMリン酸緩衝化(pH7)スクロース(32%wt/volスクロース、104mL)を充填し、PV1〜PV3冷却タンクに入れ、撹拌を開始した。PV2およびPV3を同様に前記タンクに入れ、撹拌を開始した。

空気圧ポンプ部に取り付けたホモジナイザーから残留WFIを除き、次いで冷WFI(25mL)ですすいだ。ガラス製プランジャーを伴ったコールドジャケット付き10mLガラス製Popper and Sonsシリンジをそのホモジナイザーの入口および出口のルアーロックフィッティングに取り付けた。そのホモジナイザーのバイパスバルブを開き、それらのシリンジプランジャーを交互に押すことにより、出口シリンジと入口シリンジの間で一次エマルジョンを数回移動させ、前記一次エマルジョンの最終位置は前記入口シリンジ内にあった。前記バイパスバルブを閉め、約30mL/分のポンピング速度で空気圧部操作を開始した。前記入口シリンジの内容物を前記出口シリンジに十分に移したとき、前記バイパスバルブを急速に開き、次いで、前記出口シリンジのプランジャーを押し下げて、均質化した一次エマルジョンを前記入口シリンジに素早く戻し、その後、前記バイパスバルブを閉じ、第2の通過を開始した。このようにして、前記一次エマルジョンを、ホモジナイザーを通る20回の別々の通過に供した。この操作の終了時には、前記一次エマルジョンは前記出口シリンジ内にあった。

前記出口シリンジを前記ホモジナイザーの出口から外し、PV1に取り付け、前記一次エマルジョンを前記シリンジからPV1に注入した。PV1を窒素で加圧し(約8〜10psi)、混合物を約5分間撹拌した。窒素圧をPV1において維持し、PV2の通気を大気に向かって行った。PV1からPV2への32%ショ糖溶液と混合した前記一次エマルジョンの撹拌溶液の移送を、前記ホモジナイザーを一回通過させて達成した。次いで、Pall Sciences 32mm 0.8/0.2ミクロンAcrodiscシリンジフィルターをPV2とPV3の間に取り付けた。PV2を窒素により約12psiで加圧し、PV3の通気を大気に向かって行い、PV2からPV3への溶液の濾過/移送を開始させた。約5分後、圧力を15psiまで上昇させ、約10分後に25psiまで上昇させた。濾過の完了には約30〜40分を要し、移送はほぼ定量的であった。

約4℃に冷却したPV3を窒素で約8psiまで加圧し、溶液を約15分間撹拌した。この時間の後、灰色のブチルゴム製ノッチ付ストッパーを取り付けた40本の2mL(公称容積)の血清バイアルを入れたWheatonバイアルトレイを冷蔵庫から取り出した。その入口側に雄ルアーロックコネクター、その出口側にダブル雄ルアーコネクターに取り付けられる雌ルアーフィッティング、一方向活栓(閉位置にある)、そして最後に16ゲージの針が取り付けられた1/16インチ内径の編込みシリコンチューブをPV3の浸漬管活栓に固定した。PV3中の圧力を5psiに調整し、溶液の最初の2mLを除去した。次いで、前記バイアルからノッチ付きストッパーを外し、PV3に取り付けた管材料の遠位端で前記活栓を開閉し、前記ノッチ付きストッパーを交換することにより前記バイアルに充填した(10の群において)。10本のバイアルに充填した後、それらを手で圧着した。PV3の溶液が消費されるまで、この手順を繰り返し、約2.6〜2.7mLの充填で34本のバイアルを得た(約88〜91%の生成物収率)。前記バイアルをクリンプ圧密性について検査し、必要に応じて、厳密な圧着力を確実にするために再度圧着した。安定性試験のために前記バイアルを4℃で冷蔵庫に保存した。

調製直後の生成物の粒径分析は、充填バイアルの全範囲にわたって選択した5本のバイアルについてNicomp 380 DLSサブミクロン粒子サイザー(Particle Sizing Systems、フロリダ州ポートリッチー)を用いて行った。

