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一种 口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法

阅读：1034发布：2020-08-05

专利汇可以提供一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，该方法包括以下步骤：步骤1：口腔黏膜组织的获取；步骤2：口腔黏膜组织的处理；步骤3：上皮细胞的提取；步骤4：上皮细胞初代培养以及传代培养；步骤5：皮片的制备。本发明提供一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，通过该方法的设计，为人口腔黏膜上皮细胞的成功制备提供了参考依据，通过该方法制备的口腔黏膜上皮细胞皮片，具有生物活性，且与人口腔黏膜组织上皮切片具有相似的结构，通过该方法制备的口腔黏膜上皮细胞皮片，可直观的测试出口腔护理产品对于口腔黏膜的刺激性。，下面是一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤1：口腔黏膜组织的获取：使用高温高压灭菌后的取样器械，取志愿者口腔两侧的口腔黏膜组织，所述口腔黏膜组织的厚度为2～3mm，将所述口腔黏膜组织快速放入30mL组织保存液的样品放置离心管内，将所述样品放置离心管内置于4℃保温箱内冷藏保存；
步骤2：口腔黏膜组织的处理：使用经高温高压灭菌后的处理器械将口腔黏膜组织从样品放置离心管内夹出，放入含有30mL组织清洗液的第一离心管内，上下振荡清洗30秒，清洗三次，清洗完成后，将所述口腔黏膜组织夹至含30mL碘伏的第二离心管内，振荡清洗30秒，清洗完成后，将口腔黏膜组织夹至含30mL组织清洗液的100mm第一平皿内，使用镊子剪刀将多余的血管、脂肪、黏连组织清除干净，清洗后的口腔黏膜组织使用30mL组织清洗液翻洗三次；
步骤3：上皮细胞的提取：a1、将所述口腔黏膜组织，放入含有40mL组织分离液的离心管内，置于4℃保温箱内放置过夜；a2、将过夜后的口腔黏膜组织移入100mm平皿内，体视镜下，使用镊子将口腔黏膜组织的上皮组织和纤维组织剥离，剥离后的上皮组织放入含有30mL组织清洗液的100mm第二平皿内翻洗三次；a3、将翻洗后的上皮组织夹至含有40mL组织消化液的无菌塑料杯中，再将无菌塑料杯移至培养箱内进行孵育，孵育时间为40-60分钟；a4、将孵育后的上皮组织，使用100um的细胞过滤网进行过滤，滤液收集于50mL收集离心管内，对收集离心管内的滤液进行第一次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；a5、第一次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，吸取完成后，向所述收集离心管内加入50mL DPBS重悬细胞沉淀，进行第二次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间
5min；a6、第二次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，吸取完成后，向收集离心管内加入50mL上皮细胞培养基，重悬细胞沉淀，进行第三次离心，设定离心转速为
1800r/min，离心时间5min；a7、第三次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，加入10mL上皮细胞培养基重悬细胞，使用台盼蓝染色后，在显微镜下计数；
步骤4：上皮细胞初代培养以及传代培养：b1、将计数后的上皮细胞接种至T75培养瓶内，将T75培养瓶移入培养箱内进行初代培养，显微镜下观察细胞融合度至70-80％后，进行传代培养；b2、将T75培养瓶内的培养基吸除干净，加入10mL细胞清洗液清洗两次，清洗完成后，吸去细胞清洗液，加入2mL终浓度为0.05％的胰酶后，将T75培养瓶快速放入培养箱内孵育3分钟，孵育后显微镜下观察细胞已完全消化脱壁后，加入8mL上皮细胞培养基终止胰酶作用，吸净T75培养瓶内的细胞悬液至50mL离心管内，再使用10mL上皮细胞培养基对T75培养瓶清洗一遍，清洗的上皮细胞培养基混入细胞悬液中，离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；b3、离心完毕，吸去离心管的上清液，加入10mL上皮细胞培养基重悬细胞后，使用台盼蓝染色并计数；
步骤5：皮片的制备：将计数后的上皮细胞按照500uL细胞悬液/孔，5.0*10^4细胞/孔播种至预先使用matrix包被液处理1小时的12孔transwell小室内，持续培养两周后，完成口腔黏膜上皮细胞皮片的制备。
2.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述组织保存液为含有1X青链霉素双抗的DMEM/F-12溶液。
3.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述组织清洗液为含有1X青链霉素双抗的DPBS溶液。
4.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述组织分离液为含终浓度265U/mL的Ⅰ型胶原酶的DMEM/F12溶液。
5.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述组织消化液为含终浓度为2U/mL的Dispase酶的DMEM/F-12溶液。
6.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述上皮细胞培养基为含10％FBS、20ng/mL表皮生长因子、20ng/mL人重组胰岛素、20umol/mL的ROCK抑制剂Y27632、0.1％w/v氢化可的松、20ug/mL阿米卡星、8ug/mL庆大霉素的DMEM/F-12的培养基。
7.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述细胞清洗液为含0.02％EDTA的DPBS溶液。
8.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述matrix包被液为含matrix ge 5uL/mL浓度的DPBS溶液。
9.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，其特征在于：所述持续培养的培养流程为：c1、播种过程中，播种后的前两天，每天在显微镜下观察细胞贴壁状态；
c2、播种后的第三天开始，每隔两天吸去transwell小室和transwell小室底部的上皮细胞培养基，重新加入新鲜的上皮细胞培养基，其中上皮细胞培养基的添加量为：transwell小室内添加350uL、transwell小室底部添加750uL，持续三个循环；c3、播种后第九天，吸去transwell小室和transwell小室底部的上皮细胞培养基，在transwell小室底部加入500uL新鲜的上皮细胞培养基，transwell小室内不再加入新鲜培养基，每天更换transwell小室底部的上皮细胞培养基，继续培养5天后，完成口腔黏膜上皮细胞皮片的制备。

