技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物细胞原生质体制备技术领域，更具体地，涉及一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法。
背景技术
[0002] 山苍子(Litsea cubeba)是我国南方特有的工业原料和香料树种，其果实提炼的精油中柠檬
醛含量极高，被广泛应用于医药、食品、
化妆品等领域。然而目前与山苍子相关的
基础研究还较为薄弱，这严重制约了山苍子产业的发展。植物细胞原生质体在基础研究和遗传育种工作中扮演着重要的
角色，主要表现在以下几个方面：1、相对于完整的细胞而言，原生质体去除了细胞壁，从而更有利于细胞膜、细胞器和
蛋白质亚细胞
定位的观察；2、原生质体培养是植物无性扩繁的重要途径；3、原生质体是进行植物基因功能研究的重要转基因受体；4、原生质体是进行
体细胞杂交育种的重要起始材料。基于上述原因，细胞原生质体已被广泛应用于植物科学研究的多个领域。然而到目前为止，尚未有能够高效获取山苍子叶肉细胞原生质体的相关内容；另外，相对于成功获得原生质体的植物而言，山苍子
叶片组织中含有大量的次生
代谢物，在进行细胞壁酶解时，破损的叶片组织释放的次生代谢物因长期暴露在空气中而被
氧化，转变成大量毒害原生质体的褐化物，从而易导致山苍子原生质体分离失败；因此，如何采用一种高效经济的方法制备山苍子原生质体是目前所面临的研发难点。
发明内容
[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法，以克服
现有技术中的不足。
[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0005] 一种山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤一、材料选取：获取无菌山苍子叶片；
[0007] 步骤二、叶片酶解：将所述无菌山苍子叶片切成条状碎
块，置于酶解液中，黑暗条件下静置酶解6-12小时，所述条状碎块与所述酶解液的
质量体积比为1-3：30-50，g/ml；所述酶解液中包括
纤维素酶R-10、
离析酶R-10、维生素C、PEG 4000和吐温80；
[0008] 步骤三、原生质体分离：将酶解完成后的酶解液进行过滤，取滤液经离心处理，弃上清液，得原生质体；
[0009] 步骤四、原生质体纯化：在步骤三所得原生质体中加入原生质体洗涤液A，重悬原生质体；随后加入原生质体洗涤液B，离心后，收集液面分界处的原生质体细胞，即得。
[0010] 优选的，步骤一的具体操作为：采集长势良好、无病虫害的山苍子叶片，将采集的叶片用0.1％的升汞溶液灭菌3-5分钟，即得无菌山苍子叶片；或者利用组织培养技术获得无菌的山苍子培苗，以山苍子培苗的幼叶作为无菌山苍子叶片。
[0011] 优选的，步骤二中，所述酶解液含有以下终浓度的各组分：10-20g/l
纤维素酶R-10、10-20g/l离析酶R-10、91-128g/l甘露醇、0.1-0.3g/l
磷酸二氢钠、1-2g/l吗啉乙磺酸、
2-4g/l二
水氯化
钙、0.5-1g/l维生素C、1-5g/lPEG 4000和5-10g/l吐温80，所述酶解液的pH为5.8-6.0。
[0012] 优选的，步骤三的具体操作为：将酶解完成后的酶解液经45微米孔径的不锈
钢滤网过滤至离心管中，以800-1200rpm/min转速，离心3-6分钟，弃上清液，得原生质体。
[0013] 优选的，步骤四中，所述原生质体洗涤液A中含有以下终浓度的各组分：甘露醇110-130g/l，磷酸二氢
钾0.01-0.03g/l，
硝酸钾0.1-0.3g/l，七水
硫酸镁0.1-0.3g/l，碘化钾0.0001-0.0003g/l，五水硫酸
铜0.00001-0.00003g/l，二水
氯化钙1-2g/l；所述原生质体洗涤液A的pH为5.8-6.0。