IWMD中で測定した、TDFH−化合物20aナノエマルジョンの平均粒径は、約216nmであり、異なる試料間であまり変化しない。さらに、TDFH−化合物20aナノエマルジョンの平均99%累積分布は318nm未満である。

前記PSS Accusizer 780 SIS(Particle Sizing Systems、フロリダ州ポートリッチー)を使用する光遮蔽によって、0.5〜50ミクロン領域の粒度測定を行った。平均して、TDFH−化合物20ナノエマルジョン全体の総体積の約0.9%は、5.02〜50.45ミクロンの間の大きさの粒子を含有する。

実施例4 高圧均質化により調製したDDFPおよび化合物20aのナノ粒子エマルジョン 実験を行い、高圧均質化により調製したDDFP−化合物20aナノエマルジョンのサブミクロン粒径を研究した。TDFHに代えてDDFP(Fluoromed、テキサス州ラウンドロック)を用いた以外は、実施例3の方法により前記ナノエマルジョンを調製した。サブミクロン粒度測定はPSS Nicomp 380 DLSサブミクロン粒度測定装置(Particle Sizing Systems、フロリダ州ポートリッチー)を用いて行った。

DDFP−化合物20ナノエマルジョンのサブミクロン粒径の236.4nmの強度補正平均径および415.7nm未満の99%累積分布は、DDFP−化合物21、TDFH−化合物21およびTDFH−化合物20aのナノエマルジョンについて得られた初期値と本質的に等価である。

実施例5 ボルテックスし、その後超音波処理することにより調製したDDFPおよび化合物20aのナノ粒子エマルジョン 実験を行い、ボルテックスし、その後超音波処理することにより調製したDDFP−化合物20aナノエマルジョンのサブミクロン粒径を研究した。262mLの総容積の円筒形ガラス瓶は、浮遊式磁気撹拌棒と、2つのガス入口と二位置ボトムエントリーボールバルブ−浸漬管の組み合わせを備えたネジ山の付いた蓋を備え、乾燥した超高純度窒素ガスでパージされた。次いで、水性(WFI、HycloneからのHypure)のリン酸緩衝化(10mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、pH6.9)スクロース溶液(30%w/v)210mLと化合物20(J.Tech Sales、フロリダ州ボカラトン)溶液(0.2ミクロン濾過蒸留脱イオン水10.68mL中に0.672g)を262mL容器中で混合し、4℃で冷却しながら撹拌した。5分間撹拌した後、前記容器を窒素で3psiまで加圧した。前記ボールバルブの出口の1つにDow Corning Silastic(登録商標)管材料(1/8インチ外経)を取り付け、これをルアーから1/8インチのバーブアダプターを介して3方向滅菌使い捨て活栓に接続した。残りの2つのポートには、10mLのBecton and Dickinson(ニュージャージー州フランクリンレイクス)の滅菌使い捨てシリンジおよび18ゲージの1.5インチの滅菌使い捨て針を取り付けた。

前記した三方活栓を配置して、7.8mLの容量が前記シリンジに入るまで、前記容器から前記シリンジに溶液を吸引させた。次いで、前記活栓の位置をセットして、前記シリンジから18ゲージの針を通って溶液を送達させた。トレイの25本の公称5mL容量(9mLの全容量)の血清バイアル(乾燥窒素ガスでパージし、ハロブチル栓を取り付け、4℃の冷蔵庫に1時間保持した)に、前記栓をわずかに持ち上げ、前記バイアルの口に針先端を配置し、前記シリンジのプランジャーを押し込み、その後前記栓を迅速に交換することによって、前記溶液の7.8mLアリコートを充填した。すべてのバイアルに前記溶液を充填した後、Becton and Dickinson 0.5mL Lo Dose U−100インスリンシリンジを用いて各バイアルに冷(約0℃)DDFP(0.156g、0.089mL)を迅速に充填し、直ちに栓をしかつクリンプキャップをした。

ナノ粒子を調製するために、バイアルを4500rpmで1分間直立させ、1分間逆にし、そして1分間直立させてボルテックスした。次いで、前記バイアルを、VWR Aquasonic 75HT超音波洗浄浴の中央にネック部まで入れ、5分間超音波処理を行った。第2のバイアルを同じ方法で処理し、前記PSS Nicomp 380 DLSサブミクロン粒子サイザー(Particle Sizing Systems、フロリダ州ポートリッチー)を用いて粒径および分布を分析した。

