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一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料及其制备方法

阅读：1发布：2020-12-31

专利汇可以提供一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，通过以下步骤制备而成：（1）将PVA 水溶液加热，添加交联剂发生交联反应，将pH值调节至中性，制得PVA水凝胶；（2）取5-氟尿嘧啶与PLGA溶解于有机溶剂中，然后缓慢滴加至含有乳化剂的液体石蜡中，恒温加热搅拌乳化，得到乳液；（3）向步骤（2）所述的乳液中加石油醚至乳液全部形成沉淀，离心得到微球；（4）使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；（5）将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。该材料具有与自然玻璃体相接近的性能，为增生性玻璃体视网膜病变患者提供了理想的治疗方式。，下面是一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，其特征在于，通过以下步骤制备而成：
（1）将PVA水溶液加热，添加交联剂发生交联反应，将pH值调节至中性，制得PVA水凝胶；
（2）取5-氟尿嘧啶与PLGA溶解于有机溶剂中，然后缓慢滴加至含有乳化剂的液体石蜡中，恒温加热搅拌乳化，得到乳液；
（3）向步骤（2）所述的乳液中加大量石油醚至乳液全部形成沉淀，离心分离得到微球；
（4）使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；
（5）将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。
2.根据权利要求1所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，其特征在于，步骤（1）所述的交联剂为β-甘油磷酸钠或壳聚糖的醋酸水溶液，其质量分数为1.5～
2.5%；PVA水溶液与交联剂混合的比例为1:1～1:1.5，PVA水溶液的质量分数为1～7%；加热温度为80～90℃。
3.根据权利要求2所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，其特征在于，步骤（1）所述的交联剂的质量分数为2%；所述PVA水溶液的质量分数为3%。
4.根据权利要求1所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，其特征在于，步骤（2）中5-氟尿嘧啶与PLGA的混合比例为1:9～1:10；所述的有机溶剂为乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、DMF中的一种或多种；所述的乳化剂为司盘80。
5.根据权利要求4所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，其特征在于，步骤（2）所述的有机溶剂为乙腈/DMF复合溶剂；步骤（2）恒温加热的温度为50～60℃，搅拌速度为1500～2000rpm；步骤（5）的加热温度为36～38℃。
6.一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将PVA水溶液加热，添加交联剂发生交联反应，将pH值调节至中性，制得PVA水凝胶；
（2）取5-氟尿嘧啶与PLGA溶解于有机溶剂中，然后缓慢滴加至含有乳化剂的液体石蜡中，恒温加热搅拌乳化，得到乳液；
（3）向步骤（2）所述的乳液中加大量石油醚至乳液全部形成沉淀，离心分离得到微球；
（4）使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；
（5）将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。
7.根据权利要求6所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的交联剂为β-甘油磷酸钠或壳聚糖的醋酸水溶液，其质量分数为1.5～2.5%；PVA水溶液与交联剂混合的比例为1:1～1:1.5，PVA水溶液的质量分数为1～7%；加热温度为80～90℃。
8.根据权利要求7所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的交联剂的质量分数为2%；所述PVA水溶液的质量分数为3%。
9.根据权利要求6所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中5-氟尿嘧啶与PLGA的混合比例为1:9～1:10；所述的有机溶剂为乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、DMF中的一种或多种；所述的乳化剂为司盘80。
10.根据权利要求9所述的适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，其特征在于，步骤（2）所述的有机溶剂为乙腈/DMF复合溶剂；步骤（2）恒温加热的温度为50～60℃，搅拌速度为1500～2000rpm；步骤（5）的加热温度为36～38℃。

说明书全文

一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料及其

制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料及其制备方法。

背景技术

[0002] 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是常见的致盲性眼病，常发生于眼外伤、孔源性视网膜脱离和严重糖尿病性视网膜病变等患者。

[0003] 目前玻璃体切割手术是治疗PVR的主要手段，术中切除自然玻璃体后必须选择合适的人工玻璃体替代物填充玻璃体腔，以修复眼损伤，维持视网膜的支撑，使视网膜色素上皮与神经上皮贴附，重建视功能，并防止眼球萎缩。

