La présente invention concerne un procédé pour la séparation et l'isolement du nosiheptide qui est un antibiotique; plus particulièrement l'invention a pour objet un procédé de séparation et d'isolement du nosiheptide à partir d'un moût de fermentation en utilisant un solvant particulier.

Le nosiheptide, appelé également 9671 RP, est un antibiotique utile comme adjuvant d'alimentation animale et qui est produit dans le brevet japonais publié sous le numéro 880/1965.

Il est connu de préparer le nosiheptide par culture d'une souche productrice de nosiheptide appartenant au genre Streptomyces; cependant la séparation et l'isolement du nosiheptide du milieu de culture n'a pas, jusqu'à présent, été bien étudiée.

Généralement, la séparation et l'isolement d'un antibiotique à partir d'un milieu de culture sont effectués en mélangeant le milieu de culture avec un solvant et en séparant le mycelium insoluble dans le solvant. Dans ce procédé, la sélection du solvant convenable est très importante. Le solvant doit être tel qu'il assure une bonne séparation entre une portion insoluble dans le solvant ayant le mycélium comme constituant principal et le solvant et qu'il ait une bonne capacité de dissolution de l'antibiotique.

Ce solvant varie selon le mycélium et l'antibiotique qui doit être séparé. Par exemple, d'après le brevet japonais publié sous le numéro 29157/73, il est connu d'utiliser l'acétone, le méthanol ou l'éthanol pour séparer et isoler la multhiomycine d'un moût de fermentation obtenu par culture d'une souche productrice de multhiomycine appartenant au genre Streptomyces.

Par ailleurs, la méthode utilisant le chloroforme ou un mélange de solvants ayant le chloroforme comme constituant principal est connue (brevet japonais publié sous le numéro 26718/70) pour séparer et isoler la thiopeptine B d'un milieu de fermentation obtenu par culture d'une souche productrice de thiopeptine B appartenant au genre Streptomyces. Cependant, la capacité de tels solvants connus de dissoudre le nosiheptide est trop faible pour obtenir un effet suffisant.

Devant cette situation, l'objet de la présente invention est de fournir un procédé efficace de séparation et d'isolement du nosiheptide. L'objectif est atteint en utilisant comme solvant un éther cyclique dans un procédé de séparation et d'isolement du nosiheptide qui consiste à mélanger le milieu de fermentation obtenu par culture d'une souche productrice de nosiheptide appartenant au genre Streptomyces avec un solvant, à séparer une partie insoluble ayant le mycélium comme constituant essentiel et à séparer le nosiheptide du solvant. La description détaillée de l'invention est la suivante :

• Comme souches productrices de nosiheptide sont connues Streptomyces actuosus (NRRL 2954; ATCC 25421), appartenant au genre Streptomyces, et ses mutants.

Le milieu de fermentation contenant le nosiheptide est obtenu en cultivant une telle souche selon le procédé décrit dans le brevet japonais publié sous le numéro 880/1965. Le milieu de - fermentation contient entre autres des hydrates de carbone, des sels minéraux, qui proviennent de la composition du milieu de culture, le mycélium et le nosiheptide. Le nosiheptide s'accumule à la surface du mycélium principalement composé d'actinomycetes ayant une structure de surface compliquée.

Le procédé de la présente invention est caractérisé par le mélange du milieu de culture (moût) avec un éther cyclique désigné ci-après comme "premier solvant de traitement".

Les éthers cycliques comprennent le tétrahydrofuranne, le dioxanne et leurs analogues, le tétrahydrofuranne étant préféré.

Comme milieu de culture convenant pour le traitement par le premier solvant peut être utilisé soit un moût ayant subi un traitement de deshydratation par un moyen mécanique tel que la centrifugation ou la filtration, soit un moût brut n'ayant pas subi de traitement de deshydratation.

Il est difficile d'effectuer le traitement mécanique de deshydratation d'un moût dont la structure de surface est compliquée,alors que l'éther cyclique selon l'invention a un effet solubilisant excellent même si un moût de fermentation ayant une forte teneur en eau est utilisé. Ainsi il est économiquement avantageux d'utiliser un moût brut de fermentation lorsque le traitement par le premier solvant est effectué.