DDFP−化合物20aナノエマルジョンのサブミクロンの粒径の平均径274.5nmおよび600nm未満の99%累積分布は、DDFP−化合物21、TDFH−化合物21およびTDFH−化合物20aのナノエマルジョンについて得られた初期値を超えたが、依然として本明細書に記載されたナノエマルジョンについて検討された放出および保存可能期間の仕様の範囲内にある。

前記製剤は酸素が豊富な領域のペルフルオロカーボンに酸素を吸収し、酸素欠損があり結果として低酸素圧を生じる組織(低酸素組織)への移送時に酸素を放出するように設計される。したがって、前記製剤が酸素に富んだ環境または酸素濃度が乳化されたペルフルオロカーボンの酸素濃度よりも高い環境に注入されるとき、前記製剤は先ずそれが存在する溶液から溶存酸素を吸収する。前記ナノエマルジョン粒子を低酸素組織、または溶存酸素濃度が前記ナノ粒子における酸素濃度よりも低い組織に移送されるとき、酸素濃度の物理的勾配に基づいて予想されるように前記ナノ粒子から酸素が放出される。この実施例の製剤が水溶液から酸素を吸収することができるかどうかを評価するために、インビトロ試験を図7に示す装置を用いて行った。撹拌棒と共に約200mLの0.9%生理食塩水を含むジャケット付きビーカーを循環水浴(温度=37℃±0.3℃)に接続し、撹拌プレート(速度=550RPM)上に置いた。前記ビーカーの上部を、Oakton DO 110溶存酸素プローブ(イリノイ州ヴァーノンヒルズ)のためのアクセス穴および前記製剤の供給のためのより小さい穴を含むゴム栓を用いて覆った。温度および溶存酸素測定値が平衡化した後、5mLの製剤をその小さなアクセス穴を通して0.9%生理食塩水に注入した。次いで、前記アクセス孔をルアープラグフィッティングでシールし、前記容器の上部をパラフィルムで包み、酸素が前記容器に入るのを防止した。溶存酸素測定値を30秒間隔で90分間取得し、溶存酸素計のシリアルポート接続およびベンダー提供のCyberComm Portableデータ収集ソフトウェアを使用してラップトップコンピュータに自動的に転送した。測定期間にわたる酸素レベルの明らかな減少を図8にグラフ形式で示す。生理食塩水対照を用いた対応するグラフは、同じ期間にわたって溶存酸素レベルの低下を示さなかった。

実施例6 DDFPのナノエマルジョンの調製のためのC16ベースのリン脂質界面活性剤系の使用 実験を行い、パルミトイルベースのリン脂質界面活性剤系で調製されたDDFPナノエマルジョンのサブミクロンの粒径を研究した。50mLビーカー中のプロピレングリコールの22mLアリコートを撹拌しながら55℃まで加熱した。1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(399mg)、1,2−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5000]ナトリウム塩(305mg)および1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(45.88mg)を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで(5〜15分間)混合物を撹拌した。次に、前記リン脂質のプロピレングリコール溶液を、約2分間かけて55℃で一塩基性リン酸ナトリウム・H₂O(173.9mg)と無水二塩基性リン酸ナトリウム(137.87mg)を含む水/グリセロール95/5v/v(200.7mL)の撹拌混合物に滴下した。前記リン脂質のグリセロール溶液の添加後、溶液を5分間撹拌した。この溶液を直ちに32mm Pall Sciences GH Polypro(登録商標)0.2ミクロンフィルターを通して250mlボトルに加圧濾過し(push−filtered)、次いでそのボトルを直ちに乾燥超高純度窒素でパージした。前記溶液を周囲温度まで冷却させた。次いで、公称5mLの血清バイアル(実際容量9mL)にリン脂質懸濁液の7.56mLアリコートを充填し、続いてヘッドスペースを乾燥超純窒素でパージし、ハロブチルゴム栓を用いて栓をした。栓をしたバイアル(トレイ中)を4℃の冷蔵庫に入れ、それらのバイアルの内容物がその温度に平衡するまで置いた。次いで、前記トレイを取り出し、実施例5に記載したように、前記バイアルにDDFP(Fluoromed、テキサス州ラウンドロック)を充填し、クリンプキャップをした。前記ナノエマルジョンを、実施例5に記載したように前記バイアルをボルテックスしかつ超音波処理(異なる時間の期間)することによって調製した。超音波処理時間は2分、8分、および16分であった。

