六价钼离子快速检测金标试纸及其制备方法与应用
专利汇可以提供六价钼离子快速检测金标试纸及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种用于快速检测重金属六价钼离子的金标 试纸 及其制备方法与应用。金标试纸底层为 支撑 层， 中间层 为 吸附 层，保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、金标 抗体 结合垫、 纤维 素膜层及 手柄 端的吸 水 垫，在 纤维素 膜层上设有偶联六价钼离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹和用兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的六价钼离子单克隆抗体。本发明能实现对 土壤 、水、食品中钼离子污染残留的快速检测，具有特异、敏感、快速、简便、结果形象直观、经济等优点；既可用于大批样品的筛检，又可用于小批样品的快速检测，适用范围广。，下面是六价钼离子快速检测金标试纸及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种用于快速检测六价钼离子的金标试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护膜固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为样品垫、金标抗体结合垫、纤维素膜层及手柄端的吸水垫，其中在纤维素膜层上设有偶联六价钼离子的载体蛋白溶液印制的检测印迹和用兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；所述金标抗体结合垫中包被有胶体金标记的特异性六价钼离子单克隆抗体；
检测印迹上偶联六价钼离子的载体蛋白的包被量为1μL/cm，载体蛋白浓度为1mg/mL；对照印迹上兔抗小鼠IgG抗体的包被量为1μL/cm，抗体浓度为1mg/mL；
所述偶联六价钼离子的载体蛋白溶液是由以下方法制备的：
6+
取20 mL钼酸与1mL浓度为10 mmol/L、pH值为8.0的HEPES缓冲液混合，得到Mo 溶液；称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1mL DMSO中，形成金属螯合剂溶液；
6+
将Mo 溶液和金属螯合剂溶液混合，调节溶液的pH值至7.4，25 ℃搅拌24 h，转速为1000
6+
r/min，形成Mo -ITCBE螯合物半抗原母液；
称取20 mg 载体蛋白BSA或OVA溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH 8.0的HEPES缓冲液
6+
中，形成载体蛋白溶液；取1mL Mo -ITCBE螯合物半抗原母液加入到1mL载体蛋白溶液中，调节pH值至9.0，室温下1000 r/min搅拌24 h，然后移入透析袋中透析7 d，收集透析液，
6+ 6+
制备出载体蛋白Mo -ITCBE-BSA或Mo -ITCBE-OVA，－20℃冻存备用。
2.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是：所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；所述样品垫用聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜、玻璃纤维棉或聚酯膜制成；吸水垫用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体结合垫用玻璃纤维棉制成。
3.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是：所述偶联六价钼离子的载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白；所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“︱︱”直线式印迹或“十十”字型排列印迹。
4.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征是：所述保护膜覆盖在样品垫、金标抗体结合垫和吸水垫上，在样品垫与金标抗体结合垫交界处对应的保护膜上偏向样品垫一侧
0.3-0.6 cm处印制有样品标记线。
5.根据权利要求1-4任一项所述的金标试纸，其特征是：所述胶体金标记的特异性六价钼离子单克隆抗体是通过以下方法制备的：
采用柠檬酸盐还原法制备，在三角烧瓶中加入975 mL双蒸水煮沸，加入15mL柠檬酸三钠，继续加热5 min，加入10 mL质量浓度为1%的氯金酸，继续加热至溶液呈橘红色，冷却至室温后得到胶体金溶液，4 ℃保存备用；
取胶体金溶液100 mL，用0.1 mol/L 的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2，磁力搅拌下逐滴加入浓度为0.2 mg/mL的六价钼离子单克隆抗体溶液，室温温育20 min，10000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀物用每升含100 g BSA、浓度为0.02 mol/L 的Na2B4O7溶液稀释，然后10000 r/min离心30 min，得到的沉淀物再用每升含10 g BSA、0.5 g叠氮钠、浓度为0.02 mol/L 的Na2B4O7溶液稀释，即获得胶体金标记的六价钼离子单克隆抗体，4 ℃保存备用；所得的胶体金溶液中金颗粒的粒径为25 nm，每1mL胶体金中含有3 ng六价钼离子单克隆抗体。