La quantité d'éther cyclique utilisé est différente selon les quantités d'eau et de nosiheptide contenues dans le milieu de culture et elle est généralement choisie entre 0,5 et 5 fois en volumes et de préférence entre 1,5 et 2,5 fois en volumes par rapport au volume du milieu de culture.

Le traitement par le premier solvant est généralement réalisé en utilisant un réservoir agité ayant une trappe dans le fond pour éliminer la matière insoluble. Le temps de traitement est habituellement compris entre 0,5 et 3 heures, de préférence entre 1 et 2 heures, et la température est habituellement comprise entre 5 et 80°C et de préférence entre la température ambiante et 60°C.

Le pH du milieu de culture utilisé dans le traitement varie selon les conditions de la culture. Il est préférable d'ajuster le pH entre 3 et 10 et de préférence entre 5 et 7 au moment du traitement. Cet ajustement du pH empêche le nosiheptide de passer dans la couche aqueuse et permet un meilleur isolement lors de la séparation de la couche aqueuse pour éliminer les impuretés qui sera décrite plus loin.

Après le traitement par le premier solvant, le mélange du milieu de culture et du solvant est abandonné pour former deux phases, une phase insoluble contenant le mycélium comme constituant essentiel et une solution claire dans laquelle est dissous le nosiheptide (cette solution claire contient beaucoup d'eau et sera désignée par la suite "solution du premier traitement"). Les deux phases sont séparées en éliminant les matières insolubles précipitées par l'orifice au fond du réservoir agité.

Un seul traitement décrit ci-dessus est habituellement suffisant puisque l'éther cyclique utilisé dans la présente invention a une grande capacité pour dissoudre le nosiheptide; cependant, les matières insolubles séparées peuvent être à nouveau traitées par l'éther cyclique si nécessaire.

Le nosiheptide, dissous dans la solution du premier traitement, est séparé de sa solution. Avant cette séparation, il est préférable d'ajouter et de mélanger un sel minéral ou de préférence un deuxième solvant miscible dans le solvant du premier traitement, mais légèrement soluble ou insoluble dans l'eau de façon à séparer une couche aqueuse de la solution de premier traitement puis à éliminer cette couche aqueuse.

Les sels minéraux sont choisis parmi le chlorure de magnésium, le chlorure de sodium ou le chlorure de calcium. Le benzène, le toluène, le xylène, l'hexane, l'heptane ou le cyclohexane sont utilisés comme solvants non miscibles dans l'eau. La quantité de second solvant utilisée varie selon la quantité d'eau contenue dans la solution de premier traitement; par exemple la quantité de solvant légèrement miscible dans l'eau représente 0,05 à 0,5 fois en volumes, de préférence 0,25 à 0,35 fois en volumes, le volume de la solution de premier traitement. LorsQue la quantité de solvant est inférieure aux quantités ci-dessus, la quantité totale d'eau contenue dans la solution de premier traitement ne peut pas être séparée et lorsque la quantité de solvant est supérieure, le nosiheptide précipite de sa solution.

Pour que la formation de la couche aqueuse puisse être réalisée dans le réservoir agité, après séparation des matériaux insolubles, le sel minéral ou le solvant non miscible dans l'eau est ajouté et mélangé à la solution de premier traitement dans le réservoir agité à la même température que celle de la solution de premier traitement pendant 1 à 10 minutes.

Les impuretés telles que les hydrates de carbone et les sels minéraux dissous dans le solvant du premier traitement passent en solution dans l'eau et le nosiheptide hautement purifié est séparé directement de la solution du premier traitement.

A ce moment, une faible quantité de nosiheptide est perdue par transfert dans la couche aqueuse; cependant ceci peut être efficacement évité en ajustant le pH du milieu de culture utilisé dans le traitement par le premier solvant aux valeurs indiquées ci-dessus.

La méthode pour séparer le nosiheptide de la solution de premier traitement peut consister soit à distiller le solvant puis à séparer le nosiheptide mécaniquement, soit à précipiter le nosiheptide en ajoutant un composé tiers au solvant de premier traitement après séparation de la couche aqueuse; il est préférable d'utiliser comme composé tiers le même solvant que celui qui est utilisé pour la séparation de la couche aqueuse.