[0004] 人工玻璃体是眼科领域最有趣且最有挑战性的研究领域，在进行玻璃体切割术治疗后选择合适的人工玻璃体替代物填充玻璃体腔可维持眼球体积和眼内压力，恢复神经视网膜层与视网膜色素上皮层的解剖位置，重建视功能，防止眼球的萎缩。

[0005] 理想的人工玻璃体不仅要求能恢复自然玻璃体的结构，同时还需要能模拟自然玻璃体的功能；此外，由于PVR疾病的复杂性，术后通常需联合玻璃体腔注射抗炎抗增殖药物的治疗以降低复发率，然而至今仍未研发出一种具有良好生物相容性，使得术后无严重并发症，并能长期填充的理想人工玻璃体。

[0006] 目前，在临床上多使用医用硅油作为PVR术后的主要玻璃体替代物，然而硅油作为玻璃体替代物有许多缺点，如继发性青光眼、白内障形成、远视移位、油乳化、角膜病变，并且在无效的填充物情况下，下视网膜破裂。这都促使研究人员研发更适合于玻璃体腔的替代物。随着硅油眼患者数量的逐渐增加，临床上对于新型玻璃体替代物的需求越来越高。

[0007] 水凝胶因具有良好的光学性能，良好生物相容性，减震性和流变性能，能良好模拟自然玻璃体的特性，被誉为是人工玻璃体最理想的材料。按照物质的种类分类，水凝胶主要有聚乙烯醇【poly(vinyl alcohol)，PVA】、聚乙二醇【poly(ethylene glycol)，PEG】、聚丙烯酸【poly(acrylic acid)，PAA】、聚丙烯酰胺【poly(acrylamide)，PAM】、聚乙烯吡咯烷酮【poly(1-vinyl-2-pyrrolidone)，PVP】、聚丙三基丙烯酸酯【poly(glyceryl methacrylate)，PGMA】、聚乙烯醇丙烯酸酯【polyvinylalcohol methacrylate，PVA-MA】、聚甲基-2-丙烯酸酯-2-乙酸乙酯【poly(methyl-2-acrylamido-2-methoxyacetate)】等等。目前此类水凝胶主要是首先通过体外交联得到后，接着通过注射针头注射入玻璃体腔，其存在以下缺陷：在注射过程中会破坏水凝胶结构而形成聚合物碎段，进而导致水凝胶机械性能的下降；而且聚合物碎段的形成会加快水凝胶的降解吸收，减少眼内的填充时间。

[0008] 因此，一种新型的水凝胶开始被研究，其具有在特定的条件刺激下(如pH值、温度、光能、或者压力的改变)或依据眼内的生物条件而原位形成凝胶的特性。此类水凝胶被称作为“智能水凝胶”。这种水凝胶可以避免因注射过程导致的结构破坏，同时扩展应用于更多的功能如构建药物缓释系统。另一方面，目前研究表明只有水凝胶可以有效地结合药物，提高PVR手术的治疗效果，而惰性气体、硅油、重硅油、过氟化碳液体(重水)等均不能与药物结合。但是，如要更好地治疗患者，此类水凝胶在眼内填充长期安全性和有效性仍需进一步提高。

[0009] 目前的研究发现，通过体外交联获得与自然玻璃体性能相似的PVA水凝胶，并将其注入体内进行长达半年的实验观察发现：3％PVA水凝胶拥有良好的光学物理性能、视网膜支撑功能和生物相容性；但是不能避免注入过程中所导致的水凝胶结构破坏，以及长期填充后的水凝胶降解吸收的问题。

发明内容

[0010] 本发明的第一个目的在于提供一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，该材料具有与自然玻璃体相接近的性能，为增生性玻璃体视网膜病变患者提供了理想的治疗方式。

[0011] 本发明的第二个目的在于提供所述材料的制备方法。

[0012] 本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：

[0013] 一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料，通过以下步骤制备而成：

[0014] (1)将PVA水溶液加热，添加交联剂发生交联反应，将pH值调节至中性，制得PVA水凝胶；

[0015] (2)取5-氟尿嘧啶与PLGA溶解于有机溶剂中，然后缓慢滴加至含有乳化剂的液体石蜡中，恒温加热搅拌乳化，得到乳液；

[0016] (3)向步骤(2)所述的乳液中加大量石油醚至乳液全部形成沉淀，离心分离得到微球；

[0017] (4)使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；

[0018] (5)将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。

[0019] 本发明所述的PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

[0020] 本发明首先通过PVA水溶液配以适当的交联剂，交联并筛选出与自然玻璃体性能最为接近的温敏型PVA水凝胶，该水凝胶在低温状态下保持溶胶状态，当温度升高时形成凝胶状态，非常适于作为玻璃体填充物的基体，PVA的化学结构为：