[0014] 优选的，步骤四中，所述原生质体洗涤液B中含有以下终浓度的各组分：
蔗糖200-300g/l，磷酸二氢钾0.01-0.03g/l，硝酸钾0.1-0.3g/l，七水
硫酸镁0.1-0.3g/l，碘化钾
0.0001-0.0003g/l，五水硫酸铜0.00001-0.00003g/l，二水氯化钙1-2g/l；所述原生质体洗涤液B的pH为5.8-6.0。
[0015] 优选的，步骤四中所述离心具体为800-1200rpm/min转速下离心2-4分钟；所述原生质体洗涤液A和所述原生质体洗涤液B的体积比为(0.5-1)：(2-3)。
[0016] 优选的，所述步骤四之后还包括：
[0017] 步骤五、原生质体的保存：在步骤四所得的原生质体细胞中加入原生质体培养液，重悬，置于6-8℃低温保存。
[0018] 优选的，所述原生质体培养液中含有以下终浓度的各组分：
葡萄糖0.5-1g/l，
氯化钠5-10g/l，二水氯化钙18-22g/l，
氯化钾0.2-0.5g/l，吗啉乙磺酸0.2-0.5g/l；所述原生质体培养液的pH为5.8-6.0。
[0019] 本发明的有益效果为：
[0020] (1)本发明提供了一套能够高效获取山苍子叶肉细胞原生质体的方法，从而为山苍子的基础研究和应用研究提供重要的技术支持，以促进山苍子产业的发展；
[0021] (2)本发明提供的制备方法，在对叶片进行酶解时，可显著缩短酶解所需时间并能有效抑制酶解过程中褐化物的产生，从而高效获取山苍子叶肉细胞原生质体；
[0022] (3)通过本方法获取的山苍子叶肉细胞原生质体形态正常，无破损，每克鲜叶组织可获得(8.69±0.57)×106个原生质体，质量和数量均达到了后续实验的要求。
附图说明
[0023] 图1是本发明
实施例1制备得到的山苍子叶肉细胞原生质体；
[0024] 图2是本发明实施例2制备得到的山苍子叶肉细胞原生质体。
具体实施方式
[0025] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0026] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的
说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0027] 实施例1山苍子叶肉细胞原生质体的制备
[0028] 山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法包括以下步骤：
[0029] 步骤一、材料选取：2019年5月中旬于湖南省汨罗市神鼎山采集长势良好、无病虫害的山苍子成熟叶片，将采集的叶片用0.1％的升汞溶液灭菌3分钟，得无菌山苍子叶片，待用；
[0030] 步骤二、叶片酶解
[0031] 将步骤一所得无菌山苍子叶片用无菌解剖刀将灭菌后的叶片切成宽度为1mm的条状碎块，取0.1g碎块置于3ml酶解液中，黑暗条件下静置酶解6小时；其中酶解液含有以下终浓度的各组分10g/l纤维素酶R-10、10g/l离析酶R-10、91g/l甘露醇、0.1g/l磷酸二氢钠、1g/l吗啉乙磺酸、2g/l二水氯化钙、0.5g/l维生素C、1g/l PEG 4000和5g/l吐温80，酶解液的pH为5.8；
[0032] 其中酶解液的制备过程如下：
[0033] A、配置存储液
[0034] 首先配置存储液，在40ml无菌蒸馏水中依次加入纤维素酶R-10、离析酶R-10、甘露醇、磷酸二氢钠、吗啉乙磺酸和二水氯化钙，充分溶解混匀后定容至50ml，经过滤灭菌后置于4℃保存备用；
[0035] B、配置酶解液
[0036] 取适量存储液，依次加入维生素C(0.5g/l)、PEG 4000(1g/l)和吐温80(5g/l)，充分溶解混匀后调pH值至5.8，经过滤灭菌后，即得酶解液；
[0037] 步骤三、原生质体分离：将步骤二酶解完成后的酶解液用45微米孔径的
