增加TAG产量的修饰藻类
阅读：2发布：2022-05-05
专利汇可以提供增加TAG产量的修饰藻类专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及遗传修饰的微藻，该遗传修饰是通过抑制以棕榈酸(饱和 脂肪酸 )为底物且与单半乳糖甘油二酯(MGDG)的产量相关的延长酶(Δ0-ELO)的酶活性而实现的。本发明还涉及用于培养所述微藻以增加三酰基甘油(TAG)产量的方法，和 收获 所述TAG的方法。，下面是增加TAG产量的修饰藻类专利的具体信息内容。
1.遗传修饰的微藻，其中由下述基因编码的Δ0-延长酶(Δ0–ELO)活性被抑制：
该基因编码SEQ ID NO 1的蛋白质，或者包含与SEQ ID NO 1至少45％同一性、具有位于富含R-和K-的环境中的HxxHHH基序，且在其C-端部分具有富含K-的基序的同源序列的蛋白质；
所述活性是通过在该编码Δ0-ELO的基因中引入抑制该基因表达的突变(KO)来抑制的。
2.根据权利要求1的微藻，其选自含有光合作用细胞器的微藻。
3.根据权利要求2的微藻，其选自隐甲藻属(Crypthecodinium)、小球藻属(Chlorella)、小环藻属(Cyclotella)、裸藻属(Euglena)、红球藻属(Haematococcus)、等鞭金藻属(Isochrysis)、单胞藻属(Monodus)、微球藻属(Nanochloris)、微拟球藻菌属(Nannochloropsis)、菱形藻属(Nitzschia)、奥杜藻属(Odontella)、微拟球藻属(Phaoedactylum)、栅藻属(Scenedesmus)、扁藻属(Tetraselmis)和海链藻属(Thalassiosira)的微藻。
4.根据权利要求1至3中任一项的微藻，其选自微拟球藻属、海链藻属和微拟球藻菌属的微藻。
5.根据权利要求1至4中任一项的微藻，其是通过对编码SEQ ID NO 1的Δ0–ELO1的Naga_100083g23基因的KO而修饰的迦得微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)。
6.一种用于生产富含三酰基甘油(TAG)的生物质的方法，其包括在适用于促进微藻细胞生长和增殖的培养基中培养根据权利要求1至5中任一项的遗传修饰的微藻。
7.一种用于生产三酰基甘油(TAG)的方法，其包括：获得根据权利要求6的富含TAG的生物质，和从所述生物质中分离TAG。
8.生物质，其包含根据权利要求1至6中任一项的微藻。
增加TAG产量的修饰藻类
发明领域
[0001] 本发明涉及通过抑制延长酶(Δ0–ELO)的酶活性而遗传修饰的微藻，该酶使用棕榈酸(饱和脂肪酸)作为底物，且与单半乳糖甘油二酯(MGDG)的产量相关。本发明还涉及培养所述微藻以增加三酰基甘油(TAG)的产量以及TAG的回收率的方法。现有技术
[0002] 已经研究了长链多不饱和脂肪酸的合成途径，且植物和微藻的合成途径是本领域技术人员已知的。它们通常包括以与辅酶A所成的硫酯的形式合成油酸(一种具有双键的C18脂肪酸(18:1))和亚油酸(18:2)，，然后在延长酶和去饱和酶的交替作用下进行一系列延伸反应并形成不饱和键。现有技术(Cookand Hildebrand,2015；Jung et al.,2007；Kihara,2012；Lee et al.,2006；Ramakrishnan et al.,2012；Tehlivets et al.,2007)中已经描述了对去饱和脂肪酸(包含双键)有活性的几个延长酶。专利US 8,809,046中也描述了对去饱和脂肪酸有活性的微拟球藻延长酶。
[0004] 申请WO 2014/207043描述了通过基因敲除(knocking–out,KO)某些基因的遗传修饰的微藻的制备。该申请描述了用于微藻中的靶向基因突变的TALE核酸酶的用途。给出了基因打靶的几个实例，特别是对Δ6-延长酶(Δ6-ELO)的打靶，这种酶对在位点Δ6处具有双键的脂肪酸有活性。