[0021]

[0022] 另一方面，PVR的特征是形成含有肌成纤维细胞的瘢痕状纤维组织，这些肌成纤维细胞来源于转分化的视网膜色素上皮(RPE)细胞和其他类型的细胞，如进入玻璃体腔的胶质细胞，以及诱导玻璃体腔内的细胞膜在分离的视网膜表面上的收缩。临床实验证明5-氟尿嘧啶可有效抑制RPE细胞的再生，降低孔源性视网膜脱离复位手术后纤维增殖膜收缩牵拉作用。但目前5-氟尿嘧啶应用于PVA患者治疗时，需要多次注射给药，给患者的心理和生理有着二次伤害；

[0023] 本发明以PLGA为载体，制备5-氟尿嘧啶PLGA微球，并将5-氟尿嘧啶PLGA微球和液态PVA水凝胶混合后注入PVR患者眼内，进行原位交联，变成凝胶状态。在注入患者眼内后，原在5-氟尿嘧啶PLGA微球上5-氟尿嘧啶药物会逐渐缓释出来，为患者带来治疗。经实验证明，该玻璃体替代材料的支撑效果、眼内毒性、药代动力学、水凝胶降解以及PVR治疗效果良好，是治疗玻璃体视网膜疾病的理想材料。

[0024] 优选地，步骤(1)所述的交联剂为β-甘油磷酸钠或壳聚糖的醋酸水溶液，其质量分数为1.5～2.5％，优选为2％。通过上述交联剂使PVA水溶液发生交联反应后得到的PVA水凝胶性能与自然玻璃体最为接近。壳聚糖的化学结构为：

[0025]

[0026] 步骤(1)PVA水溶液与交联剂混合的比例为1:1～1:1.5，PVA水溶液的质量分数为1～7％，优选为3％；加热温度为80～90℃。优选地，步骤(1)中还可以加入交联催化剂，所述的交联催化剂为氯化钙溶液。

[0027] 优选地，步骤(2)中5-氟尿嘧啶与PLGA的混合比例为1:9～1:10。

[0028] 步骤(2)所述的有机溶剂可以为乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、DMF中的一种或多种。经实验发现，上述有机溶剂对载体材料PLGA的溶解度良好，经进一步实验后发现，所述的有机溶剂优选为乙腈/DMF复合溶剂，该复合溶剂有利于后续的乳化过程。所述的乳化剂优选为司盘80。

[0029] 优选地，步骤(2)恒温加热的温度为50～60℃，搅拌速度为1500～2000rpm。

[0030] 优选地，步骤(5)的加热温度为36～38℃。

[0031] 本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：

[0032] 一种适用于增生性玻璃体视网膜病变的玻璃体替代材料的制备方法，包括以下步骤：

[0033] (1)将PVA水溶液加热，添加交联剂发生交联反应，将pH值调节至中性，制得PVA水凝胶；

[0034] (2)取5-氟尿嘧啶与PLGA溶解于有机溶剂中，然后缓慢滴加至含有乳化剂的液体石蜡中，恒温加热搅拌乳化，得到乳液；

[0035] (3)向步骤(2)所述的乳液中加大量石油醚至乳液全部形成沉淀，离心分离得到微球；

[0036] (4)使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；

[0037] (5)将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。

[0038] 优选地，步骤(1)所述的交联剂为β-甘油磷酸钠或壳聚糖的醋酸水溶液，其质量分数为1.5～2.5％，优选为2％。

[0039] 优选地，步骤(1)PVA水溶液与交联剂混合的比例为1:1～1:1.5，PVA水溶液的质量分数为1～7％，优选为3％；加热温度为80～90℃。优选地，步骤(1)中还可以加入交联催化剂，所述的交联催化剂为氯化钙溶液。