表12のデータによれば、16分間の超音波処理後に得られたナノエマルジョンは、強度補正平均粒径の最適値内にあり、99%累積分布<値は、ペルフルオロカーボンベースの界面活性剤系を用いたDDFPナノエマルジョンの所望の値に匹敵する。

実施例7 界面活性剤としてのC14ベースのリン脂質系および混合成分のバイアルの超音波処理を用いたDDFPナノエマルジョンの調製 50mLビーカー中のプロピレングリコールの22mLアリコートを撹拌しながら55℃まで加熱した。1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(677.9mg)、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000]ナトリウム塩(174mg)および1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(50.95mg)を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで(約15分間)混合物を撹拌した。次いで、前記リン脂質のプロピレングリコール溶液を、約2分間かけて55℃で一塩基性リン酸ナトリウム・H₂O(173.9mg)と無水二塩基性リン酸ナトリウム(137.87mg)を含む水/グリセロール95/5v/v(200.7mL)の撹拌混合物に滴下した。前記リン脂質のグリセロール溶液の添加後、溶液を5分間撹拌した。この溶液を直ちに32mm Pall Sciences GH Polypro(登録商標)0.2ミクロンフィルターを通して250mLボトルに加圧濾過し、次いでそのボトルを直ちに窒素でパージした。前記溶液を周囲温度まで冷却させた。次いで、公称5mLの血清バイアル(実際容量9mL)にリン脂質懸濁液の7.56mLアリコートを充填し、続いてヘッドスペースを乾燥超純窒素でパージし、ハロブチルゴム栓を用いて栓をした。栓をしたバイアル(トレイ中)を4℃の冷蔵庫に入れ、それらのバイアルの内容物がその温度に平衡化するまで置いた。次いで、前記トレイを取り出し、実施例5に記載したように、前記バイアルにDDFP(Fluoromed、テキサス州ラウンドロック)を充填し、クリンプキャップをした。前記ナノエマルジョンを、実施例5に記載したようにバイアルをボルテックスしかつ超音波処理することにより調製した。

実施例5の製剤の評価について記載したように、酸素に富んだ環境から酸素を吸収するその能力について前記製剤を評価した。測定期間にわたる酸素レベルの明らかな低下を図9にグラフで示す。生理食塩水対照を用いた対応するグラフは、同じ期間にわたって溶存酸素レベルの低下を示さなかった。

実施例8 界面活性剤としての化合物20a(DuPont FS−3100)と組み合わせたC14ベースのリン脂質系および混合成分のバイアルの超音波処理を用いたDDFPナノエマルジョンの調製

製剤は1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(677.9mg)、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000]ナトリウム塩(174mg)および1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(50.95mg)、および正味のDuPont Capstone FS−3100 化合物20a(16μL、23mg、0.3%w/v)、続いてDDFP(0.153g、89μL、2%w/v)からなった。前記バイアルを直ちに1分間直立してボルテックスし、さらに1分間逆さにして行った。次いで、前記バイアルをVWR Aquasonic 75HT超音波洗浄浴中で8分間超音波処理した。これに続いて、前記エマルジョンの5.2mLアリコートを前記バイアルから取り出し、0.1mLアリコートを前記PSS Nicomp 380 DLSサブミクロン粒子サイザーを用いた粒度測定に供し、5mLアリコートを上記の酸素取り込みアッセイに用いた。超音波処理後のこの製剤の粒度測定データを表14に示す。