[0005] 在此申请中，作者声称通过抑制Δ6-ELO的表达获得了TAG的增加，但没有说他们得到的克隆能够长时间生长。申请WO 2014/207043中声称的TAG的增加也伴随着细胞生长的抑制。
发明内容
[0007] 本发明涉及遗传修饰的微藻，其中延长酶(Δ0–ELO)活性被抑制。
[0008] 本发明特别涉及遗传修饰的微藻，其选自包含光合作用细胞器的微藻，尤其是隐甲藻属(Crypthecodinium)、小球藻属(Chlorella)、小环藻属(Cyclotella)、裸藻属(Euglena)、红球藻属(Haematococcus)、等鞭金藻属(Isochrysis)、单胞藻属(Monodus)、微球藻属(Nanochloris)、微拟球藻属(Nannochloropsis)、菱形藻属(Nitzschia)、奥杜藻属(Odontella)、褐指藻属(Phaeodactylum)、栅藻属(Scenedesmus)、扁藻属(Tetraselmis)和海链藻属(Thalassiosira)。
[0009] 优选地，本发明涉及其中Δ0–ELO活性是多因一效性(multigenic)的微藻，更优选地，此时仅有与MGDG产量相关的Δ0–ELO被抑制。
[0010] 本发明还涉及用于生产富含TAG生物质的方法，其包括在适用于促进微生物细胞生长和繁殖的培养基中培养根据本发明的遗传修饰的微藻。本发明还涉及TAG生产方法，其包括获得前述富含TAG的生物质，并分离因此产生的TAG。
[0012] 图1显示重建的迦得微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)中极长链多不饱和脂肪酸的生物合成途径。叶绿体中脂肪酸合成可以生成16:0(棕榈酸)、18:0(硬脂酸)和18:1(油酸)前体物质，这些前体物质被输出至胞液。18:0可以在叶绿体硬脂酰-ACPΔ9-去饱和酶(SAD)或内质网Δ9-去饱和酶(ERΔ9FAD)作用下去饱和为18:1。在迦得微拟球藻(N.gaditana)基因组中已鉴定了8个编码延长酶的候选基因和6个编码去饱和酶的基因。鉴定为能够转化16:0饱和底物的延长酶称为Δ0–ELO。鉴定为能够转化在位点Δ6处具有双键的不饱和底物(18:3)的延长酶称为Δ6–ELO。鉴定为能够转化在位点Δ5(20:5)处具有双键的不饱和底物的延长酶称为Δ5–ELO。
[0013] 图2显示6个迦得微拟球藻饱和脂肪酸Δ0–ELO:Naga_100083g23(SEQ ID NO 1)、Naga_100162g4(SEQ ID NO 2)、Naga_100004g102(SEQ ID NO 3)、Naga_100399g1(SEQ ID NO 4)、Naga_100162g5(SEQ ID NO 5)和Naga_100017g49(SEQ ID NO 6)的序列。
[0014] 图3显示推定的脂肪酸延长酶或文献中鉴定的脂肪酸延长酶的系统发生树，按真核生物的代表类群区分。选择的序列涵盖真核生物的生物多样性，其包括后鞭毛生物(Opisthokonts)(例如真菌(酵母属))和后生动物(果蝇属(Drosophil)、蝇属(Musca)、蜜蜂属(Apis)、熊蜂属(Bombus)、新杆状线虫属(Caenorhabditis)、人属(Homo)、小鼠属(Mus)、原鸡属(Gallus))，不等鞭毛类(Heterokonts)(褐脂藻属、海链藻属、外子藻属(Ectocarpus)、疫霉属(Phytophthora)、白绣属(Albugo)、水霉属(Saprolegni)、丝囊霉属(Aphanomyces))，顶复动物(弓浆虫属(Toxoplasma)、子虫属(Neospora)、艾美球虫属(Eimeria)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、疟原虫属(Plasmodium)、簇虫属
