技术领域
[0001] 本
发明涉及
烟草制品检测领域，具体涉及一种气-液界面暴露下卷烟烟气诱导细胞凋亡的测定方法。
背景技术
[0002] 细胞凋亡是细胞维持内环境稳定，在一定生理或病理条件下，受内在基因控制，按照自身程序自主有序的死亡。目前多通常采用磷脂酰丝
氨酸结合蛋白/碘化丙啶双参数法(Annexin V/PI法)来检测细胞凋亡。细胞凋亡是许多
生物学和病理学过程的重要组成部分，参与多种
疾病的发生和发展
进程。研究证实烟气及烟气中多种化学成分(自由基、丙烯
醛、巴豆醛等)导致细胞凋亡，对人体产生一定影响，例如烟气会使呼吸系统靶细胞巨噬细胞发生细胞凋亡，影响免疫细胞的吞噬功能，最终导致
炎症反应。
[0003] 烟气诱导细胞凋亡一般采用烟气冷凝物染毒诱导，而烟气冷凝物所采集的是烟气粒相部分，未真是反映烟气(包括粒相部分和气相部分)的生物学效应，并且实验结果还受到提取
溶剂和烟气陈化等因素的影响，染毒周期还长。与烟气冷凝物染毒相比气-液界面暴露染毒采用新鲜烟气与位于培养液上部的细胞直接
接触，可真正模拟人体呼吸系统接触烟气的状态，更加真实全面地反映卷烟烟气的生物学效应。另外，气-液界面暴露过程中，细胞反应比烟气冷凝物暴露更加敏感，能够快速完成暴露过程，缩短整个实验时间。
[0004] 随着日趋严格的烟草监管立法和深层次的吸烟与健康研究，烟草公司努
力寻求
风险更低的新型烟草制品，作为公司未来替代传统卷烟的产品。加热不燃烧卷烟作为一种新型烟草制品，烟气中有害成分释放量远低于传统卷烟。但针对加热不燃烧卷烟烟气的细胞凋亡，大都采用了烟气冷凝物的暴露方式，未见气-液界面暴露方法。
[0005] 目前，未见气-液界面暴露和Annexin V/PI联合起来对卷烟烟气导致的细胞凋亡进行测定的报道；另外，未见上述联合方法对加热不燃烧烟草制品的细胞凋亡进行检测。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种气-液界面暴露下卷烟烟气诱导细胞凋亡的测定方法。气-液界面暴露和Annexin V/PI联合检测方法以新鲜烟气为受试对象，能够较好地反映人体呼吸系统接触卷烟烟气的过程；暴露过程中细胞对烟气更为敏感，从而缩短了受试物暴露时间。
[0008] 本发明的测定方法采用的是全烟气暴露下的气-液界面染毒方式，以贴壁生长的巨噬细胞为研究对象，采用Annexin V/PI法测定细胞凋亡；该方法结果更真实直观，并且操作简便准确，为加热不燃烧卷烟和传统卷烟的安全性生物学评估提供参考。
[0009] 具体而言，本发明所述的测定方法将气-液界面暴露法和Annexin V/PI法联合起来对卷烟烟气导致的细胞凋亡进行测定；
[0010] 在进行所述气-液界面暴露法时，将细胞以0.8～1.2*106个/孔的
密度接种于插入式培养板；以流速为5～15mL/min的烟气对细胞进行染毒处理。
[0011] 作为优选，所述细胞的接种量为1.0*106个/孔，所述烟气的流速为10mL/min。
[0012] 为了进一步优化对烟气的检测，本发明对其他条件也进行了优化，得到如下条件：
[0013] 作为优选，在进行染毒处理时，烟气出口与细胞培养板通透膜的距离为1.4～1.6mm；优选为1.5mm。
[0014] 作为优选，设置不施加稀释空气的烟气暴露剂量为100％，通过调节所述的稀释空气的流速，依次稀释烟气得到不同的烟气暴露剂量。
[0015] 作为优选，本
申请还针对抽吸模式和烟气暴露剂量进行优化，抽吸模式为ISO 3308:2012抽吸模式或加拿大深度抽吸模式，优选为ISO 3308:2012抽吸模式；更优选当选择ISO 3308:2012抽吸模式时，暴露时间为0.8～1.2h；优选为1h。
[0016] 作为优选，所述细胞为小鼠单核巨噬细胞RAW264.7；进一步的，所述的细胞RAW264.7处于对数生长期。
[0017] 作为优选，所述插入式培养板为24mm插入式培养板(Transwell培养板)；
[0018] 优选在细胞培养时，下室加入1.8～2.2mL(优选2mL)生长培养液，上室加入1.4～1.6mL(优选1.5mL)生长培养液。
[0019] 作为优选，细胞接种后，培养24h再对其进行染毒处理。