6.一种权利要求1所述金标试纸的制备方法，其特征是：该方法包括以下步骤：
（1）六价钼离子载体蛋白偶联物的制备：
6+
取20 mL钼酸与1mL浓度为10 mmol/L、pH 8.0的HEPES缓冲液混合，得到Mo 溶液；
6+
称取10 mg ITCBE溶于1mL DMSO中，形成金属螯合剂溶液；将Mo 溶液和金属螯合剂溶液
6+
混合，调节溶液的pH值至7.4，25 ℃搅拌24 h，转速为1000 r/min，形成Mo -ITCBE螯合物半抗原母液；
称取20 mg 载体蛋白BSA或OVA，溶于1mL浓度为10 mmol/L、pH 8.0的HEPES缓冲液
6+
中，形成载体蛋白溶液；取1mL Mo -ITCBE螯合物半抗原母液加入到1mL载体蛋白溶液中，调节pH值至9.0，室温下1000 r/min搅拌24 h，然后移入透析袋中透析7 d，收集透析液，
6+ 6+
制备出载体蛋白偶联物Mo -ITCBE-BSA或Mo -ITCBE-OVA，－20℃冻存备用；
（2）六价钼离子金标抗体的制备；
（3）金标抗体结合垫的制备；
（4）检测印迹和对照印迹的制备；
用所得的六价钼离子载体蛋白偶联物在纤维素膜层上制成检测印迹，用兔抗小鼠IgG抗体在纤维素膜层上制成对照印迹；检测印迹上偶联六价钼离子的载体蛋白的包被量为
1μL/cm，载体蛋白的浓度为1mg/mL；所述对照印迹上兔抗小鼠IgG抗体的包被量为1μL/cm，抗体浓度为1mg/mL；
六价钼离子金标抗体用于制备金标抗体结合垫，然后依次将支撑层、吸附层和保护膜组装成金标试纸。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：所述胶体金标记的特异性六价钼离子单克隆抗体的制备方法如下：
采用柠檬酸盐还原法，在三角烧瓶中加入975 mL双蒸水，煮沸，加入15 mL柠檬酸三钠，继续加热5 min，加入10 mL质量浓度为1%的氯金酸，继续加热至溶液呈橘红色，冷却至室温后得到胶体金溶液，4 ℃保存备用；
取胶体金溶液100 mL，用0.1 mol/L 的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH 8.2，磁力搅拌下逐滴加入浓度为0.2 mg/mL的六价钼离子单克隆抗体溶液，室温温育20 min，10000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀物用每升含100 g BSA、浓度为0.02 mol/L 的Na2B4O7溶液稀释，然后10000 r/min离心30 min，得到的沉淀物再用每升含10 g BSA和0.5 g叠氮钠、浓度为0.02 mol/L Na2B4O7溶液稀释，即获得胶体金标记的六价钼离子单克隆抗体，4 ℃保存备用；所得的胶体金溶液中金颗粒的粒径为25 nm，每1mL胶体金中含有3 ng六价钼离子单克隆抗体。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：所述的六价钼离子特异性单克隆抗体由以下方法制备：
6+
免疫动物：以Mo -ITCBE-BSA为免疫抗原，以Balb/c小鼠作为免疫动物，背部皮下多点注射，免疫剂量为每只每次50～100 μg，首免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫一次，共免疫5次；
6+
选择细胞融合备用小鼠：间接ELISA检测抗血清中Mo 螯合物多克隆抗体（pAb）效价，
6+ 6+
阻断ELISA检测Mo -EDTA pAb对Mo -EDTA的半数抑制浓度（IC50），挑选效价最高、IC50最低的小鼠，超免用于细胞融合；
制备阳性杂交瘤细胞：取NS0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞用PEG溶液进行细胞融合，经过4次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗六价钼离子的单克隆抗体细胞株；
制备单克隆抗体：对经产母鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，采集腹水纯化获得抗六价钼离子的单克隆抗体。
9.一种权利要求1-5任一项所述的金标试纸在快速检测六价钼离子中的应用。
六价钼离子快速检测金标试纸及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
发明内容
Mo 溶液；称取10 mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸ITCBE溶于1mL DMSO中，形成金属螯合
6+
剂溶液；将Mo 溶液和金属螯合剂溶液混合，调节溶液的pH值至7.4，25 ℃搅拌24 h，转速
6+
为1000 r/min，形成Mo -ITCBE螯合物半抗原母液；
冲液中，形成载体蛋白溶液；取1mL Mo -ITCBE螯合物半抗原母液加入到1mL载体蛋白溶液中，调节pH值至9.0，室温下1000 r/min搅拌24 h，然后移入透析袋中透析7 d，收集透析
6+ 6+
液，制备出载体蛋白Mo -ITCBE-BSA或Mo -ITCBE-OVA，－20℃冻存备用。
液；称取10 mg ITCBE溶于1mL DMSO中，形成金属螯合剂溶液；将Mo 溶液和金属螯合剂溶
6+