測定期間にわたる酸素レベルの明確な減少を図10にグラフ形式で示す。生理食塩水対照を用いた対応するグラフは、同じ期間にわたって溶存酸素レベルの低下を示さなかった。

データの裏づけのない実施例1 界面活性剤としてのC14ベースのリン脂質系および一次エマルジョンの均質化、その後の均質化移送およびサブミクロン濾過を用いたDDFPナノエマルジョンの調製 50mLビーカー中のプロピレングリコールの22mLアリコートを撹拌しながら55℃まで加熱する。1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(677.9mg)、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000]ナトリウム塩(174mg)および1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(50.95mg)を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで(約15分)混合物を撹拌する。溶液を周囲温度まで冷却させ、続いて注射用水(20mL)を添加して10℃まで冷却し、冷DDFP(4.51g、2.61mL)を添加し、10℃で30分間急速に撹拌する。得られた材料を、Kirkland productsのハンドヘルドホモジナイザーを用いて5℃で合計20回通過させて不連続均質化に供する。次いで、この材料を注射用水中のグリセロールの溶液に添加する。次いで、ナノエマルジョンを205.4mLの30%スクロースの撹拌溶液に添加し、窒素雰囲気(5psi)下で10分間撹拌する。この後、溶液を前記ホモジナイザーを介して2〜5℃に保持した第2の容器に移した後、それを15分間撹拌し、Pall Sciences 0.8/0.2ミクロンAcropak 200フィルターを通して2〜5℃で第3の容器に濾過して移送後、その温度で15分間撹拌する。次に前記材料を公称5mLのWheatonバイアルに充填し、灰色のハロブチルゴム栓を用いて栓をしかつクリンプキャップをして保存する。

データの裏づけのない実施例2 界面活性剤としてC14ベースのリン脂質系を用いたTDFHナノエマルジョンの生成 50mLビーカー中のプロピレングリコールの22mLアリコートを撹拌しながら55℃まで加熱する。実施例1のリン脂質を撹拌しながら添加し、リン脂質が溶解するまで(約15分間)混合物を撹拌する。次いで、前記リン脂質のプロピレングリコール溶液を、約2分間かけて55℃で一塩基性リン酸ナトリウム・H₂O(173.9mg)と無水二塩基性リン酸ナトリウム(137.87mg)を含む水/グリセロール95/5v/v(200.7mL)の撹拌混合物に滴下する。前記リン脂質のグリセロール溶液の添加後、溶液を5分間撹拌する。この溶液を直ちに32mm Pall Sciences GH Polypro(登録商標)0.2ミクロンフィルターを通して250mLボトルに加圧濾過し、次いで直ちに窒素でパージする。前記溶液を周囲温度まで冷却させる。次いで、公称5mLの血清バイアル(実際容量9mL)にリン脂質懸濁液の7.56mLアリコートを充填し、続いてヘッドスペースを乾燥超純窒素でパージし、ハロブチルゴム栓を用いて栓をする。栓をしたバイアル(トレイ中)を4℃の冷蔵庫に入れ、前記バイアルの内容物がその温度に平衡化するまで置く。次いで、前記トレイを取り出し、実施例5に記載したように、前記バイアルにTDFH(Sigma Aldrich Co.、ミズーリ州セントルイス)を充填し、クリンプキャップをする。前記ナノエマルジョンは、実施例5に記載したようにバイアルをボルテックスしかつ超音波処理することによって調製する。

データの裏づけのない実施例3 補助界面活性剤としての化合物20aを有するC14ベースのリン脂質系および混合成分のバイアルの超音波処理を用いたDDFPナノエマルジョンの調製 界面活性剤系がC14−リン脂質ベース系に加えて30モル%の化合物20aを含むことを除いて、実施例6の方法に従う。次いで、ナノエマルジョンを同様に調製する。ラウロイル(C12)ベースのリン脂質界面活性剤系に基づくナノエマルジョンの調製には、実施例1〜6および理論実験例1および2の類似の手順および技術を用いることができる。

本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、それらの実施形態に対する修正および適合が行われ得ることは当業者にとって明らかである。