(Gregarina))，定鞭金藻(球石藻(Emiliania))，淀粉鞭毛藻属(Guillardia)和动质体目(锥体虫属(Trypanosoma)、利什曼虫属(Leishmania))。使用MUSCLE程序比对氨基酸序列，并使用Neighbour–Joining方法构建系统发生树。星号表明文献中表征为或建议为延长酶的序列(Cook and Hildebrand,2015；Jung et al.,2007；Kihara,2012；Lee et al.,2006；
Ramakrishnan et al.,2012；Tehlivets et al.,2007)。
(Gregarina))，定鞭金藻(球石藻(Emiliania))，淀粉鞭毛藻属(Guillardia)和动质体目(锥体虫属(Trypanosoma)、利什曼虫属(Leishmania))。使用MUSCLE程序比对氨基酸序列，并使用Neighbour–Joining方法构建系统发生树。星号表明文献中表征为或建议为延长酶的序列(Cook and Hildebrand,2015；Jung et al.,2007；Kihara,2012；Lee et al.,2006；
Ramakrishnan et al.,2012；Tehlivets et al.,2007)。
[0015] 图4显示NgΔ0–ELO1(Naga_100083g23)的氨基酸序列。根据(Denic and Weissman,2007)和(Hashimoto et al.,2008)鉴定特征性延长酶基序：一个位于富含精氨酸(R)和赖氨酸(K)的环境中的HxxHHH基序，对于3-酮脂酰-CoA合酶对饱和或单不饱和脂肪酸延长的活性是必需的；一个LYF基序(也存在于Fen1p超家族的酵母延长酶的序列中)，其接受具有18至24个碳原子的脂酰基链的脂肪酸作为底物；与C端部分中的富含K的基序相关的内质网中的滞留信号(Jackson et al.,1990)；用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测的7次跨膜域(PM)。
[0016] 图5显示使用用Blossum 62比较矩阵的Smith–Waterman方法(Rice et al.,2000)的迦得微拟球藻延长酶Naga_100083g23与褐指藻属Δ0-延长酶(SEQ ID NO 7)的序列比对：矩阵：EBLOSUM62，“空位罚分”：10.0，“延伸罚分”：0.5，长度：287，同一性：123/237(51.9％)，相似性：161/237(67.9％)，空位：2/237(0.8％)，分数：690.5。
[0017] 图6显示使用用Blossum 62比较矩阵的Smith–Waterman方法(Rice et al.,2000)的迦得微拟球藻延长酶Naga_100083g23与海链藻属Δ0-延长酶(SEQ ID NO 8)的序列比对：矩阵：EBLOSUM62，“空位罚分”：10.0，“延伸罚分”：0.5，长度：237，同一性：135/287(47.0％)，相似性：178/287(62.0％)，空位：16/287(5.6％)，分数：713.5。
[0018] 图7显示迦得微拟球藻野生型(WT)株系和通过NgΔ0–ELO1基因的KO(NgΔ0–ELO1–KO)而转化的株系的整体脂肪酸分析。
[0019] 图8显示迦得微拟球藻野生型(WT)株系和通过NgΔ0–ELO1基因(NgΔ0–ELO1–KO)的KO转化的株系的甘油脂质概况：磷脂酰甘油(PG)、单半乳糖甘油二酯(MGDG)、二半乳糖二酰基丙三醇(DGDG)、磺基奎诺糖基二酰基甘油(SQDG)、二酰基甘油基三甲基高丝氨酸(DGTS)、溶血DGTS(LDGTS)、(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、三酰基甘油(TAG)和二酰基甘油(DAG)。