[0040] 优选地，步骤(2)中5-氟尿嘧啶与PLGA的混合比例为1:9～1:10。

[0041] 步骤(2)所述的有机溶剂可以为乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、DMF中的一种或多种，优选为乙腈/DMF复合溶剂；所述的乳化剂优选为司盘80。

[0042] 优选地，步骤(2)恒温加热的温度为50～60℃，搅拌速度为1500～2000rpm。

[0043] 优选地，步骤(5)的加热温度为36～38℃。

[0044] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0045] 1.本发明制备的PVA水凝胶为温敏型水凝胶，在低温状态下保持溶胶状态，当温度升高时形成凝胶状态，非常适于作为玻璃体填充物的基体；

[0046] 2.本发明以PLGA为载体制备的5-氟尿嘧啶微球与PVA水凝胶的相容性很好，在手术过程中一次性共同注射入患者眼内，解决了治疗过程中需要反复注射药物的问题，减轻患者治疗的痛苦；

[0047] 3.本发明将PVA水凝胶与5-氟尿嘧啶微球结合在一起，制得的玻璃体替代材料解决了水凝胶在注射过程中形成聚合物碎段的问题，同时生物亲和性强，在人体内可以长期稳定存在，是治疗PVR患者的理想材料。附图说明

[0048] 以下通过附图对本发明作进一步的说明。

[0049] 图1玻璃体替代材料的微观电镜图。

[0050] 图2、图3流变性能、粘度检测结果图。

[0051] 图4蠕变性能检测结果图。

[0052] 图5体外药物累积释放度检测结果图。

[0053] 图6细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

[0054] 以下通过具体的实施例对本发明作进一步的说明。

[0055] 以下实施例中所使用的试剂：

[0056] 聚乙烯醇(PVA)：(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)，未进一步纯化直接使用；壳聚糖(CS)：生化试剂，脱乙酰度：80.0～95.0％,国药集团化学试剂有限公司；醋酸水溶液：浓度0.1mol/L。

[0057] 实施例1

[0058] (1)将7％PVA水溶液加热至80℃使其完全溶解，取β-甘油磷酸钠溶解于醋酸水溶液中制成2.5％β-甘油磷酸钠溶液，溶解完全后过滤除杂，然后按照1:1.5的比例将PVA水溶液和β-甘油磷酸钠溶液混合，缓慢降温至室温并滴加2％的氯化钙溶液至体积变为原体积的1.5倍，使之发生交联反应，使用磷酸氢二钠饱和溶液将pH值调节7.21，形成凝胶后在蒸馏水中透析48小时，以除去非交联PVA的残余物，制得PVA水凝胶；

[0059] (2)按1:10的比例将5-氟尿嘧啶与PLGA混合并溶解于二氯甲烷中，然后缓慢滴加至含有司盘80的液体石蜡中，在60℃下恒温加热，以1800rpm速度搅拌乳化1h，得到乳液；

[0060] (3)向步骤(2)所述的乳液中加大量石油醚至乳液全部形成沉淀，离心分离得到微球；

[0061] (4)使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；

[0062] (5)将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在36℃的加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。

[0063] 实施例2

[0064] (1)将1％PVA水溶液加热至80℃使其完全溶解，取壳聚糖溶解于醋酸水溶液中制成2.5％壳聚糖溶液，溶解完全后过滤除杂，然后按照1:1.2的比例将PVA水溶液和壳聚糖溶液混合，缓慢降温至室温并滴加2％的氯化钙溶液至体积变为原体积的1.5倍，使之发生交联反应，使用磷酸氢二钠饱和溶液将pH值调节7.08，形成凝胶后在蒸馏水中透析48小时，以除去非交联PVA的残余物，制得PVA水凝胶；

[0065] (2)按1:9的比例将5-氟尿嘧啶与PLGA混合并溶解于丙酮中，然后缓慢滴加至含有司盘80的液体石蜡中，在55℃下恒温加热，以2000rpm速度搅拌乳化1h，得到乳液；

[0066] (3)向步骤(2)所述的乳液中加大量石油醚至乳液全部形成沉淀，离心分离得到微球；

[0067] (4)使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；

[0068] (5)将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在38℃的加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。