La quantité de solvant (composé tiers) utilisée pour séparer le nosiheptide représente entre 0,2 et 1 fois en volume, de préférence entre 0,4 et 0,6 fois en volumes, le volume de la solution de premier traitement après élimination de l'eau et, lorsque l'eau n'est pas séparée, elle représente entre 0,25 et 1,5 fois en volumes, de préférence entre 0,65 et 0,95 fois en volumes, le volume de la solution de premier traitement.

Le traitement est effectué dans les mêmes conditions que celles utilisées pour la séparation de l'eau, c'est-à-dire en ajoutant le solvant dans le réservoir agité après séparation de l'eau.

L'isolement du nosiheptide précipité dans la solution de premier traitement peut être facilement réalisé au moyen de la centrifugation ou de la filtration.

Le nosiheptide ainsi obtenu peut parfois contenir de faibles quantités de métaux lourds tels que le fer, le cobalt, le nickel, le cuivre ou le manganèse. Il est nécessaire, pour éliminer les métaux lourds, de dissoudre le nosiheptide dans un solvant convenable et de traiter la solution par du charbon désactivé, du gel de silice ou une résine échangeuse d'ions.

La séparation des métaux lourds peut aussi être effectuée à partir de la solution de premier traitement après élimination de l'eau.

La présente invention permet de réaliser la séparation et l'isolement du nosiheptide d'un milieu de culture et d'une façon économique en utilisant un solvant spécifique et elle contribue de manière importante au domaine de la production du nosiheptide.

Le procédé selon la présente invention est illustrée par l'exemple suivant donné à titre non limitation.

Exemple

Un réservoir agité avec une trappe dans le fond est chargé avec 100 parties (en volumes) d'un milieu de culture (moût) obtenu par culture de Streptomyces actuosus, et avec 200 parties (en volumes) de tétrahydrofuranne. Le mélange est effectué par agitation à 60°C pendant 1 heure.

La composition du milieu de culture est la suivante :

On laisse reposer pendant 5 minutes pour précipiter les matières insolubles. Les matières insolubles sont éliminées par la trappe. La quantité de matières insolubles est de 75 parties (en volumes) et celle de la solution du premier traitement (solution dans le tétrahydrofuranne) dans le réservoir est de 225 parties (en volumes).

L'analyse par chromatographie liquide montre que la solution contient 2,11% en poids de nosiheptide.

On ajoute 60 parties (en volumes) d'heptane dans le réservoir, agite pendant 5 minutes, abandonne pendant 10 minutes puis élimine la couche aqueuse inférieure formée par la trappe [la quantité d'eau éliminée est de 60 parties (en volumes), et le solvant de premier traitement qui est conservé représente 225 parties (en volumes)]. Les taux d'élimination des hydrates de carbone et des sels minéraux sont respectivement de 95X et de 99X en poids.

L'analyse de chaque constituant, pour déterminer le taux d'élimination, est effectué de la façon suivante :

• - carbohydrates :

Après addition d'eau, la solution de premier traitement est filtrée pour séparer le nosiheptide précipité et le résidu obtenu après distillation et séchage du filtrat est dissous dans l'eau. Après addition de réactifs colorés, on mesure l'absorption.

• - sels minéraux :

L'analyse par absorption atomique est effectuée en utilisant la solution de premier traitement.

On ajoute à nouveau 100 parties (en volumes) d'heptane à la solution de tétrahydrofuranne après élimination de l'eau, puis on agite pendant 10 minutes. Le contenu du réservoir est alors soumis à une séparation par centrifugation et le nosiheptide est séparé.

La concentration du nosiheptide dans le solvant est à l'état de traces et la pureté du nosiheptide isolé est de 95X en poids d'après l'analyse par chromatographie liquide.

Exemple de référence :

La solubilité du nosiheptide, issu du milieu de culture utilisé dans l'exemple 1, dans différents solvants est déterminée et les résultats sont rassemblés dans le tableau 1.

Le taux de solubilité est déterminé en accord avec les normes japonaises prescrites dans "Ministerial ordinance concerning the specification on the component of feed and feed additive".