[0020] 图9显示培养迦得微拟球藻野生型(WT)株系和通过NgΔ0–ELO1基因(NgΔ0–ELO1–KO)的KO转化的株系获得的生物质和生长。
[0021] 发明详述
[0022] 本发明涉及遗传修饰的微藻，其中Δ0–延长酶(Δ0–ELO)活性被抑制。Δ0-延长酶是接受饱和脂肪酸作为底物(特别是棕榈酸)的Δ0-延长酶。根据本发明的微藻比其延长酶未被抑制的相应的微藻生产更多的TAG(图8)，同时相对于相应的未修饰的株系，生长和生物质生产特性基本上不受影响(图9)。根据本发明的微藻经过遗传修饰，使得Δ0-ELO被抑制，更特别地是与单半乳糖甘油二酯(MGDG)的产量相关的Δ0-ELO活性被抑制。实际上，本发明人能够得出这样的结论，即尽管与单半乳糖甘油二酯(MGDG)的产量相关的Δ0–ELO活性被抑制，但遗传修饰的菌株继续生产，从而允许相对于未修饰的相同菌株未改变的生长和生物质生产。
[0023] 根据本发明，“遗传修饰”意指通过人为干涉或在人为控制下获得的微藻基因组的任何修饰，包括将异源核酸序列导入所述微藻的基因组中。修饰的结果是，用增加新序列来丰富基因修饰的微藻的基因组，和/或通过去除天然序列的片段来减少该基因组。
[0024] “异源核酸序列”意指由人类或在人类控制下制备的任何合成序列，尤其是借助下述手段：通过已知的复制技术(如PCR)复制天然序列，通过组装天然基因的片段，同时引入或不引入突变。它可以是编码感兴趣的基因的序列，具有或不具有用于调控其在宿主生物中的表达的序列，或者是除了向靶基因引入旨在抑制其表达的突变(KO)之外没有其他功能的合成片段。有利地，所述异源核酸序列包含某些核酸片段，用于通过任何已知的同源重组或打靶DNA序列的技术将异源核酸序列靶向引入至靶基因。
[0025] 用于转化微藻的技术是技术人员熟知的。基因打靶技术也是如此。具体可以例举(Kilian et al.,2011)或申请WO 2014/207043。
[0026] 本发明特别适用于含有光合作用细胞器(例如叶绿体)的微藻。对于在叶绿体中产生16:0前体(棕榈酰-CoA)的微藻更具体地鉴定了所获得的效果。
[0027] 这些微藻是技术人员熟知的。具体可以例举隐甲藻属(Crypthecodinium)、小球藻属(Chlorella)、小环藻属(Cyclotella)、裸藻属(Euglena)、红球藻属(Haematococcus)、等鞭金藻属(Isochrysis)、单胞藻属(Monodus)、微球藻属(Nanochloris)、微拟球藻菌属(Nannochloropsis)、菱形藻属(Nitzschia)、奥杜藻属(Odontella)、褐指藻属(Phaoedactylum)、栅藻属(Scenedesmus)、扁藻属(Tetraselmis)和海链藻属
(Thalassiosira)的微藻。
(Thalassiosira)的微藻。
[0028] 本发明人证明了Δ0–ELO活性在微藻中是多因一效性的。更具体地，本发明适用于抑制Δ0–ELO活性为多因一效的微藻中的Δ0–ELO活性，更具体地，此时仅抑制与MGDG产量相关的Δ0-ELO活性。
[0029] 更具体地，本发明适用于这样的微藻，该微藻的被抑制的Δ0–ELO活性由编码SEQ ID NO 1或其同源序列的蛋白质的基因编码，所述同源序列包含与SEQ ID NO 1的至少40％同一性(优选至少45％同一性)、且包含位于富含R-和K-环境中的HxxHH基序，并且在其C端部分包含富含K的基序。
[0030] 这些结构要素为各种延长酶所共有，在由Naga_100083g23基因(图4)编码的SEQ ID NO 1中鉴定，并且在其他迦得微拟球藻Δ0–ELO序列(图2)中和褐指藻属(图5)和海联藻属(图6)序列中有发现。
[0031] 由于延长酶共有的这些结构要素，所述同源序列具有至少100个与SEQ ID NO 1相同的氨基酸，优选至少120个相同的氨基酸。