[0020] 作为优选，染毒处理结束后，向所述的培养板上室中加入0.8～1.2mL
磷酸缓冲溶液，将细胞吹扫下来后转移至EP管中，离心去上清液；加入450～550μl Binding Buffer重悬细胞后，取出80～120μl混合溶液，加入4～6μl Annexin V-FITC避光4～6min后加入8～12μl PI和380～420μl磷酸缓冲液，混合后10min内上流式细胞仪检测。
[0021] 作为本发明的优选实施方式，本发明所述的测定方法包括如下步骤：
[0022] (1)配置实验
试剂：向DEME-H
基础培养液中加10％胎
牛血清，得生长培养液和暴露培养液；将KCl、KH2PO4、NaCl、Na2HPO4·12H2O混合后加入超纯
水定容，测定pH为7.0～7.4后高压灭菌，得磷酸缓冲溶液；
[0023] (2)细胞接种培养：选择处于对数生长期的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，以0.8～1.2*106个/孔的密度接种于24mm插入式培养板，向所述培养板的下室加入1.8～2.2mL生长培养液、上室加入1.4～1.6mL生长培养液，培养24h；
[0024] (3)卷烟全烟气染毒：所述细胞培养24h后，将细胞板移至暴露腔室；烟气出口与细胞培养板通透膜的距离为1.4～1.6mm；以流速为5～15mL/min的烟气对细胞进行染毒处理；选择ISO 3308:2012抽吸模式，暴露时间为0.5～1.5h；
[0025] (4)Annexin V/PI法检测细胞凋亡率：染毒处理结束后，向所述的培养板上室中加入0.8～1.2mL预冷好的磷酸缓冲溶液，将细胞吹扫下来后转移至EP管中，离心去上清液；加入450～550μl Binding Buffer重悬细胞后，取出80～120μl混合溶液，加入4～6μl Annexin V-FITC避光4～6min后加入8～12μl PI和380～420μl磷酸缓冲液，混合后10min内上流式细胞仪检测；利用流式细胞仪检测得到细胞凋亡率。
[0026] 本发明同时提供所述的测定方法在传统卷烟中的应用。
[0027] 本发明同时提供所述的测定方法在加热不燃烧卷烟中的应用。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 本发明的测定方法可实现加热不燃烧卷烟和传统卷烟中不同型号卷烟烟气的体外毒理学的评价；采用全烟气暴露染毒时，可进行不同暴露剂量的烟气染毒，并且每个暴露单元由平行三腔室组成，三平行实验使得结果更准确。
[0030] 本发明相比于
现有技术覆盖面更广，操作简单，结果更全面可靠。提出一种通用于检测加热不燃烧卷烟和传统卷烟全烟气对细胞凋亡影响的方法，作为卷烟烟气细胞毒性检测的补充方法，可以区分烟草制品对细胞
坏死和凋亡的影响。
具体实施方式
[0031] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032] 实施例中所涉及的仪器和装置如下：二
氧化
碳培养箱(SANYO公司，日本)、酶标仪(Bio-tek公司，美国)、气-液界面暴露系统(北京慧荣和科技有限公司，中国)、全自动吸烟机(北京慧荣和科技有限公司，中国)、全自动细胞计数仪(ThermoFish Scientific公司，美国)、倒置
显微镜(OLYMPUS公司，日本)、超净
工作台(苏州安泰空气技术有限公司，中国)、24mm插入式6孔培养板(Transwell培养板)(Corning公司，美国)。
[0033] 实施例中所涉及的试剂和材料如下：
[0034] 小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7(ATCC细胞库，美国)、DMEM-H基础培养液(GENVIEW公司，德国)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)(AusGeneX公司，澳大利亚)、3R4F卷烟(美国肯塔基大学参比卷烟，美国)、1mg卷烟(盒标1mg焦油的混合型卷烟，中国)、加热不燃烧卷烟(原味类型，购自日本)、台盼蓝(纯度≥99.0％，SIGMA-ALDRICH公司，美国)、二甲基亚砜(纯度≥99.0％，国药集团化学试剂有限公司，中国)、Annexin V-FITC/IP