データの裏づけのない実施例4 界面活性剤としてのC12ベースのリン脂質系および一次エマルジョンの均質化、その後の均質化移送およびサブミクロン濾過を用いたDDFPナノエマルジョンの調製 50mLビーカー中のプロピレングリコールの22mLアリコートを撹拌しながら55℃まで加熱する。1,2−ジドデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(677.9mg)、1,2−ジドデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000]ナトリウム塩(174mg)および1,2−ジドデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(50.95mg)を撹拌しながら順次添加し、リン脂質が溶解するまで(約15分間)混合物を撹拌する。溶液を周囲温度まで冷却させ、続いて注射用水(20mL)を添加して10℃まで冷却し、冷DDFP(4.51g、2.61mL)を添加し、10℃で30分間急速に撹拌する。得られた材料を、Kirkland productsのハンドヘルドホモジナイザーを用いて5℃で合計20回通過させて不連続均質化に供する。次いで、この材料を注射用水中のグリセロールの溶液に添加する。次いで、ナノエマルジョンを205.4mLの30%スクロースの撹拌溶液に添加し、窒素雰囲気(5psi)下で10分間撹拌する。この後、溶液を前記ホモジナイザーを介して2〜5℃に保持した第2の容器に移した後、それを15分間撹拌し、Pall Sciences 0.8/0.2ミクロンAcropak 200フィルターを通して2〜5℃で第3の容器に濾過して移送後、その温度で15分間撹拌する。次に前記材料を公称5mLのWheatonバイアルに充填し、灰色のハロブチルゴム栓を用いて栓をしかつクリンプキャップをして保存する。

本出願人の開示は、図面を参照して好ましい実施形態において本明細書に記載され、図中、同様の番号は同じまたは類似の要素を表す。本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、または同様の言語に関する参照は、前記実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じての表現「一実施形態では」、「実施形態では」、および類似の言語が出てくれば、必ずしもそうではないが、すべて同じ実施形態を指す。

本出願人の開示の記載された特徴、構造、または特性は、1つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。本明細書の説明では、本発明の実施形態の完全な理解をもたらすために多数の特定の詳細が列挙される。しかしながら、当業者は、特定の詳細の1つ以上を用いずに、または他の方法、構成要素、材料などを用いて、本出願人の組成物および/または方法を実施できることを認識するであろう。他の例では、周知の構造、材料、または操作は、本開示の態様を不明瞭にすることを避けるために、詳細には示されていないかまたは記載されていない。

含まれる概略フローチャート図は、一般的に、論理フローチャート図(例えば、図1、2、3、4および5)として示される。このように、示された順序およびラベル付けしたステップは、提示された方法の一実施形態を示す。例示された方法の1つまたは複数のステップまたはその一部に対する機能、ロジック、または効果が等価な他のステップおよび方法も考えられる。さらに、使用するフォーマットおよび記号は、前記方法の論理的ステップを説明するために提供され、前記方法の範囲を限定するものではないことが理解される。フローチャート図には、様々な矢印の種類および線種を採用することができるが、対応する方法(例えば、図1、2、3、4および5)の範囲を限定するものではないことが理解される。実際、いくつかの矢印または他のコネクタを使用して、前記方法の論理的な流れのみを示すことができる。例えば、矢印は、図示された方法の列挙されたステップの間の、指定されていない持続時間の待機期間または監視期間を示すことができる。さらに、特定の方法が生じる順序は、示されている対応するステップの順序に厳密に従うこともあれば、そうでないこともある。

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料も、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書で列挙する方法は、開示された特定の順序に加えて、論理的に可能な任意の順序で実施することができる。

参照による援用 特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献への参照および引用は、本開示においてなされている。すべてのそのような文献は、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。本明細書において参照により援用されると言われているが、本明細書に明示的に記載された既存の定義、言及または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその一部分は、援用された材料と本発明の開示材料の間で矛盾が生じない範囲のみ援用される。矛盾が生じた場合、その矛盾は本開示を好ましい開示として支持して解決されるべきである。

均等物 代表的な実施例は、本発明の説明を補助することを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、またそのように解釈されるべきものでもない。実際に、本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の様々な変更および多くのそれらのさらなる実施形態は、本明細書に含まれる実施例ならびに科学的文献および特許文献への参照を含む、本明細書の全内容から当業者に明らかになるであろう。前記実施例は、その様々な実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な追加情報、例示および指針を含む。