[0032] 技术人员将能够从已知序列或获自微藻基因组的那些序列中以及通过常规的单一或多重比对方法(例如Clustal方法(Sievers F.et al.,2011))，或基于用Blossum 62比较矩阵的Smith–Waterman方法(Rice et al.,2000)鉴定出与SEQ ID NO 1同源的其他序列。
[0033] 有利地，根据本发明的微藻选自褐指藻属、海链藻属和微拟球藻菌属的被鉴定为具有编码与SEQ ID NO 1(尤其是由SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8表示的蛋白质)同源的序列的基因的微藻。
[0034] 根据本发明的更优选的实施方案，所述微藻属于具有编码由SEQ ID NO 1表示的延长酶的基因的物种迦得微拟球藻。
[0035] 技术人员已知几种抑制Δ0-ELO活性的方式。例如，可以修饰微生物以促进其生产与16:0脂肪酸竞争结合所述酶的底物。还可以修饰所述微生物以表达将抑制编码Δ0-ELO的基因的翻译的核酸。还可以修饰所述微生物以表达将抑制编码Δ0-ELO的基因的转录的核酸。根据本发明优选的实施方案，通过在编码Δ0-ELO的基因中引入突变来转化所述微藻。此突变(KO)具有抑制基因的表达的作用。所述突变可包括增加核酸或核酸片段，以在基因的编码部分中插入“终止”密码子。所述突变还可包括去除基因中、启动子调控序列中和/或编码序列中的核酸片段。所述突变可包括从遗传修饰的微藻的基因组中完全去除靶基因。
[0036] 用于转化微藻以引入靶基因的KO的方法是本领域技术人员已知的，本领域技术人员能够将此类方法适用于编码Δ0-ELO的基因。具体可例举(Kilian等人，2011)或申请WO2014/207043。
[0037] 根据本发明的优选的实施方案，遗传修饰的微藻是对编码SEQ ID NO 1的Δ0–ELO1的Naga_100083g23基因的KO而修饰的迦得微拟球藻。
[0038] 本发明还涉及富含三酰基甘油(TAG)的生物质的生产，其包括在适用于促进生长和细胞增殖的培养基中培养根据本发明的遗传修饰的微藻。
[0039] 微藻培养方法是本领域技术人员熟知的，无论是自养、异养还是混合营养模式。根据本发明的优选的实施方案，在自养或混合培养模式下提供光照进行培养。具体可例举申请WO2012/035262和WO2015/004403中描述的培养方法。当然，技术人员将能够调适培养条件，尤其是培养基的组成、培养期间添加营养物的条件、温度和供氧循环以及光照条件，以促进生物质生产。
[0040] 本发明还涉及生产三酰基甘油(TAG)的方法，其包括获得根据本发明的富含TAG的生物质，并从该生物质中分离TAG。从生物质中分离TAG的方法是本领域技术人员熟知的。具体例举的方法包括从所述培养基中回收生物质(例如通过过滤或离心)，然后干燥所述生物质，再通过压榨提取脂肪(包括TAG)等步骤。可具体例举由Bligh,E.G.和Dyer,W.J.(1959)描述的方法和申请WO 1997/037032中的方法。
[0041] 分离的TAG也可以通过已知的纯化方法纯化，例如液/液萃取或减压下蒸馏。
[0042] 本发明还涉及通过根据本发明的方法获得的富含TAG的生物质。
[0043] 根据本发明，有利地，“生物质”意指通过培养产生的一组微藻细胞，其可以保持或不保持微藻细胞的物理完整性。因此，应理解，所述生物质可包括一定量(范围为0％至100％)的降解的微藻细胞。“降解的”意指微藻细胞的物理完整性可能已被改变，例如裂解的微藻，例如通过均质化过程产生。一旦产生，生物质可以是培养基中的粗生物质，也可以从培养基分离，任选经过干燥，任选经过降解。
[0044] 最后，本发明涉及通过根据本发明的方法获得的TAG，特别是相对于从根据本发明的生物质中提取的油未经过实质改变的、富含TAG的油。实施例
[0045] 材料和方法
[0046] 迦得微拟球藻(N.gaditana)菌株和培养条件