[0069] 实施例3

[0070] (1)将3％PVA水溶液加热至80℃使其完全溶解，取壳聚糖溶解于醋酸水溶液中制成2％壳聚糖溶液，溶解完全后过滤除杂，然后按照1:1的比例将PVA水溶液和壳聚糖溶液混合，缓慢降温至室温并滴加2％的氯化钙溶液至体积变为原体积的1.5倍，使之发生交联反应，使用磷酸氢二钠饱和溶液将pH值调节7.14，形成凝胶后在蒸馏水中透析48小时，以除去非交联PVA的残余物，制得PVA水凝胶；

[0071] (2)按1:9的比例将5-氟尿嘧啶与PLGA混合并溶解于乙腈/DMF复合溶剂中，然后缓慢滴加至含有司盘80的液体石蜡中，在50℃下恒温加热，以1500rpm速度搅拌乳化1h，得到乳液；

[0072] (3)向步骤(2)所述的乳液中加大量石油醚至乳液全部形成沉淀，离心分离得到微球；

[0073] (4)使用石油醚离心洗涤微球，干燥后得到5-氟尿嘧啶微球；

[0074] (5)将所述的PVA水凝胶和5-氟尿嘧啶微球在37℃加热条件下混合并搅拌，得到玻璃体替代材料。

[0075] 实施例3所述的玻璃体替代材料性能的测定结果：

[0076] 1.微观结构

[0077] 如图1所示为玻璃体替代材料的电镜图，从图中可见，制得的玻璃体替代材料是一种三维结构的颗粒聚合物，该结构具有一定的支撑硬度，内部空间允许5-氟尿嘧啶微球附着并释放5-氟尿嘧啶。

[0078] 2.流变性能

[0079] 采用型号为DHR-2的旋转流变仪(美国TA公司生产)，按照检测标准GB/T 33095.1-2016对玻璃体替代材料进行检测，在温度37±0.5℃，湿度50±10％RH的条件下，对样品进行振幅扫描，测量水凝胶的凝胶化、机械性能和交联动力学，并根据振荡剪切应力的频率对PVA水凝胶的储能模量和损耗模量(弹性模量)进行分析。

[0080] 使用流变优势仪器控制软件连续记录存储和损耗模数值，弹性和粘性的相对贡献可以通过损耗因子(tanδ)来量化，该损耗切线是损耗与存储模量的比率：损耗因子越高，代表样品更偏向于粘性，更像液体；损耗因子越低，代表样品更偏向于弹性，更像胶体。

[0081] 如图2所示，振荡剪切的检测结果显示，其储能模量和损耗模量(弹性模量)均随着频率的升高呈上升的趋势，储能模量越高，其弹性越为良好，适用于玻璃体腔的环境；如图3所示，在频率增加的过程中，损耗因子一直保持在较低的数值，进一步说明该玻璃体替代材料具有良好的弹性。

[0082] 3.粘度

[0083] 采用型号为DHR-2的旋转流变仪(美国TA公司生产)，按照检测标准GB/T 33095.1-2016对玻璃体替代材料进行检测，在温度37±0.5℃，湿度50±10％RH的条件下，对样品测定粘度，通过持续剪切频率，获得剪切应力数据。

[0084] 如图2所示，从粘度结果来看，玻璃体替代材料的粘度随着剪切速率的增大而减小，剪切后样品逐渐变稀，属于非牛顿流体中的假塑性流体，这与所述玻璃体替代材料属于高聚物(含有高分子的胶体粒子)的实质相符。

[0085] 临床上使用的低粘度硅油可被认为是牛顿流体，粘稠度较低，注入玻璃体腔后易乳化，形成硅油眼。因此，相较于硅油而言，所述的玻璃体替代材料更适用于PVR治疗过程中的自然玻璃体替代物。

[0086] 4.蠕变性能

[0087] 采用型号为DMA/SDTA861e的动态热机械分析仪(瑞士梅特勒-托利多公司生产)，按照检测标准GB/T 13464-2008对玻璃体替代材料进行检测，在温度-45±0.5℃、25±0.5℃、37±0.5℃，湿度50±10％RH的条件下，将分析仪传感器校准、样品装夹，测定蠕变曲线。