说明书全文

一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法。

背景技术

[0002] 人口腔黏膜上皮细胞皮片的制备对与体外评价口腔护理产品具有重要意义，然而，人口腔黏膜上皮细胞皮片的制备，存在人口腔黏膜上皮细胞制备困难、体外培养易受污染以及所需营养成分较为复杂等问题。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，通过该方法的设计，为人口腔黏膜上皮细胞的成功制备提供了参考依据，通过该方法制备的口腔黏膜上皮细胞皮片，具有生物活性，且与人口腔黏膜组织上皮切片具有相似的结构，通过该方法制备的口腔黏膜上皮细胞皮片，可直观的测试出口腔护理产品对于口腔黏膜的刺激性。

[0004] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

[0005] 一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，该方法包括以下步骤：

[0006] 步骤1：口腔黏膜组织的获取：使用高温高压灭菌后的取样器械，取志愿者口腔两侧的口腔黏膜组织，所述口腔黏膜组织的厚度为2～3mm，将所述口腔黏膜组织快速放入30mL组织保存液的样品放置离心管内，将所述样品放置离心管内置于4℃保温箱内冷藏保存；

[0007] 步骤2：口腔黏膜组织的处理：使用经高温高压灭菌后的处理器械将口腔黏膜组织从样品放置离心管内夹出，放入含有30mL组织清洗液的第一离心管内，上下振荡清洗30秒，清洗三次，清洗完成后，将所述口腔黏膜组织夹至含30mL碘伏的第二离心管内，振荡清洗30秒，清洗完成后，将口腔黏膜组织夹至含30mL组织清洗液的100mm第一平皿内，使用镊子剪刀将多余的血管、脂肪、黏连组织清除干净，清洗后的口腔黏膜组织使用30mL组织清洗液翻洗三次；