[0047] 迦得微拟球藻(Nannochloropsi gaditana)CCMP526野生型菌株(NgWT)和突变体保持在含有经改良的海盐(NaCl,21.194g.L–1；Na2SO4,3.55g.L–1；KCl,0.599g.L–1；NaHCO3,0.174g.L–1；KBr,0.0863g.L–1；H3BO3,0.023g.L–1；NaF,0.0028g.L–1；MgCl2.6H2O,9.592g.L–1；
CaCl2.2H2O,1.344g.L–1；SrCl2.6H2O,0.0218g.L–1；NaNO3,46.67mg.L–1和NaH2PO4,3.094mg.L–1)的f/2培养基(Guillard and Ryther,1962)中，20℃温和搅拌，交替12h/12h夜/昼光循环或在光子通量为30μmol.m-2s-1的白光下连续光照。以206个细胞.mL-1的密度接种Erlenmeyer烧瓶(50-100mL)或24孔板(2mL)中的培养物。
CaCl2.2H2O,1.344g.L–1；SrCl2.6H2O,0.0218g.L–1；NaNO3,46.67mg.L–1和NaH2PO4,3.094mg.L–1)的f/2培养基(Guillard and Ryther,1962)中，20℃温和搅拌，交替12h/12h夜/昼光循环或在光子通量为30μmol.m-2s-1的白光下连续光照。以206个细胞.mL-1的密度接种Erlenmeyer烧瓶(50-100mL)或24孔板(2mL)中的培养物。
[0048] 细胞在DMSO中-80℃储存，或者可以维持在补充有f/2培养基的1.5％琼脂平板上且每月传代培养。
[0049] 通过300μL培养物等分试样(TECAN Infinite M1000Pro)在750nm处的吸光度测定细胞密度。所有测定均在至少三个生物样品上进行，每个样品代表相同菌株的单个培养物。
[0050] Naga_100083g23基因(Δ0–ELO1)KO盒的克隆和迦得微拟球藻CCMP526的转化[0051] 转化载体包含p35S-LoxP盒，在泛素蛋白启动子和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)FcpA终止子的控制下的博来霉素(zeocin)抗性基因(ZEO，CDS 3078-3448)。两个侧翼区域含有对靶基因特异的限制性内切酶识别位点，以便在转化后通过同源重组插入基因组DNA进行KO(Kilian et al.,2011)。使用针对末端侧翼的寡核苷酸对5'-
gttgggaataatgcgggacc-3'(SEQ ID NO 9)和5'-ccgctttggtttcacagtca-3'(SEQ ID NO
10)和针对上游侧翼的5'-acgatgggtatgttgcttgc-3'(SEQ ID NO 11)和5'-
tgtacagggcggatttcact-3'(SEQ ID NO 12)，通过PCR扩增Naga_100083g23基因(Δ0-ELO1)的侧翼序列。
gttgggaataatgcgggacc-3'(SEQ ID NO 9)和5'-ccgctttggtttcacagtca-3'(SEQ ID NO
10)和针对上游侧翼的5'-acgatgggtatgttgcttgc-3'(SEQ ID NO 11)和5'-
tgtacagggcggatttcact-3'(SEQ ID NO 12)，通过PCR扩增Naga_100083g23基因(Δ0-ELO1)的侧翼序列。
[0052] 用转化载体转化迦得微拟球藻(Nannochloropsi gaditana)CCMP526野生型菌株，转化方法如Killian等人描述，做了如下修改：在指数生长期期间以306个细胞.mL-1的浓度收获108个NgWT细胞，用375mM D-山梨糖醇洗涤两次，然后重悬于100μL终体积中。从所述载体中消化出重组盒，并将1μg消化产物与悬浮液混合。在冰上孵育15分钟后，对细胞进行电穿孔(NEPA21Type II，Sonidel Ltd；BioRad MicroPulser)。将转化混合物转移至5mL f/2培养基中并在连续光照射下温育16小时。然后将细胞涂布在含有7μg/ml博来霉素的1.5％f/2琼脂平板上。在连续光照下孵育3至4周后获得菌落。