不锈钢滤网过滤至15ml离心管中，800rpm/min转速下离心6分钟沉淀原生质体，弃上清液，得原生质体；
[0038] 步骤四、原生质体纯化：在步骤三所得原生质体中加入0.5ml原生质体洗涤液A，重悬原生质体；随后加入2ml原生质体洗涤液B，在800rpm/min转速下离心4分钟，收集液面分界处的原生质体细胞，即可；其中，原生质体洗涤液A含有以下终浓度的各组分：甘露醇110g/l，磷酸二氢钾0.01g/l，硝酸钾0.1g/l，七水硫酸镁0.1g/l，碘化钾0.0001g/l，五水硫酸铜0.00001g/l，二水氯化钙1g/l，原生质体洗涤液A的pH为5.8；原生质体洗涤液B含有以下终浓度的各组分：蔗糖200g/l，磷酸二氢钾0.01g/l，硝酸钾0.1g/l，七水硫酸镁0.1g/l，碘化钾0.0001g/l，五水硫酸铜0.00001g/l，二水氯化钙1g/l，原生质体洗涤液B的pH为5.8。
[0039] 步骤五、原生质体的保存与计数：
[0040] A、保存
[0041] 将步骤四收集的原生质体细胞用1ml原生质体培养液重悬后，置于6-8℃低温保存以用于后续实验，原生质体培养液含有以下终浓度的各组分：葡萄糖0.5g/l，氯化钠5g/l，二水氯化钙18g/l，氯化钾0.2g/l，吗啉乙磺酸0.2g/l，pH为5.8；
[0042] B、计数
[0043] 吸取少量原生质体重悬液滴入血球计数板中，在
显微镜下观察形态并计数。本实施例中，获取的山苍子叶肉细胞原生质体如图1所示，其形态正常，无破损，0.1g新鲜叶片组织的原生质体产量达到了8.99×105个。
[0044] 实施例2山苍子叶肉细胞原生质体的制备
[0045] 山苍子叶肉细胞原生质体的制备方法包括以下步骤：
[0046] 步骤一、材料选取：组培试管苗具有无菌并可全年获取的优点，因此，本实施例以苗高约3cm的山苍子无菌试管苗的幼叶为材料，得无菌山苍子叶片，待用；
[0047] 步骤二、叶片酶解
[0048] 将步骤一所得无菌山苍子叶片用无菌解剖刀将灭菌后的叶片切成宽度为2mm的条状碎块，取0.3g碎块置于5ml酶解液中，黑暗条件下静置酶解12小时；其中酶解液含有以下终浓度的各组分20g/l纤维素酶R-10、20g/l离析酶R-10、128g/l甘露醇、0.3g/l磷酸二氢钠、2g/l吗啉乙磺酸、4g/l二水氯化钙、1g/l维生素C、5g/l PEG 4000和10g/l吐温80，酶解液的pH为6.0；
[0049] 步骤三、原生质体分离：将步骤二酶解完成后的酶解液用45微米孔径的不锈钢滤网过滤至15ml离心管中，1200rpm/min转速下离心3分钟沉淀原生质体，弃上清液，得原生质体；
[0050] 步骤四、原生质体纯化：在步骤三所得原生质体中加入1ml原生质体洗涤液A，重悬原生质体；随后加入3ml原生质体洗涤液B，在1200rpm/min转速下离心2分钟，收集液面分界处的原生质体细胞，即可；其中，原生质体洗涤液A含有以下终浓度的各组分：甘露醇130g/l，磷酸二氢钾0.03g/l，硝酸钾0.3g/l，七水硫酸镁0.3g/l，碘化钾0.0003g/l，五水硫酸铜0.00003g/l，二水氯化钙2g/l，二水氯化钙1g/l，原生质体洗涤液A的pH为6.0；原生质体洗涤液B含有以下终浓度的各组分：蔗糖300g/l，磷酸二氢钾0.03g/l，硝酸钾0.3g/l，七水硫酸镁0.3g/l，碘化钾0.0003g/l，五水硫酸铜0.00003g/l，二水氯化钙2g/l，原生质体洗涤液B的pH为6.0。
[0051] 步骤五、原生质体的保存与计数：
[0052] A、保存
[0053] 将步骤四收集的原生质体细胞用1ml原生质体培养液重悬后，置于6-8℃低温保存以用于后续实验，原生质体培养液含有以下终浓度的各组分：葡萄糖1g/l，氯化钠10g/l，二水氯化钙22g/l，氯化钾0.5g/l，吗啉乙磺酸0.5g/l，pH为6.0；
[0054] B、计数