[0088] 蠕变强度是指材料在某一温度下,经过一定时间后，蠕变量不超过一定限度时的最大允许应力。如图4所示，蠕变强度随频率增加而上升。从结果上看，-45℃、25℃和37℃的条件下，玻璃体替代材料的蠕变强度随频率增加而上升。

[0089] 5.微球的载药率

[0090] 称取适量5-氟尿嘧啶微球于5ml容量瓶中，加入1ml乙腈溶解完全，随后加入流动相稀释至待测浓度，取适量溶液于10,000rpm离心10min，收集上清，采用HPLC法测定药物浓度。

[0091] 载药量和包封率的计算公式如下：

[0092] 载药量＝微球中药物质量/微球质量×100％；

[0093] 包封率＝微球中药物质量/投药量×100％。

[0094] 测试结果：5-氟尿嘧啶微球的载药率为10％，粒径大小6.8±0.9um，包封率87％。

[0095] 6.体外药物累积释放度

[0096] 称取适量5-氟尿嘧啶微球分散于10ml PBS中(pH 7.4)，在37℃条件下匀速振摇(100rpm)，分别于1、2、4、6、8、12、24、48h取出200μl释放介质，并补充同体积新鲜释放介质。采用HPLC法测定释放介质中的药物浓度，计算药物累积释放度。结果如图5所示，随着时间的推移，药物累积释放度不断升高，且释放速度逐渐变缓。

[0097] 7.细胞毒性实验(CCK8)

[0098] 取人视网膜色素上皮细胞ARPE-19为实验材料细胞，复苏培养，调整细胞浓度为1×105个/ml，分到96孔板，每孔100μl，即每孔细胞为1×104个。分别提取不同浓度的玻璃体替代材料各10ul到孔内培养基，加入贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测。收集各个时间点的细胞(0h，24h，48h，72h)加入CCK-8溶液(Dojindo CK04)，比例为1/10，即100ul培养液加入10ul检测液。在孵育4小时后，酶标仪读板，CCK-8检测读取OD450数据(酶标仪生产商：Thermo Fisher Scientific型号：multiscan MK3)。

[0099] 如图6所示，处理24h进行CCK8检测，OD450数据3次测量取平均值，发现实验组同对照组未出现显著差异(P<0.05)，观察实验组和对照组中的细胞，均保持了完整的形态结构，未出现衰老、裂解、癌变等。可认为所述的玻璃体替代材料不抑制细胞的增殖和正常的代谢活动。

[0100] 8.折光率、透光度、溶胀度、PH值

[0101] 折光率：采用型号为WYA(2WAJ)的阿贝折光仪(上海仪电物光公司生产)，按照检测标准GB 6488-1986，在温度37±0.5℃，湿度50±10％RH的条件下，对玻璃体替代材料进行检测；

[0102] 透光度：采用型号为WYA(2WAJ)的阿贝折光仪(上海仪电物光公司生产)，按照检测标准GB 6488-1986，在温度37±0.5℃，湿度50±10％RH的条件下，对玻璃体替代材料进行检测；

[0103] 溶胀度：水凝胶样品(50毫克)浸泡在PBS中，在37℃下恒温浴，直到达到平衡。在平衡溶胀下，玻璃体替代材料的水含量由以下公式确定：SW＝(W1-W0)/W0(凝胶在溶剂中溶胀平衡后的质量W1，真空烘箱中干燥后的质量W0)；

[0104] pH值：PHEAST通过使用数字pH探头(Trimo Fisher HealthInc.，Waltham，MA)测量pH计校准结束后，将pH计探头直接插入样品中，使探头被样品完全覆盖，读数；依次测量剩余两个平行样品；连续读取并记录第三个样品的数据三次，求算平均值作为结果。

[0105] 折光率、透光度、溶胀度、PH值与自然玻璃体的各项数值对比如下表所示，从表中可见，所述的玻璃体替代材料的各项数值跟自然玻璃体非常接近。

[0106]样品含水量折光率透光度酸碱性密度
自然玻璃体 98～99％ 1.3345–1.3348 >90％ 7.0～7.4 1.0053～1.0089
玻璃体替代材料 97～2％ 1.45 91％ 7.22 1.0257

[0107] 需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。

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