[0008] 步骤3：上皮细胞的提取：a1、将所述口腔黏膜组织，放入含有40mL组织分离液的离心管内，置于4℃保温箱内放置过夜；a2、将过夜后的口腔黏膜组织移入100mm平皿内，体视镜下，使用镊子将口腔黏膜组织的上皮组织和纤维组织剥离，剥离后的上皮组织放入含有30mL组织清洗液的100mm第二平皿内翻洗三次；a3、将翻洗后的上皮组织夹至含有40mL组织消化液的无菌塑料杯中，再将无菌塑料杯移至培养箱内进行孵育，孵育时间为40-60分钟；
a4、将孵育后的上皮组织，使用100um的细胞过滤网进行过滤，滤液收集于50mL收集离心管内，对收集离心管内的滤液进行第一次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；
a5、第一次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，吸取完成后，向所述收集离心管内加入50mL DPBS重悬细胞沉淀，进行第二次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；a6、第二次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，吸取完成后，向收集离心管内加入50mL上皮细胞培养基，重悬细胞沉淀，进行第三次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；a7、第三次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，加入10mL上皮细胞培养基重悬细胞，使用台盼蓝染色后，在显微镜下计数；

[0009] 步骤4：上皮细胞初代培养以及传代培养：b1、将计数后的上皮细胞接种至T75培养瓶内，将T75培养瓶移入培养箱内进行初代培养，显微镜下观察细胞融合度至70-80％后，进行传代培养；b2、将T75培养瓶内的培养基吸除干净，加入10mL细胞清洗液清洗两次，清洗完成后，吸去细胞清洗液，加入2mL终浓度为0.05％的胰酶后，将T75培养瓶快速放入培养箱内孵育3分钟，孵育后显微镜下观察细胞已完全消化脱壁后，加入8mL上皮细胞培养基终止胰酶作用，吸净T75培养瓶内的细胞悬液至50mL离心管内，再使用10mL上皮细胞培养基对T75培养瓶清洗一遍，清洗的上皮细胞培养基混入细胞悬液中，离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；b3、离心完毕，吸去离心管的上清液，加入10mL上皮细胞培养基重悬细胞后，使用台盼蓝染色并计数；

[0010] 步骤5：皮片的制备：将计数后的上皮细胞按照500uL细胞悬液/孔，5.0*10^4细胞/孔播种至预先使用matrix包被液处理1小时的12孔transwell小室内，持续培养两周后，完成口腔黏膜上皮细胞皮片的制备。

[0011] 进一步地，所述组织保存液为含有1X青链霉素双抗的DMEM/F-12溶液。

[0012] 进一步地，所述组织清洗液为含有1X青链霉素双抗的DPBS溶液。

[0013] 进一步地，所述组织分离液为含终浓度265U/mL的Ⅰ型胶原酶的DMEM/F12溶液。

[0014] 进一步地，所述组织消化液为含终浓度为2U/mL的Dispase酶的DMEM/F-12溶液。

[0015] 进一步地，所述上皮细胞培养基为含10％FBS、20ng/mL表皮生长因子、20ng/mL人重组胰岛素、20umol/mL的ROCK抑制剂Y27632、0.1％w/v氢化可的松、20ug/mL阿米卡星、8ug/mL庆大霉素的DMEM/F-12的培养基。

[0016] 进一步地，所述细胞清洗液为含0.02％EDTA的DPBS溶液。

[0017] 进一步地，所述matrix包被液为含matrix ge 5uL/mL浓度的DPBS溶液。

[0018] 进一步地，所述持续培养的培养流程为：c1、播种过程中，播种后的前两天，每天在显微镜下观察细胞贴壁状态；c2、播种后的第三天开始，每隔两天吸去transwell小室和transwell小室底部的上皮细胞培养基，重新加入新鲜的上皮细胞培养基，其中上皮细胞培养基的添加量为：transwell小室内添加350uL、transwell小室底部添加750uL，持续三个循环；c3、播种后第九天，吸去transwell小室和transwell小室底部的上皮细胞培养基，在transwell小室底部加入500uL新鲜的上皮细胞培养基，transwell小室内不再加入新鲜培养基，每天更换transwell小室底部的上皮细胞培养基，继续培养5天后，完成口腔黏膜上皮细胞皮片的制备。