[0055] 吸取少量原生质体重悬液滴入血球计数板中，在显微镜下观察形态并计数。本实施例中，获取的山苍子叶肉细胞原生质体如图2所示，其形态正常，无破损，0.3g新鲜叶片组织的原生质体产量达到了1.91×106个。
[0056] 实施例3制备山苍子叶肉细胞原生质体时不同酶解液对原生质体分离效果的影响[0057] 1、维生素C、吐温80和PEG 4000不同浓度对山苍子叶肉细胞原生质体分离效果影响
[0058] 调节实施例1步骤二中，维生素C、吐温80和PEG 4000不同浓度组合，制得原生质体细胞在显微镜下观察形态并计数，结果如表1所示。
[0059] 表1不同浓度维生素C、吐温80和PEG 4000对山苍子叶肉细胞原生质体产量的影响[0060]
[0061] 从上表1可知，试验组1至试验组3制备得到的原生质体的数量均明显低于试验组4至试验组8，这表明在常规酶解液中同时添加一定比例的维生素C、PEG 4000和吐温80在酶解过程中起着重要作用。维生素C为抗
氧化剂，可降低空气中的氧对叶片组织中次生代谢物的氧化程度；适量的PEG 4000可使得细胞发生轻度质壁分离，从而减轻细胞壁降解过程对细胞膜的损害，进而减少次生代谢物的释放量；吐温80是一种
表面活性剂，可增大酶解液中的酶分子与细胞壁的
接触几率，从而通过缩短酶解时间来降低次生代谢物的褐化程度，三种
试剂相互结合，共同作用，可显著提高山苍子原生质体的产量；另外，对比试验组4-6和试验组7-8，可以看出维生素C、PEG 4000和吐温80的添加量也较为重要，添加的量过低或者过高均使得原生质体的产量显著降低，控制维生素C、PEG 4000和吐温80适宜的添加量也更有利于后续的实验研究。
[0062] 2、纤维素酶R-10、离析酶R-10浓度、甘露醇浓度和酶解时间对山苍子叶肉细胞原生质体分离效果影响
[0063] 调节实施例1步骤二中，纤维素酶R-10、离析酶R-10浓度、甘露醇浓度和酶解时间，制得原生质体细胞在显微镜下观察形态并计数，结果如表2所示。
[0064] 表2不同酶解条件对山苍子叶肉细胞原生质体产量的影响
[0065]
[0066] 注：K1，K2和K3分别表示某实验条件下原生质体产量的总和。R表示极差，即某因素的K1、K2和K3中的最大值与最小值之差。
[0067] 从上表2可知，离析酶浓度和甘露醇浓度的极差最大，这表明离析酶浓度和甘露醇浓度对原生质体分离效率的影响最显著，其次为酶解时间。通过比较发现，当纤维素酶浓度和离析酶浓度为10g/l，甘露醇浓度为91g/l，酶解时间为6h时，原生质体产量最高，达到了8.99×106个/g·FW。
[0068] 实施例4不同洗涤液浓度对山苍子叶肉细胞原生质体产量的影响
[0069] 调节实施例1步骤四中洗涤液A甘露醇的浓度、洗涤液B蔗糖浓度，制得原生质体细胞在显微镜下观察形态并计数，结果如表3所示。
[0070] 表3洗涤液渗透势对山苍子叶肉细胞原生质体影响
[0071]
[0072] 从上表3可知，蔗糖浓度的极差大于甘露醇，这表明蔗糖浓度对原生质体产量的影响更为显著，随着洗涤液B中蔗糖浓度的增加，原生质体的产量逐渐减少。通过比较发现，当洗涤液A中甘露醇浓度为110g/l，洗涤液B中蔗糖浓度为200g/l时，原生质体的产量最大。
[0073] 综上，本发明通过分析对比，优化了以山苍子叶片为原料制备原生质体的实验条件，提供了一套能够高效获取山苍子叶肉细胞原生质体的方法；通过本方法获取的山苍子叶肉细胞原生质体形态正常，无破损，每克鲜叶组织可获得(8.69±0.57)×106个原生质体，质量和数量均达到了后续实验的要求，为山苍子的基础研究和应用研究提供重要的技术支持，有利于促进山苍子产业的发展。
[0074] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0075] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。