液混合，调节溶液的pH值至7.4，25 ℃搅拌24 h，转速为1000 r/min，形成Mo -ITCBE螯合物半抗原母液；
冲液中，形成载体蛋白溶液；取1mL Mo -ITCBE螯合物半抗原母液加入到1mL载体蛋白溶液中，调节pH值至9.0，室温下1000 r/min搅拌24 h，然后移入透析袋中透析7 d，收集透析
6+ 6+
液，制备出载体蛋白偶联物Mo -ITCBE-BSA或Mo -ITCBE-OVA，－20℃冻存备用；
效价，阻断ELISA检测Mo -EDTA pAb对Mo -EDTA的半数抑制浓度（IC50），挑选效价最高、IC50最低的小鼠，超免用于细胞融合；
强的单克隆抗体，抗体腹水效价为1∶6.4×10，亲和常数Ka为1.65×10 L/moL，交叉反应率小于0.01%，为其六价钼离子的痕量快速检测提供了保障。
具体实施方式
嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液混合均匀形成Mo 溶液；称取10mg异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸
6+
（ITCBE）溶于1mL 二甲基亚砜（DMSO），形成金属螯合剂溶液；将Mo 溶液和金属螯合剂溶
6+
液混合后，调节溶液的pH值至7.4，25℃搅拌24 h，转速为1000 r/min，形成Mo -ITCBE螯合物半抗原母液；
HEPES缓冲液中，形成载体蛋白溶液；取1mL Mo -ITCBE螯合物半抗原溶液加入到1mL载体蛋白溶液中，调节pH值至9.0，在室温下1000 r/min搅拌24 h，然后移入透析袋中透
6+
析7 d，收集透析液，制备出六价钼离子人工免疫抗原（载体蛋白偶联物）Mo -ITCBE-BSA或
6+
Mo -ITCBE-OVA，－20℃冻存备用。参见图3。
y=0.0004x＋0.0072，R＝0.9987，其中y为样品在波长为562nm处吸光度，x为样品蛋白浓度。
鼠5只，50 μg·0.2 mL/只，背部皮下多点注射。首免，用灭菌PBS稀释Mo -ITCBE-BSA，
6+
与等量CFA混合乳化；加强免疫，用灭菌PBS稀释Mo -ITCBE-BSA，与等量IFA混合乳化，首免后3周进行第二次免疫，以后间隔2周免疫一次，共免疫5次，第三次免疫后10 d断尾取血，37 ℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，4000 r/min 4 ℃离心5 min，取上清，－20℃保存备用。
断ELISA检测Mo -EDTA pAb对Mo -EDTA的IC50，挑选效价最高、IC50最低的小鼠，超免后用于细胞融合。
6
细胞数调至10个/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5 mL/只。接种细胞7-10 d后产生腹水，进行收集，于37 ℃水浴30 min，4 ℃放置过夜，12000 r/min离心5min，弃去上层的脂肪、IFA和下层的沉淀，饱和硫酸铵盐析法提纯后测定IgG含量和效价，－20℃保存备用。
为1∶6.4×10。
1.7 μg/mL的Mo -ITCBE-BSA包被，加入倍比稀释的Mo -EDTA mAb，再加入GaMIgG-HRP，
6+
TMB显色测A450nm值，以Mo -EDTA mAb浓度为横坐标，以A450nm值为纵坐标，绘出相应的2条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的A450nm值作为100%，在曲线上算出50% A450nm值时对应的
6+
Mo -EDTA mAb浓度，按照公式Kaff＝（n－1）/2（n[Ab']t－[Ab]t）计算 Ka。计算的单
10
克隆抗体的Ka为1.65×10 L/mol。
率，以抑制率B/B0为纵坐标，以不同浓度Mo -EDTA的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，
6+ 6+
进行相关回归分析，计算Mo -EDTA mAb对Mo -EDTA的IC50。鉴定结果，IC50为11.35 ng/mL。
Mo -ITCBE-BSA放于X-only单向喷点仪贮存池A，浓度为1mg/ml的RaMIgG放于贮存池B，开机分别点射于膜的中央，形成间距0.5 cm的检测线和质控线，自然干燥，密封，4 ℃保存备用。
结果 - + + + + + + + +
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种固相宏量合成非贵金属氧还原催化剂的方法、催化剂及其应用 | 2020-06-16 | 0 |
| 含有二硫代氨基甲酸盐与金属离子螯合剂的组合物及其制药用途 | 2020-06-29 | 2 |
| 三氧化二镧的制备方法及其包覆的电池正极材料 | 2020-10-26 | 1 |
| 一种锂离子电池复合隔膜的制备方法 | 2020-11-13 | 0 |
| 一种保坍型高性能固体聚羧酸减水剂及其制备方法和用途 | 2021-02-13 | 1 |
| 压裂用减阻剂组合物和压裂用减阻剂的制备方法及压裂用减阻剂 | 2021-03-23 | 0 |
| 一种银包铜双金属粉的制备方法 | 2022-10-20 | 0 |
| 含有木醋液的桑树专用肥 | 2021-01-18 | 1 |
| 非蛋白质梭菌毒素组合物 | 2020-08-08 | 0 |
| 可高效降解孔雀石绿药物的降解菌及其应用 | 2020-11-11 | 1 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