[0019] 本发明的有益效果是：

[0020] 本发明提供一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，通过该方法的设计，为人口腔黏膜上皮细胞的成功制备提供了参考依据，通过该方法制备的口腔黏膜上皮细胞皮片，具有生物活性，且与人口腔黏膜组织上皮切片具有相似的结构，通过该方法制备的口腔黏膜上皮细胞皮片，可直观的测试出口腔护理产品对于口腔黏膜的刺激性。附图说明

[0021] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

[0022] 图1是本发明提供的口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法流程图；

[0023] 图2是本发明提供的操作样品1的石蜡切片HE染色照片；

[0024] 图3是本发明提供的操作样品2的石蜡切片HE染色照片；

[0025] 图4是本发明提供的操作样品3的石蜡切片HE染色照片；

[0026] 图5是本发明提供的人口腔黏膜组织上皮切片照片；

[0027] 图6是本发明提供的测试物OD450 波长值柱状图。

具体实施方式

[0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029] 实施例1

[0030] 如图1所示，本实施例提供一种口腔黏膜上皮细胞皮片制备方法，该方法包括以下步骤：

[0031] 步骤1：口腔黏膜组织的获取

[0032] 使用高温高压灭菌后的取样器械，取志愿者口腔两侧的口腔黏膜组织，所述口腔黏膜组织的厚度为2～3mm，将所述口腔黏膜组织快速放入30mL组织保存液的样品放置离心管内，将所述样品放置离心管内置于4℃保温箱内冷藏保存；

[0033] 步骤2：口腔黏膜组织的处理

[0034] 使用经高温高压灭菌后的处理器械将口腔黏膜组织从所述样品放置离心管内夹出，放入含有30mL组织清洗液的第一离心管内，上下振荡清洗30秒，清洗三次，清洗完成后，将所述口腔黏膜组织夹至含30mL碘伏的第二离心管内，振荡清洗30秒，清洗完成后，将口腔黏膜组织夹至含30mL组织清洗液的100mm第一平皿内，使用镊子剪刀将多余的血管，脂肪、黏连组织清除干净，清洗后的口腔黏膜组织使用30mL组织清洗液翻洗三次；

[0035] 步骤3：上皮细胞的提取

[0036] a1、将所述口腔黏膜组织，放入含有40mL组织分离液的离心管内，置于4℃保温箱内放置过夜；

[0037] a2、将过夜后的口腔黏膜组织移入100mm平皿内，体视镜下，使用镊子将口腔黏膜组织的上皮组织和纤维组织剥离，剥离后的上皮组织放入含有30mL组织清洗液的100mm第二平皿内翻洗三次；

[0038] a3、将翻洗后的所述上皮组织夹至含有40mL组织消化液的无菌塑料杯中，加入磁力搅拌子，盖紧无菌塑料杯的盖子，将无菌塑料杯放入温度为37℃、含有5％二氧化碳浓度及饱和湿度的培养箱内进行孵育，孵育40-60分钟；

[0039] a4、将孵育后的所述上皮组织，使用100um的细胞过滤网进行过滤，滤液收集于50mL收集离心管内，对收集离心管内的滤液进行第一次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；

[0040] a5、第一次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，吸取完成后，向所述收集离心管内加入50mL DPBS重悬细胞沉淀，进行第二次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；

[0041] a6、第二次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，吸取完成后，向多数收集离心管内加入50mL上皮细胞培养基，重悬细胞沉淀，进行第三次离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；

[0042] a7、第三次离心完成后，使用电动移液器吸取收集离心管内的上清液，加入10mL上皮细胞培养基重悬细胞，使用台盼蓝染色后，在显微镜下计数；

[0043] 步骤4：上皮细胞初代培养以及传代培养

[0044] b1、将计数后的上皮细胞按3.0*10^5细胞/瓶接种至处理过的T75培养瓶内，所述T75培养瓶预先使用matrix包被液包被1小时；

[0045] b2、将T75培养瓶移入温度为37℃、含有5％二氧化碳浓度及饱和湿度的培养箱内进行初代培养，前3-5天，根据细胞的贴壁情况决定是否更换培养基，第一次换液后，每两天一次更换新鲜培养基15mL，直至显微镜下观察细胞融合度至70-80％后，进行传代培养；