试剂盒(四正柏生物科技有限公司，中国)。
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例提供一种气-液界面暴露下卷烟烟气诱导细胞凋亡的测定方法，具体对加热不燃烧卷烟烟气的细胞凋亡进行测定；具体如下：
[0037] (1)配置实验试剂：生长培养液(DEME-H基础培养液加10％FBS)，暴露培养液(DEME-H基础培养液加10％FBS，0.01M磷酸缓冲溶液(0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8g NaCl，2g Na2HPO4·12H2O，加超纯水至1L，测定pH为7.2，高压灭菌)；
[0038] (2)细胞接种培养：选择处于对数生长期的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，以1*106个/孔的密度接种于24mm插入式培养板(Transwell培养板)，其中下室加入2mL生长培养液，上室加入1.5mL生长培养液，培养24h。
[0039] (3)卷烟全烟气染毒：细胞培养24h后，将Transwell培养板移至暴露腔室，其中Transwell小室微孔膜上层为烟气环境，下层为暴露培养液，细胞处于气-液交界处；
[0040] 使用全自动吸烟机，采用ISO 3308:2012抽吸模式(35mL/60s/2s)对加热不燃烧卷烟进行抽吸，连续不断产生的烟气均匀输送至全烟气暴露单元中。暴露腔室中喇叭口与Transwell培养板通透膜距离为1.5mm。通过
负压泵和微流量
控制器，设置暴露腔室气体流速为10mL/min。设置不施加稀释空气的烟气暴露剂量为100％，通过调节稀释空气的流速，将烟气暴露剂量设定为10％、20％、40％、60％和80％，烟气暴露1h。每个暴露单元由平行三腔室组成，实现每个暴露剂量点的三平行实验。
[0041] (4)Annexin V/PI法检测细胞凋亡率：全烟气暴露结束后，将Transwell培养板上室从暴露单元中取出，加入1mL预冷(4℃)PBS，将细胞吹扫下来，转移至1.5mL EP管中，离心(600g，10min)，去上清液。加入500μl Binding Buffer重悬细胞后，取出100μl溶液，加入5μl Annexin V-FITC避光5min后加入10μl PI和400μl PBS，混合后10min内上流式细胞仪检测得到细胞凋亡情况，利用流式细胞仪检测得到细胞凋亡率(％)。
[0042] 加热不燃烧卷烟烟气的细胞凋亡率见表1；
[0043] 表1加热不燃烧卷烟烟气的细胞凋亡率(平均值±标准偏差)
[0044] 烟气暴露剂量 10％ 20％ 30％ 40％ 60％细胞凋亡率(％) 15.9±1.1 20.1±1.5 22.9±1.8 23.4±1.8 27.2±8.7
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例对1mg卷烟烟气的细胞凋亡进行测定，操作步骤同实施例1；随着染毒剂量增加，细胞凋亡率随之增加。
[0047] 1mg卷烟烟气的细胞凋亡率见表2；
[0048] 表2 1mg卷烟烟气的细胞凋亡率(平均值±标准偏差)
[0049] 烟气暴露剂量 10％ 20％ 30％ 40％ 60％细胞凋亡率(％) 1.9±0.4 11.7±2.2 23.6±1.4 34.2±1.4 76.5+1.1
[0050] 实施例3
[0051] 本实施例对3R4F卷烟烟气的细胞凋亡进行测定，操作步骤同实施例1；随着染毒剂量增加，细胞凋亡率随之增加，呈现出显著剂量-效应关系。
[0052] 3R4F卷烟烟气的细胞凋亡率见表3；
[0053] 表3 3R4F卷烟烟气的细胞凋亡率(平均值±标准偏差)
[0054] 烟气暴露剂量 10％ 20％ 30％ 40％ 60％细胞凋亡率(％) 2.4±2.8 14.2±3.2 73.1±3.1 86.3±2.9 97.9+1.4
[0055] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