[0053] Naga_100083g23KO突变体的基因分型(NgΔ0-elo1KO)
[0054] 通过PCR进行Naga_100083g23KO突变体的基因分型，利用以下寡核苷酸对来评估博来霉素抗性基因侧翼序列的存在和Naga_100083g23基因的不存在：5'-gaggaatgtgtgtggttggg-3'(SEQ ID NO 13)，用于博来霉素抗性基因启动子，及5'-gccgtattgttggagtggac-3'(SEQ ID NO 14)，用于终止子序列；5'-gacacttctctgcctttgcc-
3'(SEQ ID NO 15)及5'-atggtggtaccagtggagga-3'(SEQ ID NO 16)，用于Naga_100083g23基因。
3'(SEQ ID NO 15)及5'-atggtggtaccagtggagga-3'(SEQ ID NO 16)，用于Naga_100083g23基因。
[0055] 通过qPCR对三个独立克隆中迦得微拟球藻基因组中插入的盒的数量进行定量，qPCR使用氯仿-酚法(Pacific Biosciences of California,Inc,2012；Cao etal.,2012)提取的DNA，且使用以下寡核苷酸：Naga_100083g23F 5′–gtgggcaccaaggttatgga–3′(SEQ ID NO 17)；Naga_100083g23R 5′–gaaggaggtgtggtacggtg–3′(SEQ ID NO 18)；papF5′–aagtggtacctttgctccgt–3′(SEQ ID NO 19)；papR5′–aaggtagccgagtagccaaa–3′(SEQ ID NO 20)；tubF5′–ttgagcataccgacgtgact–3′(SEQ ID NO 21)；tubR5′–gcgatgagcctgttcagatt–3′(SEQ ID NO 22)；zeoF5′–tgtgccaaaatcatacagcagg–3′(SEQ ID NO 23)；zeoR5′–cgaagtcgtcctccacgaag–3′(SEQ ID NO 24).
[0056] 脂质提取和分析
[0057] 根据Simionato等人描述的方法进行脂质提取和分析。通过与Abida等人(2013)描述的标准比较进行质谱分析。
[0058] 结果
[0059] 获得的结果显示在图7至9中。产生的脂质量在野生型(WT)菌株和NgΔ0-elo1KO突变体之间未观察到统计学上的显著差异(图7.A)。然而，观察到产生的脂肪酸类型的变化(图7.B)，产生的二十碳五烯酸，又称EPA(20:5)，的量减少8％。
[0060] 当比较产生的不同甘油脂质时(图8)，观察到WT菌株和NgΔ0-elo1KO突变体之间的显著差异，突变体中MGDG产量降低(-43.8％)，TAG产量增加(+71％)。
[0061] 最后，当比较生长曲线(图9A)和生物质产量(图9B)时，可以看出突变体中Naga_100083g23基因表达的抑制不改变这些特性。
[0062] 甘油脂质分析显示编码Δ0-ELO1的Naga_100083g23基因的KO、EPA合成的减少、MGDG合成的减少、以及附随的TAG合成的增加之间有关系。在产生的生物质相同的情况下，TAG产量获得了1.7至2倍的增加。
[0063] 参考文献
[0064] 专利和专利申请
[0065] US 8,809,046
[0066] WO 96/21022
[0067] WO 1997/037032
[0068] WO 2012/035262
[0069] WO 2014/207043
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