[0046] b3、将T75培养瓶内的培养基吸除干净，加入10mL细胞清洗液清洗两次，清洗完成后，吸去细胞清洗液，加入2mL终浓度为0.05％的胰酶后，将T75培养瓶快速放入温度为37℃、含有5％二氧化碳浓度及饱和湿度的培养箱内孵育3分钟，孵育后显微镜下观察细胞已完全消化脱壁后，加入8mL上皮细胞培养基终止胰酶作用，吸净T75培养瓶内的细胞悬液至50mL离心管内，再使用10mL上皮细胞培养基对T75培养瓶清洗一遍，清洗的上皮细胞培养基混入细胞悬液中，离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间5min；

[0047] b4、离心完毕，吸去离心管内的上清液，加入10mL上皮细胞培养基重悬细胞后，使用台盼蓝染色并计数；

[0048] 步骤5：皮片的制备

[0049] c1、将计数后的上皮细胞按照500uL细胞悬液/孔，5.0*10^4细胞/孔播种至预先使用matrix包被液处理1小时的12孔transwell小室内；

[0050] c2、播种过程中，播种后的前两天，每天在显微镜下观察细胞贴壁状态；

[0051] c3、播种后的第三天开始，每隔两天吸去transwell小室和transwell小室底部的上皮细胞培养基，重新加入新鲜的上皮细胞培养基，其中上皮细胞培养基的添加量为：transwell小室内添加350uL、transwell小室底部添加750uL，持续三个循环；

[0052] c4、播种后第九天，吸去transwell小室和transwell小室底部的上皮细胞培养基，在transwell小室底部加入500uL新鲜的上皮细胞培养基，transwell小室内不再加入新鲜培养基，每天更换transwell小室底部的上皮细胞培养基，继续培养5天后，完成口腔黏膜上皮细胞皮片的制备；

[0053] 本实施例中，组织保存液为含有1X青链霉素双抗的DMEM/F-12溶液；组织清洗液为含有1X青链霉素双抗的DPBS溶液；组织分离液为含终浓度265U/mL的Ⅰ型胶原酶的DMEM/F12溶液；组织消化液为含终浓度为2U/mL的Dispase酶的DMEM/F-12溶液；上皮细胞培养基为含10％FBS、20ng/mL表皮生长因子、20ng/mL人重组胰岛素、20umol/mL的ROCK抑制剂Y27632、
0.1％w/v氢化可的松、20ug/mL阿米卡星、8ug/mL庆大霉素的DMEM/F-12的培养基；matrix包被液为含matrix ge 5uL/mL浓度的DPBS溶液；细胞清洗液为含0.02％EDTA的DPBS溶液。

[0054] 实施例2

[0055] 本发明中口腔黏膜上皮细胞皮片的质量检测

[0056] 1、细胞活率检测

[0057] 操作步骤：A1、在制备的口腔黏膜上皮细胞皮片中，随机选取3个样孔，标号样品1、样品2、样品3，用手术刀片连带transwell小室底部的支撑结构一并环形割下，用灭菌后的镊子将口腔黏膜上皮细胞皮片与支撑结构分开，分别放入60mm平皿内，加入2mL终浓度为0.05％的胰酶后，盖上平皿盖子，放入温度为37℃、含有5％二氧化碳浓度及饱和湿度的培养箱内进行孵育，孵育时间30min，孵育完成后，向平皿内加入8mL上皮细胞培养基中止胰酶消化作用，吸取平皿内的细胞悬液至50mL离心管内，进行离心，设定离心转速为1800r/min，离心时间为5min；

[0058] A2、离心完成后，吸去上清液，加入10mL上皮细胞培养基重悬细胞沉淀，充分混匀后，移液枪吸出10uL细胞悬液与台盼蓝10uL 1:1染色后计数活细胞数及死细胞数，计算皮片细胞活率，结果如下表1：

[0059] 表1口腔黏膜上皮细胞皮片细胞活率检测

[0060]

[0061] 由表1的结果可知，用此制备方法制备的口腔黏膜上皮细胞皮片具备生物活性。

[0062] 2、组织结构实验

[0063] 操作步骤：B1、在制备的口腔黏膜上皮细胞皮片中，随机选取3个样孔，标号操作样品1、操作样品2和操作样品3，用手术刀片连带transwell小室底部的支撑结构一并环形割下，分别放入60mm平面内，注意保持皮片正面朝上，使用DPBS缓慢滴注清洗口腔黏膜上皮细胞皮片3次，每次5mL，清洗干净的皮片，使用4％多聚甲醛进行固定30分钟，固定完毕后，再次滴注清洗3次，每次5mL；

[0064] B2、完成固定及清洗的口腔黏膜上皮细胞皮片，用包埋纸小心包被好后放入自动脱水机内过夜脱水处理；

[0065] B3、脱水后的口腔黏膜上皮细胞皮片于石蜡包埋机下进行包埋处理，完成后放入-80℃冰箱内冷冻半小时；

[0066] B4、垂直切片机下，设定好切片厚度为5mm，对口腔黏膜上皮细胞皮片进行切片，获得组织切片；

[0067] B5、脱蜡后，HE染色，显微镜下拍照分别获得操作样品1的石蜡切片HE染色照片(图2)、操作样品2的石蜡切片HE染色照片(图3)以及操作样品3的石蜡切片HE染色照片(图4)，图5为人口腔黏膜组织上皮切片照片；

[0068] 切片结果表明，体外制备的口腔黏膜上皮细胞皮片，具备与人口腔黏膜组织上皮切片相似的结构。

[0069] 实施例3

[0070] 本发明中口腔黏膜上皮细胞皮片在口腔护理产品的体外评价实验

[0071] 1、口腔护理产品的刺激性评价实验

[0072] (1)口腔黏膜上皮细胞皮片准备：准备好已完成制备的口腔黏膜上皮细胞皮片18孔，在底部加入500uL培养基，transwell内加入200uL培养基，放入饱和湿度，37℃，5％二氧化碳浓度的培养箱内进行孵育，孵育时间4小时，模拟口腔湿润环境；

[0073] (2)测试物准备：阳性测试物为乙酸甲酯，阴性测试物为灭菌超纯水，样品组为漱口水A、漱口水B、成人牙膏、儿童牙膏，漱口水经0.22um过滤膜过滤后使用，牙膏使用超纯水1:1w/v稀释混匀后经0.22um过滤膜过滤后使用；

[0074] (3)测试物的暴露测试：每种测试物准备3孔皮片样本，孵育完毕后，先吸去transwell表层的培养基，用DPBS将皮片样本表面柔和地清洗干净，然后在每孔样本上加入相应测试物200ul，放入饱和湿度，37℃，5％二氧化碳浓度的培养箱内进行孵育，孵育时间18小时；

[0075] (4)暴露测试完成后，再次使用DPBS进行清洗，清洗完成后，每孔加入500uL含50uL CCK8的培养基，放入温度为37℃、含有5％二氧化碳浓度及饱和湿度的培养箱内进行孵育，孵育时间24小时；

[0076] (5)吸光值检测：孵育完成后，根据测试物的顺序在96孔板内加入100uL培养基，然后放入酶标仪内检测OD450波长值，测试结果如下表2，测试结果的柱状图见图6：

[0077] 表2测试物OD450波长值

[0078]测试物超纯水乙酸甲酯漱口水A 漱口水B 成人牙膏儿童牙膏
1 2.052 0.733 1.625 1.434 1.183 1.467
2 1.95 0.658 1.498 1.176 1.262 1.336
3 1.866 0.816 1.767 1.245 1.31 1.265
平均 1.956 0.736 1.630 1.285 1.252 1.356

[0079] 依据结果表明：体外制备的口腔黏膜上皮细胞皮片可以直观的测试出口腔护理产品对于口腔黏膜的刺激性。

[0080] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0081] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

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